Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células intestinais epiteliais

Resumo

Utilizou-se uma metodologia baseada em gradiente de centrifugação por densidade modificada para isolar células epiteliais do tecido intestinal de Rhipicephalus microplus . As proteínas ligadas à superfície foram biotiniladas e purificadas através de esferas magnéticas de estreptavidina para utilização em aplicações a jusante.

Resumo

Rhipicephalus microplus - o carrapato do gado - é o ectoparasito mais significativo em termos de impacto econômico sobre o gado como um vetor de vários agentes patogênicos. Os esforços foram dedicados ao controle do carrapato do gado para diminuir seus efeitos deletérios, com foco na descoberta de vacinas candidatas, como o BM86, localizado na superfície das células epiteliais do intestino do carrapato. Pesquisa atual enfoca a utilização de bibliotecas de cDNA e genômicas, para pesquisar outras vacinas candidatas. O isolamento das células intestinais do carrapato constitui uma vantagem importante na investigação da composição das proteínas superficiais sobre a membrana das células intestinais do carrapato. Este artigo constitui um método inovador e viável para o isolamento de células epiteliais, a partir dos índices de intestino de carvão de R. microplus semi-engrossado . Este protocolo utiliza TCEP e EDTA para libertar as células epiteliais dos tecidos de suporte subepitelial e um gradiente de centrifugação de densidade descontínuaNt para separar as células epiteliais de outros tipos de células. As proteínas da superfície celular foram biotiniladas e isoladas das células epiteliais intestinais do carrapato, utilizando grânulos magnéticos ligados à estreptavidina, permitindo aplicações a jusante em FACS ou LC-MS / MS-analysis.

Introdução

Rhipicephalus microplus , o carrapato do gado, é o ectoparasito mais significativo em termos de impacto econômico na indústria pecuária de regiões tropicais e subtropicais, na medida em que eleva a febre do carrapato bovino (babesiose), anaplasmose e piroplasmose equina ^{1 , 2 , 3 , 4} . Os esforços foram dedicados ao controle do carrapato do gado, para diminuir o efeito deletério, no entanto, os métodos convencionais, como o uso de acaricidas químicos, apresentam desvantagens implícitas, como a presença de resíduos químicos no leite e a carne e o aumento da prevalência de carrapatos quimicamente resistentes ^{5 , 6 , 7} . Conseqüentemente, o desenvolvimento de métodos alternativos de controle de tiquetaque foi estudado, como o uso de bovinos de resistência natural, controle biológico (biopesticidas) e vacinaInes ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} .

Na busca de proteínas capazes de serem utilizadas como vacinas candidatas, a pesquisa atual é focada no intestino do carrapato. A parede do intestino médio é construída a partir de uma única camada de células epiteliais descansando sobre uma lâmina basal fina, com a parte externa da lâmina basal formando uma rede de músculo. As observações de luz e microscópio eletrônico indicam que o intestino médio consiste de três tipos de células: reserva (indiferenciada), secreção e digestivo. O número de tipos de células varia consideravelmente dependendo da fase fisiológica. As células secretoras e digestivas originam-se das células de reserva ^{18 , 19 , 20} .

A construção de bibliotecas de cDNAPara examinar a composição do intestino do carrapato levou à identificação de proteínas antigênicas, como o Bm86, como potenciais candidatos à vacina ^{2 , 3 , 4} . A glicoproteína Bm86 está localizada na superfície das células intestinais do carrapato e induz uma resposta imune protetora contra o carrapato do gado ( R. microplus ) no gado vacinado. As IgG anti-Bm86 produzidas pelo hospedeiro imunizado são ingeridas pelo carrapato, reconhecem este antígeno na superfície das células intestinais do carrapato e, posteriormente, perturbam a função e integridade do tecido intestinal. As vacinas baseadas em antígenos Bm86 mostraram controle efetivo de R. microplus e Rhipicephalus annulatus, reduzindo o número, peso e capacidade reprodutiva das fêmeas envolventes, resultando em uma infestação larval reduzida nas gerações subseqüentes do carrapato ⁴ . No entanto, as vacinas baseadas em Bm86 não são eficazes contra todos os estádios de carrapatos e têmDemonstraram eficácia insatisfatória contra algumas cepas geográficas de R. microplus , conseqüentemente as indústrias de carne bovina e láctea adotam mal estas vacinas ^{2 , 4} .

A capacidade de isolar células epiteliais do intestino do carrapato é uma inovação significativa que permitiria a progressão da pesquisa para determinar a composição da membrana protéica, incluindo morfologia e fisiologia sob diferentes condições ambientais. O método aqui descrito utiliza o agente de quelação de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e o agente redutor tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para libertar o epitélio dos seus tecidos de suporte subepitelial ¹⁰ . O epitélio é recuperado após a ruptura mecânica dos tecidos por agitação, seguida de centrifugação descontínua gradiente em Percoll. Este artigo descreve uma técnica viável e inovadora para o isolamento do intestino intestinal epiCélulas celulares. As proteínas de superfície celular biotiniladas, isoladas a partir da superfície destas células epiteliais, podem subsequentemente analisar em aplicações a jusante tais como análise de FACS e / ou LC-MS / MS.

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Protocolo

1. Dissecção do Epitélio Gut de R. microplus

1. Recolher carrapatos semi-engorrosados ​​do gado no dia do experimento. Dissecte os tiques dentro de 24 h após a remoção do hospedeiro.
2. Aderir uma tira de fita adesiva ao fundo da placa de Petri 92 mm x 16 mm. Adicione uma gota de super cola à fita adesiva. Coloque o tiquetaque, lado ventral para baixo sobre a super cola, deixe secar por 2 min.
3. Despeje 100 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) na placa Petri, ou até que o carrapato esteja completamente submerso.
4. Utilizando um bisturi do tamanho 11, corte do topo dos olhos para as festinhas inferiores, em ambos os lados do tiquetaque.
5. Usando fórceps estéril, remova completamente o scutum e alloscutum , para expor os órgãos internos.
6. Remova os órgãos finos de fio branco (traquéia) e outras membranas para evitar a contaminação.
7. Remova o intestino usando fórceps, apertando a região superior e puxando docarcaça. Remova os tecidos de intestino restantes, garantindo que nenhum outro tecido tenha sido dissecado.
8. Armazene o intestino na Solução Salgada equilibrada de Sal Hank (HBSS) com cloreto de cálcio e sulfato de magnésio com coquetel inibidor de proteinase (PIC). Fique congelado nas tripas em gelo seco e armazene a -20 ° C.
   Nota: Para auxiliar na dissecação intestinal e nos detalhes dos órgãos internos do carimbo, consulte o Capítulo 3.1 de D. Sonenshine, "Biologia dos Carrapatos" ¹⁹ .

2. Dissociação de células epiteliais

1. Despeje o intestino dissecado sobre um filtro de células de 70 μm dentro de um tubo de 50 mL.
2. Lave o tecido intestinal com 50 mL de HBSS gelado com PIC até que a solução fique clara e as tripas assumam uma aparência branca / clara.
3. Re-suspende as tripas em 30 mL de HBSS gelado com PIC, misture suavemente e centrifugue a 500 xg a 4 ° C durante 10 minutos para sedimentar o intestino. Remova o sobrenadante e repita o processo de lavagem três vezes.
4. Para desalojar as células intestinais epiteliais, re-suspender o intestino em 10 mL de meio de cultura celular Meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM), 2% de soro de vitelo fetal (FCS), 0,5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1 mM de Tris (2 -carboxietil) fosfina (TCEP), PIC e incubar durante 60 minutos a 37 ° C sob rotação lenta utilizando um rolo a 6 rpm.
5. Filtre a suspensão através de um filtro de célula de 250 μm, vorteie o fluxo e filtre através de um filtro de células de 70 μm coletando o fluxo restante.
6. Centrifugar a suspensão a 500 xg a 4 ° C durante 20 minutos para sedimentar as células individuais.

3. Isolamento de células epiteliais simples usando um gradiente de centrifugação de densidade

1. Prepare gradiente de centrifugação de densidade ( por exemplo , Percoll), filtrando-se através de um papel de pré-filtro AP15. Prepare 40% e um Percoll de 20% em mqH ₂ 0 (v / v) e arrefecer a 4 ° C durante 1 h antes da camada do gradiente.
2. Usando um peristálticoBomba ajustada na velocidade mais baixa, coloque 3 mL de gradiente de centrifugação de densidade de 40% em um tubo de ultracentrífuga de 16 mL, permitindo que ele se assente no gelo durante 15 min. A velocidade da bomba deve levar a uma taxa de fluxo de <1 mL por minuto.
3. Inclinando o tubo para um ângulo de 45 °, use a bomba peristáltica para aplicar o gradiente de centrifugação de densidade de 20% em cima da camada de 40%. A velocidade da bomba deve levar a uma taxa de fluxo de <1 mL por minuto. Permitir que as camadas se apliquem no gelo durante 15 min.
4. Use a bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de <1 mL por min para a camada 3 mL de meio DMEM contendo células intestinais do carrapato sobre o gradiente de centrifugação de densidade de 20-40%.
5. Programe a centrífuga para aceleração máxima e desaceleração mínima. Centrífuga a 600 xg por 10 min. Colete interfases entre o DMEM: gradiente de centrifugação de densidade de 20% e os gradientes de centrifugação de densidade de 20%: 40% para isolar células individuais epiteliais. Armazene as interfases coletadas a 4 ° C para análises subsequentes.

4. Avaliação do isolamento celular

1. Hemicitômetro
   1. Limpe o deslize com hematómetro com álcool.
   2. .Re-suspende as células pipetando suavemente as células para cima e para baixo. Pipetar 100 μL da suspensão celular e colocar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Adicione 400 μL de 0,4% de Trypan Blue. Misture gentilmente acendendo o tubo.
   4. Pipetar 100 μL da suspensão de células tratadas com Trypan Blue para preencher lentamente ambas as câmaras do hemocitómetro.
   5. Coloque o hemocitómetro sob um microscópio de luz, com foco nas linhas de grade do hemocitômetro com um objetivo de 10X.
   6. Usando um contador de contos de mão, conte as células vivas sem coloração dentro de um conjunto de 16 quadrados. Dentro do mesmo quadrado, conte com as células mortas azuis. Continue contando até quatro conjuntos de 16 quadrados são contados.
   7. Calcule as células totais por mL usando a fórmula:
      47eq1.jpg "/>
   8. Calcule a porcentagem de viabilidade celular usando a fórmula:
      
2. Visualização de isolamento celular
   1. Diluir 1 μL das células isoladas em 9 μL de HBSS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Mova suavemente o tubo de microcentrífuga para misturar.
   2. Pipetar 5 μL de células isoladas em HBSS no meio de uma lâmina de vidro. Aplique três gotas de meio de montagem com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI).
   3. Incubar a corrediça à temperatura ambiente durante 5 min. Coloque cuidadosamente uma cobertura sobre a preparação, evitando bolhas de ar.
   4. Visualize células coradas com DAPI à excitação 360 nm e emissão a 460 nm sob um microscópio fluorescente.

5. Biotinilação de proteína de superfície celular

1. Biotinilato 100 μL de células epiteliais de célula única usando conjugação de Biotina (Tipo A)Kit, com uma proporção molar de proteína de superfície 1: 1 para conjugar, de acordo com as instruções do fabricante
2. Para a lise celular, adicione 100 μL de PBS, 1% de Triton X-100, 10% de glicerol, glutationa oxidada 100 μM e PIC nas células biotiniladas. Incubar no gelo durante 1 h com uma mistura suave a cada 10 min.
3. Centrifugar as células biotiniladas a 20 000 xg a 4 ° C durante 20 min para sedimentar material insolúvel. Recolher o sobrenadante contendo proteínas de membrana citoplasmáticas e biotiniladas.
4. Determine a concentração de proteína usando o ensaio de Bradford.

6. Isolamento de proteínas de superfície biotiniladas

1. Adicione 50 μL de grânulos magnéticos de estreptavidina a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Coloque o tubo em um suporte magnético, recolhendo as contas contra o lado do tubo. Remova e descarte o sobrenadante.
3. Adicione 1000 μL de TBS, 0,1% de Tween-20 ao tubo. Misture suavemente e colete as contas com o stan magnéticoD. Remova e descarte o sobrenadante.
4. Combine 40 μg de proteínas de superfície celular biotiniladas, diluídas para 300 μL em 1x PBS com esferas magnéticas lavadas. Incubar durante 2 h à temperatura ambiente com agitação.
5. Colete as contas com um suporte magnético, remova e descarte o sobrenadante.
6. Adicione 300 μL de TBS, 0,1% de Tween-20 ao tubo, misturando suavemente para voltar a suspender as contas. Coletar pérolas, remover e descartar o sobrenadante. Repita este passo de lavagem duas vezes.
7. Adicionar 100 μL da glicina 0,1 M pH 2,0 às esferas magnéticas e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Coletar esferas e remover o sobrenadante contendo proteínas de superfície biotiniladas eluidas.
8. Visualize proteínas de superfície isoladas em um gel SDS-PAGE Tris-MOPS a 4-20%.

7. Avaliação da Proteína de Superfície Biotinilada

1. Dot Blot
   1. Corte uma tira de 7 cm x 3 cm de membrana de nitrocelulose.
   2. Aplicar 10 μg total de carrapato guT (a partir de 1,8 acima) e 10 μg de proteína de superfície biotinilada para a membrana. Permitir a secagem durante 15 minutos à temperatura ambiente.
   3. Transfira para um recipiente e imergir em 100 mL de tampão de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente com agitação durante uma hora. Descarte o buffer de bloqueio.
   4. Lavar a membrana de nitrocelulose em 100 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 durante 5 min com agitação. Descarte o buffer de lavagem e repita as lavagens por três vezes.
   5. Incubar em 1/5000 Streptavidin-peroxidase de rábano (HRP) em 100 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 durante 2 h com agitação à temperatura ambiente e descartar qualquer solução restante.
   6. Lavar a membrana de nitrocelulose em 100 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 durante 5 min com agitação. Descarte o tampão de lavagem e repita a lavagem três vezes.
   7. Para a detecção, dissolver 1 comprimido de 4-cloro-1-naftol em 10 mL de metanol gelado. Adicione 4 mL de estoque de metanol a 20 mL de TBS. Adicione 10 μL de peróxido de hidrogênio 30% fresco e immediaAplicar-se à membrana de nitrocelulose.
   8. Incubar com agitação à temperatura ambiente até o substrato produzir um produto final azul insolúvel. Isso pode demorar entre 2-15 min.
   9. Descarte a solução de detecção e lave a membrana três vezes em 100 μL de mqH ₂ O.
2. Ensaio ELISA
   1. Diluir 200 ng de cada amostra com 400 μL de tampão de revestimento de Carbonato 100 mM e revestir 2 pistas da primeira fila (A #) da placa ELISA (poços de fundo plano)
   2. Adicione 100 μL de tampão de revestimento de carbonato 100 mM a todos os outros poços correspondentes em linhas (BH).
   3. Prepare diluições em série de cada amostra, pipeteando 100 μL de cada poço na linha A, e transfira para a linha B. Misture suavemente por pipetagem e evite produzir bolhas. Repita as diluições por cada linha, descartando os 100 μL finais de cada poço na linha H.
   4. Cubra a placa com parafilme e incube a 4 ° C durante a noite.
   5. Lave a plataformaE com 200 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 por poço três vezes.
   6. Adicione 200 μL de tampão de bloqueio aos poços revestidos, cubra com Parafilm e incube a 4 ° C durante a noite.
   7. Diluir 1 / 15,000 Streptavidina-HRP em tampão de bloqueio e adicionar 100 μL a cada poço da placa. Cubra com parafilme e incube a 4 ° C durante a noite.
   8. Lave a placa em 200 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 por poço cinco vezes.
   9. Para detectar, adicione 100 μL de reagente TMB por poço. Após um desenvolvimento de cor suficiente, geralmente entre 10-15 min, adicione 100 μL de ácido fosfórico 1 M para parar a reação.
   10. Leia a absorvância de cada poço em λ = 450nm.

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Resultados

As células epiteliais foram isoladas dos tecidos intestinais de R. microplus de acordo com o esquema apresentado na Figura 1 . A imagem de microscopia de fluorescência representativa das células epiteliais intestinais do carrapato, preparada usando este protocolo, é mostrada na Figura 2A E 2B. À medida que o isolamento das células é conduzi...

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Discussão

As infestações por carrapatos de gado constituem um grande problema para a indústria do gado em regiões tropicais e subtropicais do mundo, com o método de controle mais comum dependendo do uso de acaricidas ^{1 , 4} . O Bm86 foi previamente identificado dentro da superfície epitelial do intestino do carrapato como um antígeno protetor contra a infestação de R. microplus ¹⁰ , com sucesso limitado como estratégia de vacina d...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan Blue	ThermoFisher Scientific	15250061
1.5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	3322
100mM Carbonate Buffer			3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap	Thermo Scientific	3138-0016	Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA	Sigma	T0440	Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel	Gen Script	M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet	Sigma-Aldrich	C6788
50 mL Falcon Tube	Corning Blue		30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer	BD Falcon	352350
AP15 filter paper	Millipore	AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit	Abcam	Ab102865
Dissection microscope	Olympus	SZX7
DP Manager	Olympus	2.2.1.195	Cell imagery software
Duct Tape	Home Handyman		48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - ice cold for protocol
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
Forceps	Dumont		#9 Dumont - Switerzland
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol for molecular biology >99%
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
Hand-Held Counter	Officeworks	JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer	Optik Lakor	-	-
L-Glutathione oxidized	Sigma-Aldrich	G4376
Magnetic Separation Stand	Novagen	-	4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane	Life Sciences	66485	30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
Peristaltic Pump	Masterflex	7518-10
Phosphoric Acid	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer	Thermo-Scientific	37573	Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x	Biorad	500-0205	For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards	Biorad	500-0207	BSA standards for Bradford Assay
Scalpel	Lab. Co		Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge	Thermo Scientific	46910
Streptavidin (HRP)	Abcam	AB7403
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini	UHU		UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
Vortex Mixer	Ratek	VM1
Water Bath	Grant	GD100