Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması<emRhipicephalus microplus</em&gt; Epitelyal Gut Hücreleri

Özet

Rhipicephalus microplus bağırsak dokusundan epitel hücrelerini izole etmek için modifiye bir yoğunluk santrifüj gradyan tabanlı metodoloji kullanıldı. Yüzeye bağlı proteinler, biyotinlenmiş ve streptavidin manyetik boncuklarla arıtılmış uygulamalarda kullanılmak üzere saflaştırılmıştır.

Özet

Rhipicephalus microplus - sığır kene - birçok patojen vektörü olarak hayvancılık üzerindeki ekonomik etki açısından en önemli ektoparazitedir. Damla bağırsak epitel hücrelerinin yüzeyinde bulunan BM86 gibi aşı adaylarının bulunmasına odaklanarak, zararlı etkilerini azaltmak için sığır kene kontrolüne yönelik çalışmalar yapılmıştır. Mevcut araştırmalar, diğer aşı adaylarını taramak için cDNA ve genomik kütüphanelerin kullanımına odaklanmaktadır. Dişi bağırsak hücrelerinin izolasyonu, kenet hücresi zarı üzerine yüzey proteinlerinin kompozisyonunun araştırılmasında önemli bir avantaj teşkil eder. Bu yazı, yarı-sıkışmış R. microplus'un bağırsak içeriğinden epitel hücrelerinin izolasyonu için yeni ve uygulanabilir bir yöntem teşkil etmektedir . Bu protokol, subepitelyal destek dokularından epitel hücrelerini serbest bırakmak için TCEP ve EDTA'yı ve süreksiz yoğunluk santrifüj gradyanını kullanmaktadırNt, epitel hücrelerini diğer hücre türlerinden ayırır. Hücre yüzey proteinleri biyotinile edildi ve FACS veya LC-MS / MS analizinde aşağı akış uygulamaları için streptavidin bağlantılı manyetik boncuklar kullanarak kene bağırsak epitel hücrelerinden izole edildi.

Giriş

Sığır kenesi Rhipicephalus microplus , sığır kene humması (babesiosis), anaplasmosis ve equine piroplasmosis ^{1 , 2 , 3 , 4'ü} vektörelleştirdiği için tropik ve subtropikal bölgelerdeki sığır endüstrisi üzerindeki ekonomik etki açısından en önemli ektoparazitedir. Zararlı etkiyi azaltmak için sığır kene kontrolüne yönelik çalışmalar yapılmıştır ancak kimyasal akarisitlerin kullanımı gibi geleneksel yöntemlerin süt ve ette kimyasal kalıntıların varlığı ve kimyasal olarak dirençli kenelerin yaygınlığı gibi örtük dezavantajları vardır ^{5 , 6 , 7} . Sonuç olarak, doğal dirençli sığırların kullanımı, biyolojik mücadele (biyoparestisitler) ve aşı gibi alternatif kene kontrol yöntemlerinin geliştirilmesi incelenmiştirInes ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} .

Aşı adayları olarak kullanılabilecek proteinlerin peşinde, mevcut araştırma kene bağırsağına odaklanmaktadır. Orta bacak duvarları, ince bir bazal tabakaya dayanan, tek katlı epitelyal hücrelerden oluşur; bazal laminanın dış kısmı kas ağını oluşturur. Işık ve elektron mikroskopu gözlemleri, orta bağırsağın üç tip hücreden oluştuğunu göstermektedir: rezerv (ayırt edilmemiş), sekresyon ve sindirim. Hücre tiplerinin sayısı, fizyolojik faza bağlı olarak önemli ölçüde değişir. Sekretuar ve sindirim hücreleri, hem rezerv hücreler ^{18 , 19 , 20'den kaynaklanır} .

CDNA kütüphanelerinin inşasıKene bağırsağının bileşimini incelemek potansiyel aşı adayları olan Bm86 gibi antijenik proteinlerin tanımlanmasına yol açtı ^{2 , 3 , 4} . Glikoprotein Bm86, kenarı bağırsak hücrelerinin yüzeyinde lokalizedir ve aşılanmış sığırlarda sığır kenesine ( R. microplus ) karşı koruyucu bir bağışıklık tepkisi oluşturmaktadır. Bağışıklık kazandırılmış konak tarafından üretilen anti-Bm86 IgG'leri kene tarafından alınır, bu antijeni tene bağırsak hücrelerinin yüzeyinde tanır ve sonra da bağırsak dokusunun işlevi ve bütünlüğünü bozmaktadır. Bm86 antijenlere dayanan aşılar sayısı, ağırlık ve daha sonra kene kuşak ⁴ düşük bir larva istila sonuçlanan kadın engorging üreme kapasitesini azaltarak, R. microplus ve Rhipicephalus annulatus etkin biçimde kontrol göstermiştir. Bununla birlikte, Bm86 esaslı aşılar tüm kene aşamalarına karşı etkili değildir veBazı coğrafi R. microplus suşlarına karşı yetersiz etkinlik gösterdiğinden, sığır ve süt endüstrileri bu aşıları ^{2 , 4'ü} kötü şekilde benimsemişlerdir.

Epitel hücrelerini kan bağı bağından ayırma yeteneği, farklı çevre koşullarında morfoloji ve fizyoloji de dahil olmak üzere protein membran kompozisyonunu belirlemek için araştırmanın ilerlemesini sağlayacak önemli bir yeniliktir. Burada tarif edilen metot, alt epitel destek dokularından epitelyumu ¹⁰ serbest bırakmak için kenetleme maddesi etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve indirgeyici ajan tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) kullanmaktadır. Epitel, dokuların mekanik olarak parçalanması sonrasında sallayarak, ardından Percoll'da süreksiz gradyent santrifüjlemeyle toparlanır. Bu makale, kene gut epi'sinin izolasyonu için uygulanabilir ve yeni bir teknik tanımlamaktadırHücre hücreleri. Bu epitelyal hücrelerin yüzeyinden izole edilen biyotinlenmiş hücre yüzeyi proteinleri, daha sonra FACS ve / veya LC-MS / MS analizi gibi aşağı akım uygulamaları ile analiz edilebilir.

Protokol

1. Bağırsak epitelinin R. microplus'tan diseksiyonu

1. Deney günü sığırlardan yarı-sıkıştırılmış kene toplayın. Kene ortasından kaldırıldıktan 24 saat sonra parçalara ayırın.
2. 92 mm x 16 mm Petri kabının tabanına bir şerit bandı yapıştırın. Kasete süper yapışkan bir damla ekleyin. Kene, ventral tarafı süper tutkal üzerine indirin, 2 dakika kurumaya bırakın.
3. Petri kabı içine 100 mL fosfat tamponlu salin (PBS) dökün veya kene tamamen su altına alıncaya kadar.
4. 11 numaralı bir neşter kullanarak, kene her iki yanında da gözlerin üstünden alttaki festo parçalarına kadar kesilir.
5. Steril forseps kullanarak, tamamen iç organları açığa, Kalkan ve alloscutum çıkarın.
6. Kirlenmeyi önlemek için ince beyaz iplik benzeri organları (trakea) ve diğer membranları çıkarın.
7. Bağırsağı, forseps kullanarak, üst bölgeyi sıkarak vekarkas. Kalan tüm bağırsak dokularını çıkarın, böylece başka dokuların parçalanmadığından emin olun.
8. Bağırsak proteinaz inhibitörü kokteyli (PIC) ile kalsiyum klorür ve magnezyum sülfat içermeyen buz soğukluğundaki Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde saklayın. Bağırsakları kuru buzda dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
   Not: Bağırsak diseksiyonu ve iç organların kene detaylarına yardımcı olmak için, D. Sonenshine'in Bölüm 3.1'ine, "Kenların Biyolojisi" na bakın. ¹⁹ .

2. Epitelyal Hücre Ayrışımı

1. 50 ml tüp içinde 70 mikron hücre süzgeçine disseke bağırsak dökün.
2. Çözelti berraklaşıncaya ve bağırsaklar beyaz / berrak bir görünüm alıncaya kadar bağırsak dokusunu PIC ile 50 mL buz soğukluğundaki HBSS ile yıkayın.
3. PIC ile 30 mL buz soğukluğunda HBSS bağırsaklarını yeniden süspanse edin, hafifçe karıştırın ve bağırsaklarını pelet haline getirmek için 10 dakika boyunca 4 ° C'de 500 xg'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.
4. Epitel bağırsak hücrelerini çıkarmak için bağırsağın 10 mL hücre kültürü ortamında Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM),% 2 fetal buzağı serumu (FCS), 0.5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1 mM Tris Karboksietil) fosfin (TCEP), PIC ile karıştırın ve 6 rpm'de bir silindir kullanılarak yavaş döndürme altında 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
5. Süspansiyonu 250 um'lik bir hücre süzgeci ile filtre edin, akış yolu ile girdaplayın ve kalan akış akışını toplayan 70 μm'lik hücre süzgeci ile filtreleyin.
6. Süspansiyonu 500 xg'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyerek tek hücrelerin pelet haline getirin.

3. Bir yoğunluk santrifüj gradyanı kullanarak Tek Epitelyal Hücrelerin İzolasyonu

1. Bir AP15 ön filtre kağıdından süzerek yoğunluk santrifüj gradyanını ( örn . Percoll) hazırlayın. Degrade katmanlamadan önce 1 saat süreyle% 40 ve% 20 Percoll'u mqH ₂ 0 (v / v) içinde hazırlayın ve 4 ° C'de soğutun.
2. Bir peristaltik kullanmaEn düşük hızda ayarlanan pompa, 3 mL'lik% 40 yoğunluklu santrifüj gradyanı, 16 mL'lik ultra santrifüj tüpüne yerleştirilerek 15 dakika boyunca buzda kalmasına izin verilir. Pompanın hızı dakikada bir <1 mL'ye ulaşmalıdır.
3. Tüpü 45 ° 'lik bir açıyla eğinmek için% 40 tabakanın üzerine% 20 yoğunlukta santrifüj gradyanını katmak için peristaltik pompayı kullanın. Pompanın hızı, dakikada 1 mL'den az akış hızına ulaşmalıdır. Katmanların 15 dakika boyunca buzda kalmasına izin verin.
4. % 20-40 yoğunluklu santrifüj gradyanı üzerinde kan bağı hücreleri içeren 3 mL DMEM ortamı katmak için dakikada 1 mL'den daha düşük peristaltik pompa kullanın.
5. Azami hızlanma ve minimum hızlanma için santrifüj programlayın. 10 dakika 600 x g'de santrifüjleyin. Epitel tek hücrelerini izole etmek için DMEM ile interfazları toplayın:% 20 yoğunlukta santrifüj gradyanı ve% 20:% 40 yoğunlukta santrifüj gradyanları. Sonraki analizler için toplanan ara fazları 4 ° C'de saklayın.

4. Hücre İzolasyonunun Değerlendirilmesi

1. hemasitometre
   1. Hematitometre slaydını alkolle temizleyin.
   2. Yavaşça hücreleri yukarıya ve aşağıya pipetleyerek hücreleri erteleyin. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde hücre süspansiyonundan 100 μL pipetleyin.
   3. 0.4% Trypan Blue 400 μL ekleyin. Tüpü hafifçe oynatarak hafifçe karıştırın.
   4. Hemocytometer'in her iki haznesini yavaşça doldurmak için Trypan Blue ile işlenmiş hücre süspansiyonundan 100 μL pipetleyin.
   5. Hemositometreyi, 10X'lik bir hedefle hemositometrenin ızgara çizgilerine odaklanarak, hafif bir mikroskop altında yerleştirin.
   6. Elde taşınan bir çarpıcı sayaç kullanarak, canlı olmayan lekelenmemiş hücreleri 16 kareden oluşan bir kümede sayın. Aynı meydanın içinde mavi ölü hücreleri sayın. 16 kareden oluşan dört set sayılana kadar saymaya devam edin.
   7. Formül kullanarak mL başına toplam hücre sayısını hesaplayın:
      47eq1.jpg "/>
   8. Aşağıdaki formülle hücre yaşayabilirliğini hesaplayın:
      
2. Hücre İzolat Görselleştirme
   1. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 9 μL HBSS'de izole hücrelerin 1 μL'sini seyreltin. Mikro santrifüj tüpünü nazikçe karıştırmak için kullanın.
   2. Bir cam slayt ortasına HBSS izole hücrelerin 5 mcL Pipet. 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile üç damla montaj aracı uygulayın.
   3. Slayt 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Hava kabarcıkları önleyerek preparatın üzerine bir kapak kayışı yerleştirin.
   4. Floresan mikroskop altında 360 nm uyarımda DAPI ile lekelenmiş hücreleri ve 460 nm'de emisyonu görselleştir.

5. Hücre Yüzey Proteini Biyotinilasyonu

1. Biotinat 100 uL tek hücreli epitel hücrelerinin Biotin (Tip A) KonjugasyonuKiti, üreticinin talimatlarına göre 1: 1 yüzey proteininin konjuge edilecek molar bir oranda
2. Hücre lizisi için, biyotinlenmiş hücrelere 100 μL PBS,% 1 Triton X-100,% 10 gliserol, 100 uM oksitlenmiş glutatyon ve PIC ekleyin. 10 dakikada bir hafifçe karıştırarak buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
3. Çözünmeyen maddeyi pelet haline getirmek için 20 dakika boyunca 4 ° C'de 20,000 xg'de biyotinlenmiş hücreleri santrifüjleyin. Sitoplazmik ve biyotinlenmiş zar proteinleri içeren süpernatantı toplayın.
4. Bradford tahlili ile protein konsantrasyonunu belirleyin.

6. Biyotinlenmiş Yüzey Proteinlerin İzolasyonu

1. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne 50 μL Streptavidin Manyetik Boncuk ekleyin.
2. Boruyu manyetik bir standa yerleştirin, boncukları tüpün yanına toplayın. Süpernatanı çıkarın ve atın.
3. Tüpe 1000 μL TBS,% 0.1 Tween-20 ekleyin. Nazikçe karıştırın ve manyetik kütlesi ile boncukları toplayınd. Süpernatanı çıkarın ve atın.
4. Yıkanmış manyetik boncuklar ile 1x PBS'de 300 μL'ye seyreltilmiş 40 μg biyotinlenmiş hücre yüzeyi proteinlerini birleştirin. Çalkalayarak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
5. Boncukları manyetik bir ayakla toplayın, yüzen maddeyi çıkarın ve atın.
6. Boncukları tekrar askıya almak için hafifçe karıştırarak 300 μL TBS,% 0.1 Tween-20 tüp ekleyin. Boncuk toplayın, süpernatanı çıkarın ve atın. Bu yıkama adımı iki kez tekrarlayın.
7. Manyetik boncuklara 0.1 M glisin pH 2.0'dan 100 uL ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Boncuk toplayın ve elüt edilen biyotinlenmiş yüzey proteinleri içeren süpernatantı çıkarın.
8. İzole edilmiş yüzey proteinlerini% 4-20 Tris-MOPS SDS-PAGE jelinde canlandırabilirsiniz.

7. Biyotinlenmiş Yüzey Proteininin Değerlendirilmesi

1. Nokta leke
   1. Nitroselüloz zarın 7 cm x 3 cm şeridini kesin.
   2. 10 μg total tick gu uygulayınT içerikleri (yukarıdaki 1.8'den) ve membrana 10 ug biyotinlenmiş yüzey proteini. Oda sıcaklığında 15 dakika kurumaya bırakın.
   3. Bir kutuya aktarın ve 100 mL bloke edici tampon içine batırın. Bir saat çalkalanarak oda sıcaklığında inkübe edin. Engelleme tamponunu atın.
   4. Çalkalamayla 5 dakika boyunca 100 μL PBS,% 0.05 Tween-20 içinde nitroselüloz zar yıkayın. Yıkama tamponunu atın ve yıkamaları ç kez tekrarlayın.
   5. Oda sıcaklığında ajitasyon ile 2 saat süreyle 100 uL PBS,% 0.05 Tween-20'de 1/5000 Streptavidin-yaban turbu peroksidazı (HRP) içinde inkübe edin ve kalan solüsyonu atın.
   6. Nitroselüloz membranı 100 μL PBS,% 0.05 Tween-20 ile çalkalamayla 5 dakika yıkayın. Yıkama tamponunu atın ve yıkamayı üç kez tekrarlayın.
   7. Tespit için 1 tablet 4-kloro-1-napthol 10 mL buz soğukluğunda metanol içinde çözülür. 20 mL TBS'e 4 mL metanol stok ekleyin. 10 μL taze% 30 hidrojen peroksit ve immedi ekleyinNitroselüloz membrana uygulayınız.
   8. Oda sıcaklığında ajite çözünmeyen bir mavi son ürün üretene kadar çalkalayarak inkübe edin. Bu işlem 2-15 dakika sürebilir.
   9. Tespit solüsyonu atın ve 100 uL MQH ₂ O., membran üç defa yıkamak
2. ELISA Testi
   1. Her bir numunenin 200 ng'si 400 mcL 100 mM Karbonat kaplama tamponu ile inceltin ve ELISA plakasının (düz alt kuyular) birinci sıranın (A #) 2 katını kaplayın.
   2. Sıradaki diğer karşılık gelen oyuklara (BH) 100 mM'lik karbonat kaplama tamponu 100 uL ekleyin.
   3. Her bir numunenin seri seyreltmelerini, A sırasındaki her kuyudan 100 mcL pipetle alınarak ve B sırasına aktararak hazırlayın. Pipetleme ile hafifçe karıştırın ve kabarcıklar üretmekten kaçının. Satır H'deki her bir kuyudaki son 100 mcL'yi atarak, her satıra kadar seyreltmeleri tekrarlayın.
   4. Plakayı parafilm ile örtün ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   5. Tablayı yıkaE başına 200 μL PBS,% 0.05 Tween-20 ile üç kez.
   6. Kaplanmış oyuklara 200 uL engelleyici tampon ekleyin, Parafilm ile kaplayın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   7. 1 / 15,000 Streptavidin-HRP'yi blokaj tamponunda seyreltin ve plakanın her oyuğuna 100 uL ekleyin. Parafilm ile kaplayın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   8. Plakayı, beş kez 200 uL PBS,% 0.05 Tween-20 oranında yıkayın.
   9. Tespit etmek için, göz başına 100 μL TMB reaktif ekleyin. Yeterli renk gelişiminden sonra, genellikle 10-15 dakika arasında, reaksiyonu durdurmak için 100 uL 1 M fosforik asit ekleyin.
   10. Λ = 450 nm'de her kuyunun absorbansını okuyun.

Sonuçlar

Epitelyal hücreler, Şekil 1'de sunulan şematik gibi R. microplus'un bağırsak dokularından izole edildi. Bu protokolü kullanarak hazırlanan kene bağırsak epitel hücrelerinin temsili floresan mikroskopi görüntüleri Şekil 2A'da gösterilmektedir Ve 2B. Hücre izolasyonu, yarı-tıkanmış R. microplus üzerinde yap...

Tartışmalar

Sığır istilası, akarisitlerin ^{1 , 4} kullanımına bağlı en yaygın kontrol yöntemiyle dünyanın tropik ve subtropikal bölgelerinde sığır endüstrisi için büyük bir problem teşkil etmektedir. Bm86, daha önce Bm86 coğrafi dizilim varyasyonu ve düzenli boostlama gereksinimi ⁴ nedeniyle, bir aşı stratejisi olarak sınırlı başarı ile, R. microplus istila ^10'a karşı koruyucu bir an...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan Blue	ThermoFisher Scientific	15250061
1.5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	3322
100mM Carbonate Buffer			3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap	Thermo Scientific	3138-0016	Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA	Sigma	T0440	Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel	Gen Script	M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet	Sigma-Aldrich	C6788
50 mL Falcon Tube	Corning Blue		30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer	BD Falcon	352350
AP15 filter paper	Millipore	AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit	Abcam	Ab102865
Dissection microscope	Olympus	SZX7
DP Manager	Olympus	2.2.1.195	Cell imagery software
Duct Tape	Home Handyman		48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - ice cold for protocol
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
Forceps	Dumont		#9 Dumont - Switerzland
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol for molecular biology >99%
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
Hand-Held Counter	Officeworks	JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer	Optik Lakor	-	-
L-Glutathione oxidized	Sigma-Aldrich	G4376
Magnetic Separation Stand	Novagen	-	4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane	Life Sciences	66485	30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
Peristaltic Pump	Masterflex	7518-10
Phosphoric Acid	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer	Thermo-Scientific	37573	Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x	Biorad	500-0205	For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards	Biorad	500-0207	BSA standards for Bradford Assay
Scalpel	Lab. Co		Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge	Thermo Scientific	46910
Streptavidin (HRP)	Abcam	AB7403
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini	UHU		UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
Vortex Mixer	Ratek	VM1
Water Bath	Grant	GD100