Purificazione delle proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate da<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Cellule epiteliali delle ghiandole

Riepilogo

Una metodologia basata sulla gradiente di centrifugazione a densità modificata è stata utilizzata per isolare le cellule epiteliali del tessuto intestinale di Rhipicephalus microplus . Le proteine ​​legate alle superfici sono state biotinilate e purificate mediante perline magnetiche di streptavidina per l'utilizzo nelle applicazioni a valle.

Abstract

Rhipicephalus microplus - il bestiame bestiame - è l'ectoparasite più significativo in termini di impatto economico sul bestiame come vettore di diversi agenti patogeni. Gli sforzi sono stati dedicati al controllo del bestiame da bere per diminuire i suoi effetti deleteri, con particolare attenzione alla scoperta di candidati vaccinali, come BM86, localizzati sulla superficie delle cellule epiteliali delle ghiandole. La ricerca attuale si concentra sull'utilizzo di cDNA e librerie genomiche, per la ricerca di altri candidati vaccinali. L'isolamento delle cellule gutricole costituisce un importante vantaggio nell'individuare la composizione delle proteine ​​superficiali sulla membrana delle cellule gutiche. Questa carta costituisce un metodo nuovo e fattibile per l'isolamento delle cellule epiteliali, dal contenuto di gocce del polmone R. microplus semiaffuso. Questo protocollo utilizza TCEP e EDTA per rilasciare le cellule epiteliali dai tessuti di supporto subepitheliali e una gradi di centrifugazione a densità discontinuaNt per separare le cellule epiteliali da altri tipi di cellule. Le proteine ​​superficiali delle cellule sono state biotinilate e isolate dalle cellule epiteliali delle ghiandole, usando branelli magnetici legati alla streptavidina, che consentono applicazioni a valle in analisi FACS o LC-MS / MS.

Introduzione

Rhipicephalus microplus , il segno del bestiame, è l'ectoparasite più significativo in termini di impatto economico sull'industria del bestiame delle regioni tropicali e subtropicali in quanto vectors bovine tick-tick (babesiosis), anaplasmosis e piroplasmosis equestre ^{1 , 2 , 3 , 4} . Gli sforzi sono stati dedicati al controllo dei bovini da bestiame, per diminuire l'effetto deleterio, tuttavia i metodi convenzionali come l'uso di acaricidi chimici hanno inconvenienti impliciti, come la presenza di residui chimici nel latte e la carne e l'aumento della prevalenza di zecche chimicamente resistenti ^{5 , 6 , 7} . Di conseguenza, è stato studiato lo sviluppo di metodi alternativi di controllo del bersaglio, come l'uso di bovini di resistenza naturale, il controllo biologico (biopesticidi) e il vaccinoInes ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} .

Nel perseguimento di proteine ​​in grado di essere utilizzate come candidati per il vaccino, la ricerca attuale è incentrata sul guscio del timo. La parete midgut è costruita da un unico strato di cellule epiteliali che poggiano su una sottile lamina basale, con l'esterno della lamina basale che forma una rete muscolare. Le osservazioni del microscopio della luce e dell'elettronica indicano che il midgut è costituito da tre tipi di cellule: riserva (indifferenziata), secrezione e digestione. Il numero di tipi di cellule varia notevolmente a seconda della fase fisiologica. Le cellule di secretory e digestive sono entrambe originate dalle cellule di riserva ^{18 , 19 , 20} .

La costruzione di librerie cDNAPer esaminare la composizione dell'intestino del guscio ha portato all'identificazione di proteine ​​antigeniche, come Bm86, come candidati potenziali per la vaccinazione ^{2 , 3 , 4} . La glicoproteina Bm86 è localizzata sulla superficie delle cellule gutiche del tick e induce una risposta immunitaria protettiva contro il bestiame bovino ( R. microplus ) nei bovini vaccinati. Le IgG anti-Bm86 prodotte dall'host immunizzato vengono ingerite dal ticchettio, riconoscono questo antigene sulla superficie delle cellule intestinali, e quindi disturbano la funzionalità e l'integrità del tessuto intestinale. I vaccini basati sugli antigeni Bm86 hanno mostrato un controllo efficace di R. microplus e Rhipicephalus annulatus, riducendo il numero, il peso e la capacità riproduttiva delle femmine incurvando, con conseguente riduzione delle infestazioni di larvali nelle successive generazioni di ticchetti ⁴ . Tuttavia, i vaccini basati su Bm86 non sono efficaci contro tutte le fasi del tick e hannoHa dimostrato un'efficacia insoddisfacente nei confronti di alcuni ceppi geografici di R. microplus , di conseguenza le industrie bovine e lattiero-caseari hanno adottato male questi vaccini ^{2 , 4} .

La capacità di isolare le cellule epiteliali dall'intestino è una innovazione significativa che consentirebbe la progressione della ricerca a determinare la composizione della membrana proteica, compresa la morfologia e la fisiologia in condizioni ambientali differenti. Il metodo qui descritto utilizza l'agente chelante acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) e l'agente riducente tris (2-carbossiletil) fosfina (TCEP) per rilasciare l'epitelio dai suoi tessuti di supporto sub-epiteliali ¹⁰ . L'epitelio viene recuperato a seguito di scosse meccaniche dei tessuti agitando, seguita da centrifugazione a gradiente discontinua in Percoll. Questo articolo descrive una tecnica fattibile e novella per l'isolamento di epi di zuccheroCellule teliali. Le proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate, isolate dalla superficie di queste cellule epiteliali, possono successivamente essere analizzate in applicazioni a valle come FACS e / o analisi LC-MS / MS.

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Protocollo

1. Dissezione dell'epitelio di Gut da R. microplus

1. Raccogli le zecche semi-inguine dal bestiame nel giorno dell'esperimento. Disseccare le zecche entro 24 ore dopo la rimozione dall'ospite.
2. Aderire una striscia di nastro adesivo alla parte inferiore del piatto di Petri da 92 mm x 16 mm. Aggiungere una goccia di colla super al nastro. Posizionare il ticchettio, lato ventrale verso il basso sulla colla super, lasciare asciugare per 2 minuti.
3. Versare 100 ml di soluzione salina fosfata (PBS) nel piatto di Petri, o fino a quando la zecca è completamente sommersa.
4. Utilizzando uno scalpello di taglia 11, tagliato dalla parte superiore degli occhi ai festoni inferiori, su entrambi i lati del ticchettio.
5. Utilizzando pinze sterili, rimuovere completamente i scutum e alloscutum, per esporre gli organi interni.
6. Rimuovere gli organi filettati bianchi fine (trachea) e altre membrane per impedire la contaminazione.
7. Rimuovere l'intestino con le pinze, pizzicando la regione superiore e tirandola dallacarcassa. Rimuovere eventuali tessuti intestinali rimanenti, assicurando che nessun altro tessuto venga disciolto.
8. Conservare l'intestino in soluzione salina equilibrata di Hank (HBSS) ghiacciata senza cloruro di calcio e solfato di magnesio con il cocktail inibitore della proteina (PIC). Snap congelare il budello in ghiaccio secco e conservare a -20 ° C.
   Nota: per assistere con la dissezione delle intestine e dettagli sugli organi interni del ticco, fare riferimento al capitolo 3.1 di D. Sonenshine, "Biologia delle zecche" ¹⁹ .

2. Dissociazione delle cellule epiteliali

1. Versare l'intestino sezionato su un filtro cellulare da 70 μm all'interno di un tubo da 50 ml.
2. Lavare il tessuto intestinale con 50 ml di ghiaccio freddo HBSS con PIC fino a quando la soluzione scorre chiara e il budello assume un aspetto bianco / chiaro.
3. Riassemblare il budello in 30 mL di ghiaccio freddo HBSS con PIC, mescolare delicatamente e centrifugare a 500 xg a 4 ° C per 10 minuti per far pelliccare l'intestino. Rimuovere il surnatante e ripetere il processo di lavaggio tre volte.
4. Per dispiegare le cellule dell'intestino epiteliale, riposizionare l'intestino in 10 ml di terreno di coltura cellulare Dulbecco's medium modificato (DMEM), 2% di siero fetale (FCS), 0,5 mM di etilendiammina tetraacetico (EDTA), 1 mM Tris (TCEP), PIC e incubare per 60 minuti a 37 ° C in rotazione lenta utilizzando un rullo a 6 giri / min.
5. Filtrare la sospensione attraverso un filtro di cellule da 250 μm, vortexare il flusso e filtrare attraverso un filtro di cellule da 70 μm raccogliendo il restante flusso.
6. Centrifugare la sospensione a 500 xg a 4 ° C per 20 minuti per far pelliccare le singole cellule.

3. Isolamento di singole cellule epiteliali utilizzando un gradiente di centrifugazione di densità

1. Preparare il gradiente di centrifugazione di densità ( ad esempio Percoll) filtrando attraverso una carta AP15 prefiltrata. Preparare il 40% e un 20% di Percoll in mqH ₂ 0 (v / v) e raffreddare a 4 ° C per 1 ora prima di stratificare il gradiente.
2. Utilizzando un peristalticoLa pompa è impostata alla velocità più bassa, con 3 ml di gradiente di centrifugazione di densità del 40% in un tubo di ultracentrifuga da 16 ml, lasciandolo saldare a ghiaccio per 15 minuti. La velocità della pompa deve portare ad una velocità di flusso di <1 mL per min.
3. Inclinando il tubo ad un angolo di 45 °, utilizzare la pompa peristaltica per aumentare il gradiente di centrifugazione di densità del 20% sulla parte superiore del livello del 40%. La velocità della pompa deve portare a <1 mL per min. Lasciare che i livelli si stabiliscano in ghiaccio per 15 minuti.
4. Utilizzare la pompa peristaltica a una velocità di flusso minima di 1 mL per 3 ml di substrato DMEM contenente le cellule gutriche sopra il gradiente di centrifugazione di densità del 20-40%.
5. Programmare la centrifuga per l'accelerazione massima e la decelerazione minima. Centrifugare a 600 xg per 10 min. Raccogli le interfacce tra il gradiente di centrifugazione DMEM: 20% di densità e le gradienti di centrifugazione di densità del 20%: 40% per isolare singole cellule epiteliali. Conservare le interfase raccolte a 4 ° C per le successive analisi.

4. Valutazione dell'isolamento cellulare

1. emocitometro
   1. Pulire la diapositiva di hemacytometer con alcool.
   2. Sospendere le cellule pipettando delicatamente le cellule su e giù. Pipettare 100 μL della sospensione cellulare e collocare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
   3. Aggiungere 400 μl di 0.4% Trypan Blue. Mescolare delicatamente spostando il tubo.
   4. Pipettare 100 μL della sospensione cellulare della Trypan blu per riempire lentamente entrambe le camere dell'emocitometro.
   5. Posizionare l'emocitometro sotto un microscopio leggero, concentrandosi sulle linee di griglia dell'emocitometro con un obiettivo di 10x.
   6. Utilizzando un contatore di contatti tenuto in mano, conteggi le cellule non sporche dal vivo all'interno di un insieme di 16 quadrati. All'interno della stessa piazza, contano le cellule morte blu. Continuare a contare finché non si contano quattro set di 16 quadrati.
   7. Calcolare le cellule totali per ml utilizzando la formula:
      47eq1.jpg "/>
   8. Calcola la vitalità cellulare percentuale utilizzando la formula:
      
2. Visualizzazione delle isole della cellula
   1. Diluire 1 μL delle cellule isolate in 9 μL di HBSS in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Spostare delicatamente il tubo di microcentrifuga per mescolare.
   2. Pipettare 5 μL di cellule isolate in HBSS nel mezzo di una vetrata. Applicare tre gocce di supporto di montaggio con 4 ', 6-diammino-2-fenilindolo (DAPI).
   3. Incubare la diapositiva a temperatura ambiente per 5 min. Posizionare con cura un coperchio di copertura sulla preparazione evitando le bolle d'aria.
   4. Visualizzare le cellule colorate con DAPI all'eccitazione a 360 nm e emettere a 460 nm sotto un microscopio fluorescente.

5. Biotinilazione della proteina della superficie cellulare

1. Biotinilate 100 μL di cellule epiteliali a cellule singole usando la coniugazione di Biotina (tipo A)Kit, a un rapporto molare di proteine ​​superficiali da 1: 1 a coniugare, secondo le istruzioni del produttore
2. Per la lisi delle cellule aggiungere 100 μL di PBS, 1% Triton X-100, 10% glicerolo, 100 μM glutatione ossidato e PIC alle cellule biotinilate. Incubare su ghiaccio per 1 h con mescolanza dolce ogni 10 min.
3. Centrifugare le cellule biotinilate a 20.000 xg a 4 ° C per 20 minuti per far pelliccare il materiale insolubile. Raccogliere il surnatante contenente proteine ​​citoplasmatiche e biotinilate.
4. Determinare la concentrazione proteica usando il saggio di Bradford.

6. Isolamento delle proteine ​​superficiali biotinilate

1. Aggiungere 50 μL di perline magnetiche di Streptavidin in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
2. Mettere il tubo in un supporto magnetico, raccogliendo le perle contro il lato del tubo. Rimuovere e scartare il surnatante.
3. Aggiungere 1000 μL di TBS, 0,1% Tween-20 al tubo. Mescolare delicatamente e raccogliere le perle con l'appartamento magneticod. Rimuovere e scartare il surnatante.
4. Combinare 40 μg di proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate, diluite a 300 μL in 1x PBS con perline magnetiche lavate. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente con agitazione.
5. Raccogliere le perle con un supporto magnetico, rimuovere e scartare il surnatante.
6. Aggiungere 300 μl di TBS, 0.1% Tween-20 al tubo, mescolando delicatamente per ri-sospendere le perle. Raccogli le perline, rimuove e scarta il supernatante. Ripetere due volte questo passaggio di lavaggio.
7. Aggiungere 100 μL di 0,1 M glicina pH 2,0 alle perline magnetiche e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Raccogliere le perle e rimuovere il surnatante contenente proteine ​​superficiali biotinilate eluate.
8. Visualizzare proteine ​​superficiali isolate su un gel di Tris-MOPS SDS-PAGE 4-20%.

7. Valutazione della proteina superficiale biotinilata

1. Dot Blot
   1. Tagliare una striscia di nitrocellulosa da 7 cm x 3 cm.
   2. Applicare 10 μg di zucchero totaleT (da 1.8 sopra) e 10 μg di proteine ​​superficiali biotinilate alla membrana. Lasciare asciugare per 15 minuti a temperatura ambiente.
   3. Trasferire in un contenitore e immergerlo in 100 mL di tampone di blocco. Incubare a temperatura ambiente con agitazione per un'ora. Eliminare il buffer di blocco.
   4. Lavare la membrana di nitrocellulosa in 100 μl di PBS, 0,05% di Tween-20 per 5 minuti con agitazione. Scartare il tampone di lavaggio e ripetere le lavaggi per tre volte.
   5. Incubare in 1/5000 Streptavidin-perossidasi di rafano (HRP) in 100 μl di PBS, 0,05% di Tween-20 per 2 ore con agitazione a temperatura ambiente e scartare ogni residua soluzione.
   6. Lavare la membrana di nitrocellulosa in 100 μl di PBS, 0,05% Tween-20 per 5 minuti con agitazione. Scartare il tampone di lavaggio e ripetere il lavaggio tre volte.
   7. Per il rilevamento, sciogliere 1 compressa di 4-cloro-1-naftolo in 10 ml di metanolo a ghiaccio freddo. Aggiungere 4 ml di materiale di metanolo a 20 ml di TBS. Aggiungere 10 μl di fresco perossido di idrogeno al 30% e immediatamenteSi applicano alla membrana di nitrocellulosa.
   8. Incubare con agitazione a temperatura ambiente finché il substrato non produce un prodotto finale blu insolubile. Questo può richiedere tra 2-15 min.
   9. Eliminare la soluzione di rilevazione e lavare la membrana tre volte in 100 μL mqH ₂ O.
2. ELISA Assay
   1. Diluire 200 ng di ciascun campione con 400 μL di tampone di rivestimento in carbonato da 100 mM e coprire 2 corsie della prima fila (A #) della piastra ELISA (pozzetti piani)
   2. Aggiungere 100 μL di buffer di rivestimento carbonato da 100 mM a tutti gli altri pozzetti corrispondenti in righe (BH).
   3. Preparare le diluizioni seriali di ciascun campione pipettando 100 μl da ogni pozzetto nella riga A e trasferendolo nella riga B. Mescolare delicatamente pipettando ed evitare di produrre bolle. Ripetere le diluizioni in giù per ogni riga, scartando le ultime 100 μL da ogni pozzetto nella riga H.
   4. Coprire la lastra con il parafilm e incubare a 4 ° C per una notte.
   5. Lavare la piastraE con 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 per pozzetto tre volte.
   6. Aggiungere 200 μl di tampone di bloccaggio ai pozzetti ricoperti, coprire con Parafilm e incubare a 4 ° C per una notte.
   7. Diluire 1 / 15.000 Streptavidin-HRP nel buffer di blocco e aggiungere 100 μL ad ogni pozzetto della piastra. Coprire con il parafilm e incubare a 4 ° C per una notte.
   8. Lavare la piastra in 200 μl di PBS, 0,05% Tween-20 per pozzetto cinque volte.
   9. Per rilevare, aggiungere 100 μL di reagente TMB per pozzetto. Dopo un sufficiente sviluppo di colore, di solito fra 10-15 min, aggiungere 100 μL di acido fosforico da 1 M per fermare la reazione.
   10. Leggere l'assorbanza di ogni pozzetto a λ = 450nm.

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Risultati

Le cellule epiteliali sono state isolate dai tessuti intestinali di R. microplus secondo lo schema presentato in Figura 1 . Le rappresentazioni rappresentative di microscopia a fluorescenza delle cellule epiteliali delle ghiandole del guscio preparate usando questo protocollo sono mostrate nella Figura 2A E 2B. Poiché l'isolamento delle cellu...

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Discussione

Le infestazioni di zootecnia costituiscono un grave problema per l'industria del bestiame nelle regioni tropicali e subtropicali del mondo, con il metodo più comune di controllo dipendente dall'uso degli acaricidi ^{1 , 4} . Bm86 è stato precedentemente individuato all'interno della superficie epiteliale della ghiera di zecca come antigene protettivo contro l'infestazione di R. microplus ¹⁰ , con un successo limita...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan Blue	ThermoFisher Scientific	15250061
1.5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	3322
100mM Carbonate Buffer			3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap	Thermo Scientific	3138-0016	Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA	Sigma	T0440	Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel	Gen Script	M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet	Sigma-Aldrich	C6788
50 mL Falcon Tube	Corning Blue		30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer	BD Falcon	352350
AP15 filter paper	Millipore	AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit	Abcam	Ab102865
Dissection microscope	Olympus	SZX7
DP Manager	Olympus	2.2.1.195	Cell imagery software
Duct Tape	Home Handyman		48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - ice cold for protocol
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
Forceps	Dumont		#9 Dumont - Switerzland
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol for molecular biology >99%
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
Hand-Held Counter	Officeworks	JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer	Optik Lakor	-	-
L-Glutathione oxidized	Sigma-Aldrich	G4376
Magnetic Separation Stand	Novagen	-	4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane	Life Sciences	66485	30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
Peristaltic Pump	Masterflex	7518-10
Phosphoric Acid	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer	Thermo-Scientific	37573	Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x	Biorad	500-0205	For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards	Biorad	500-0207	BSA standards for Bradford Assay
Scalpel	Lab. Co		Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge	Thermo Scientific	46910
Streptavidin (HRP)	Abcam	AB7403
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini	UHU		UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
Vortex Mixer	Ratek	VM1
Water Bath	Grant	GD100