Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células epiteliales intestinales

Resumen

Se utilizó una metodología basada en gradiente de densidad de densidad modificada para aislar células epiteliales del tejido intestinal de Rhipicephalus microplus . Las proteínas unidas a la superficie se biotinilaron y se purificaron a través de perlas magnéticas de estreptavidina para su utilización en aplicaciones aguas abajo.

Resumen

Rhipicephalus microplus es el ectoparásito más significativo en términos de impacto económico en el ganado como vector de varios patógenos. Se han dedicado esfuerzos al control de garrapatas para disminuir sus efectos deletéreos, centrándose en el descubrimiento de vacunas candidatas, como la BM86, localizada en la superficie de las células epiteliales de la garrapata. La investigación actual se centra en la utilización de cDNA y bibliotecas genómicas, para seleccionar otras vacunas candidatas. El aislamiento de las células intestinales de garrapatas constituye una ventaja importante en la investigación de la composición de las proteínas de superficie sobre la membrana de las células del intestino de garrapatas. Este trabajo constituye un método novedoso y factible para el aislamiento de células epiteliales, a partir de los contenidos de intestino de garrapata de R. microplus. Este protocolo utiliza TCEP y EDTA para liberar las células epiteliales de los tejidos de soporte subepiteliales y un gradiente de densidad discontinua gradieNt para separar las células epiteliales de otros tipos de células. Las proteínas de la superficie celular fueron biotiniladas y aisladas de las células epiteliales de la tripa de la garrapata, usando perlas magnéticas unidas a estreptavidina permitiendo aplicaciones posteriores en análisis FACS o LC-MS / MS.

Introducción

Rhipicephalus microplus es la ectoparásita más significativa en términos de impacto económico en la industria ganadera de las regiones tropicales y subtropicales, ya que vectores de la fiebre de la garrapata bovina (babesiosis), la anaplasmosis y la piroplasmosis equina ^{1 , 2 , 3 , 4} . Sin embargo, los métodos convencionales como el uso de acaricidas químicos tienen inconvenientes implícitos, como la presencia de residuos químicos en la leche y la carne, y el aumento de la prevalencia de garrapatas químicamente resistentes

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Disección del epitelio intestinal de R. microplus

1. Recoger las garrapatas semi-engorged de ganado en el día del experimento. Diseccionar las garrapatas dentro de las 24 h después de la remoción del huésped.
2. Adhiera una tira de cinta adhesiva al fondo de la placa de Petri de 92 mm x 16 mm. Añadir una gota de super pegamento a la cinta. Coloque la garrapata, lado ventral hacia abajo sobre el super pegamento, deje que se seque durante 2 min.
3. Verter 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en la placa de Petri, o hasta que la garrapata esté completamente sumergida.
4. Utilizando un bisturí de tam....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Se aislaron células epiteliales de los tejidos intestinales de R. microplus según el esquema presentado en la Figura 1 . Las imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de las células epiteliales de la tripa de la garrapata preparadas usando este protocolo se muestran en la Figura 2A Y 2B. Como el aislamiento celular se realiza s.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Las infestaciones de garrapatas de ganado constituyen un problema importante para la industria ganadera en las regiones tropicales y subtropicales del mundo, con el método de control más común dependiente del uso de acaricidas ^{1 , 4} . Bm86 fue identificado previamente dentro de la superficie epitelial del intestino de garrapata como un antígeno protector contra la infestación ^de R. microplus ¹⁰ , con .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan Blue	ThermoFisher Scientific	15250061
1.5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	3322
100mM Carbonate Buffer			3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap	Thermo Scientific	3138-0016	Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA	Sigma	T0440	Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel	Gen Script	M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet	Sigma-Aldrich	C6788
50 mL Falcon Tube	Corning Blue		30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer	BD Falcon	352350
AP15 filter paper	Millipore	AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit	Abcam	Ab102865
Dissection microscope	Olympus	SZX7
DP Manager	Olympus	2.2.1.195	Cell imagery software
Duct Tape	Home Handyman		48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - ice cold for protocol
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
Forceps	Dumont		#9 Dumont - Switerzland
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol for molecular biology >99%
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
Hand-Held Counter	Officeworks	JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer	Optik Lakor	-	-
L-Glutathione oxidized	Sigma-Aldrich	G4376
Magnetic Separation Stand	Novagen	-	4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane	Life Sciences	66485	30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
Peristaltic Pump	Masterflex	7518-10
Phosphoric Acid	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer	Thermo-Scientific	37573	Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x	Biorad	500-0205	For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards	Biorad	500-0207	BSA standards for Bradford Assay
Scalpel	Lab. Co		Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge	Thermo Scientific	46910
Streptavidin (HRP)	Abcam	AB7403
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini	UHU		UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
Vortex Mixer	Ratek	VM1
Water Bath	Grant	GD100