使用渗透泵或直接肌肉注射的皮下神经营养因子4输液增强老化大鼠喉肌肉

摘要

在这里，我们提出一个协议来描述神经营养因子4（NTF4）的系统和直接用于改造大鼠老化的喉部肌肉。

摘要

老年人的喉功能障碍是残疾的主要原因，从语音障碍到吞咽困难和气道保护性反射丧失。存在少量针对年龄相关性喉部肌肉功能障碍的治疗方法。神经营养因子参与神经肌肉接头（NMJ）的肌肉神经支配和分化。据认为神经营养蛋白通过增加神经递质释放来增强神经肌肉传递。神经肌肉接头（NMJ）在衰老的大鼠喉部肌肉中变得越来越小，具有功能去神经支配的证据。我们探讨了NTF4对未来临床应用的作用，作为改善老年人类喉部肌肉功能的治疗剂。在这里，我们提供了系统应用和直接注射NTF4的详细方案，以调查老化大鼠喉肌肉响应NTF4应用重建的能力。在这种方法中，大鼠通过 o系统地接受NTF4雾状泵或直接注射通过声带。然后解剖喉部肌肉，用于组织学检查形态学和年龄相关的去神经支配。

引言

喉部肌肉迅速，一致地收缩，容易受到衰老的不利影响。这种不断的活动被认为有助于在65岁以上的人，1,2,3,4,5,6,7人群中观察到的语音问题或吞咽困难。几种分子和病理生理机制有助于这种年龄相关的功能障碍。这些机制可能包括喉粘膜的重塑，肌肉纤维的萎缩或丧失，缺乏肌纤维再生或萎缩，导致声带弯曲和声门关闭不能8,9,10,11。目前还没有经过证实的药物治疗彻底预防或恢复这些年龄相关的这些肌肉变化。

调节神经肌肉传播的有效性可以极大地影响神经运动的表现。神经营养蛋白家族包括神经生长因子（NGF），脑源性神经生长因子（BDNF），神经营养因子3（NTF3）和NTF4 ^12,13 。神经营养因子已经显示出调节突触功效^1,4 。肝细胞生长因子，转化生长因子β和成纤维细胞生长因子最近已被用于人类治疗声带皱纹瘢痕^15-17 。 NTF4也调节NMJ的有效性;缺乏NTF4的小鼠显示了拆卸的NMJ 11,18,19。这些研究导致治疗有希望的效果t老化喉部肌肉疾病和去神经与生长因子。

对人体组织的直接注射治疗不是人类前所未有的。例如，局部注射肉毒杆菌毒素目前用作影响喉部肌肉的神经运动障碍的有效治疗方法，如痉挛性发音障碍和双侧复发性喉神经麻痹^20,21 。透明质酸水凝胶是另一种可注射的，用于治疗声带褶皱和声门功能不全^22,23 。注射喉成形术可用于治疗各种通气障碍²⁴ 。这些直接注射方法有望改善老年人群的声音功能和吞咽。

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研究方案

对于这个方案，在6和30个月龄时使用雄性Fischer 344-Brown Norway大鼠。大鼠从国家老龄鼠老鼠研究所获得。我们使用老鼠进行这项研究，因为大鼠喉的结构类似于人类的结构，功能上用于气道保护和物种特异性发声本研究是按照PHS对人类关心和使用实验动物的政策进行的， NIH"实验动物护理和使用指南"和"动物福利法"（7 USC等）;动物使用协议由肯塔基大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

大麻麻醉

1. 通过将盐酸氯胺酮（解离麻醉剂）和盐酸赛拉嗪（镇静和镇痛）混合在缓冲盐水中来制备麻醉药。最终溶液中氯胺酮和赛拉嗪的浓度为100mg / 8mg / kg体重分别为
2. 通过使用25 G针的注射器通过腹膜内给药将麻醉剂注入大鼠。
3. 通过用镊子夹住脚趾或脚来确定大鼠是否充分麻醉。如果大鼠对痉挛没有反应，那么手术就可以开始了。如果大鼠对反射或肌肉收缩的脚趾反应，则等待1-2分钟，然后重复捏捏测试。如果大鼠再次反应，用新动物代替大鼠，并从步骤1.2开始重复操作。
4. 在大鼠不动之后，向大鼠的眼睛涂抹眼科软膏，以防止角膜变干。

渗透泵植入

1. 将大鼠腹侧置于无菌手术区域。管理美洛昔康作为美容前药。使用25 G针的注射器以1-4mg / kg体重腹膜内给药。
2. 使用剪刀去除一个近似值脖子后面有1"x 1"平方英尺的毛皮，肩膀之间的距离大约为1英尺，剃须尽可能靠近皮肤。
3. 用乙醇消毒（70％）将背部和颈部润湿。
4. 剃须后，用3次擦洗擦洗颈部背部碘酒精酒精。
5. 通过将其放置在设置在34℃的加热垫上来保持大鼠的体温。
6. 用无菌制备的渗透泵用50μL的NTF4或盐水进行全身NTF4处理（ 图1 ）。
   1. 使用手术刀做一个大约2厘米宽的水平切口，通过皮肤，只是颅骨到肩胛骨之间的空间。用镊子用镊子提起切口的后边缘，同时插入止血钳的尖端，轻轻地推到切口的后方。
   2. 止血垫的尖端约为2厘米c在切口处行走，打开止血钳上的手柄，将尖端扩张，在切口部位皮下形成一个空心的"口袋"。这将是泵的安置点。
7. 在插入后首先定位泵输送入口端，以最小化NTF4与口腔切口部位愈合的任何相互作用。
8. 送出50μL的NTF4盐水7天14天。 7天组的NTF4达到6.72mg /天，总剂量为47.04mg。 14天组每天接受6.72mg /天的总剂量为94.08mg的NTF425。
9. 使用5-0尼龙缝合线，止血钳和镊子关闭用于泵放置的切口。
10. 从麻醉中恢复至少30分钟观察大鼠。完成监测的标准包括动物变得活跃，围绕笼子，饮水，开始其他正常的活动，如梳理。
11. 每天监视动物通过观察手术部位的愈合，正常饲料和耗水量以及尿/粪便的通过以及压力，疼痛或其他手术后并发症的任何异常行为迹象，第一周。
12. 如果大鼠似乎处于疼痛或痛苦状态，则每24小时给予大鼠5mg / kg皮下注射卡洛芬，持续5天以缓解疼痛。
13. 如果出现感染，请咨询兽医，以确保伤口愈合良好。
14. 根据大鼠在哪个实验组中，手术后7-10天取出5-0尼龙缝线，以防止线刺激。

3.直接注射大鼠麻醉

1. 在手术前一天晚上从老鼠身上取食食物。这确保没有食物阻塞内窥镜或注射针。
2. 称重大鼠，并制备1-2mg / kg乙酰丙嗪的体重。肌内注射（IM位置是左侧甲状腺肌肉）。
3. 将大鼠放在感应盒中。在感应箱中诱导5％异氟烷和1 LO _2的麻醉。
4. 将大鼠移至2％异氟烷和600 mL O ₂的鼻锥。
5. 通过用镊子夹住脚趾或脚来确定大鼠是否充分麻醉。如果大鼠对痉挛没有反应，则注射方案可以开始。如果大鼠对反射或肌肉收缩的脚趾反应，则等待1-2分钟，然后重复捏捏测试。如果大鼠再次反应，用新动物代替大鼠，并从步骤3.4开始重复操作。

直接注入和可视化

1. 将无菌制备的含有NTF4或盐水的50μL剂量在设定为25℃的H ₂ O浴中注射30分钟。
2. 将大鼠放置在有机玻璃平台上的俯卧位置（ 图2 ）。野猪通过穿过平台顶部的导丝，从前额上切牙通过斜倚的姿势来摆放大鼠。
3. 将50毫米，30磅，100μL注射器连接到1.9毫米，30度鼻窦内窥镜（ 图3 ）。
   注意:注射器组件通过将插管牢固地保持在内窥镜的外壁上的夹具连接。内窥镜允许在口腔内可视化的声带和注射器的引导。在每个动物之前调整套管尖端的位置，以确保通过内窥镜视图完全清晰地看到尖端（ 图4 ）。
4. 使用橡胶一对镊子延伸舌头并将其横向移动。之后，插入塑料窥器以保持口腔通畅。将5毫米塑料注射器筒中的勺子切成1.5至2厘米的长度，切割边缘去毛刺并抛光光滑。
5. 关掉车上的灯并将卤素光源附着到内窥镜。打开录像机以捕获该过程。
6. 将内窥镜的远端浸入温水中几秒钟，以便在插入大鼠口中时最大限度地减少玻璃尖端上凝结的发展。
7. 使用来自显示器的视觉反馈，仔细地将针引导到左声带的区域。
8. 随着动物呼吸循环的吸气阶段注射溶液，以完全进入声带。在呼吸的吸气阶段，声带完全暴露。
   1. 一旦声带完全可见，将针插入左侧甲状腺激素，发现在声带的白色中间边缘的外侧。将针插入到位，通过注射器的凹陷输送注射器。
9. 关闭内窥镜和视频播放器上的卤素光源，然后转回room灯。
10. 将老鼠回到家中的笼子上放在加热垫上。
11. 从加热垫取出前，让老鼠恢复。更换笼子里的食物和水。
12. 注射后监测大鼠7天，然后安乐死。取出喉部进行冷冻切片²⁴ 。

5.大鼠安乐死

1. 用盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪麻醉麻醉大鼠（100mg / 8mg / kg体重腹膜内注射）。
2. 通过内侧胸廓切开术安乐死。

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结果

大鼠在渗透泵输注2周后直接注射NTF4后1周安乐死。收获喉，置于冷冻保护剂（30％蔗糖和70％磷酸盐缓冲盐水）中，然后用低温恒温器以10μm的宽度连续切片。老化的喉部肌肉受NTF4 ²⁵的施用影响。除了老年和老鼠之外，我们比较了甲状腺素肌肉的注射和非注射侧。通常，我们看到纤维尺寸随年龄的变化，其根据NTF4的施用途径而变化（ 图5

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讨论

喉部肌肉易受老化不利影响。以前的研究已经证明了老化喉部肌肉的变化，包括纤维尺寸变化，纤维总数，再生能力，NMJ大小和数量变化，以及收缩功能和肌球蛋白异构体转变的变化4,11,27,30,31 。老化喉肌可以通过应用神经营养蛋白来改变。可以容易地测量这些变化。因此，大鼠喉部肌肉提供了一个有用的模型来研究衰老和声音疾病/失调的影响。这些肌肉的研究也可能有助于在老龄化人群中发展?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurotrophin 4	Pepro Tech	450-04	200 ng in 50 μL
Alzet Osmotic Pump	DURECT Corporation	2001D
30 ° endoscope	Stoltz	61029D
50 mm 30 gauge 100-μL syringe	Hamilton	84850 and 201812
saline (sodium chloride solution)	Sigma-Aldrich	S8776
ketamine hydrochloride	Henry Schein	56344
xylazine hydrochloride	Henry Schein	33198
25 G 5/8 needle	Becton-Dickinson	305901
1 mL syringe	Becton-Dickinson	309659
ophthalmic ointment	Henry Schein	8897
clippers	Oster	44-018
ethanol	Decon	2716
iodine (Betadine)	Purdue Pharma L.P.	606404
heating pad	Sunbeam	731-5
5-0 nylon suture thread	AD Surgical	PMN-518R6
crile hemostat	Fine Science Tools	13005-14
delicate suture tying forceps	Fine Science Tools	11063-07
meloxicam	Henry Schein	49756
carprofen	Merritt Veterinary Supplies	148700
antibiotic ointment	Henry Schein	57110
acepromizine Aceproject	Henry Schein	3845
isoflurane Isothesia	Henry Schein	50033
induction box (anesthetizing box)	Harvard Apparatus	50-0116
oxygen compressed tank	Scott Gross	UN1072
plexiglas platform	Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps	Fine science tools rubber	11075-00
liquid rubber for forceps above	Lowe's	42518
plastic spectula (BD syringe cut to length)	Becton-Dickinson	309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope	Kay-Pentax	RLS 9100 B
video recorder	Kay-Pentax
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389-500G
phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525	Thermo Scientific	HM 525
Gill 1 hematoxylin	VWR	10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic	Thermo Fisher Scientific	6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	S0819
Texas red-X phalloidin	Sigma-Aldrich	T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate	Thermo Fisher Scientific	B-13422
Small animal anaesthesia machine	Smiths Medical	CDS 9000