Infusione sottocutanea di neurotrofina 4 usando le pompe osmotiche o l'iniezione muscolare diretta migliora i muscoli del laringe del ratto di invecchiamento

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per descrivere sistemicamente e direttamente l'uso della neurotrofina 4 (NTF4) per rimodellare i muscoli laringei dell'invecchiamento del ratto.

Abstract

La disfunzione della laringe negli anziani è una delle principali cause di disabilità, dai disturbi vocali alla disfagia e dalla perdita di riflessi protettivi delle vie aeree. Pochi, se esistono, esistono terapie che mirano a disfunzione muscolare laringea legata all'età. Le neurotrofine sono coinvolte nell'innervazione muscolare e nella differenziazione delle giunzioni neuromuscolari (NMJs). Si pensa che le neurotrofine aumentino la trasmissione neuromuscolare aumentando il rilascio del neurotrasmettitore. Le giunzioni neuromuscolari (NMJ) diventano più piccole e meno abbondanti nei muscoli laringei del ratto di invecchiamento, con prove di denervazione funzionale. Abbiamo esplorato gli effetti di NTF4 per l'uso clinico futuro come terapeutico per migliorare la funzione nei muscoli laringei umani di invecchiamento. Qui forniamo il protocollo dettagliato per l'applicazione sistemica e l'iniezione diretta di NTF4 per esaminare la capacità del muscolo laringeo ratto di invecchiare di rimodellare in risposta all'applicazione NTF4. In questo metodo, i ratti ricevevano NTF4 sistematicamente via oPompa smotica o mediante iniezione diretta attraverso le pieghe vocali. I muscoli della laringe furono poi disseccati e utilizzati per l'esame istologico della morfologia e della denervazione legata all'età.

Introduzione

I muscoli laringei contratti rapidamente e costantemente e sono vulnerabili agli effetti negativi dell'invecchiamento. Questa attività costante è pensata per contribuire a problemi vocali o disfagia osservati in persone di età superiore ai 65 anni ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . Molti meccanismi molecolari e patofisiologici contribuiscono a questa disfunzione legata all'età. Questi meccanismi possono includere il rimodellamento della mucosa laringea, l'atrofia muscolare o la perdita, la mancanza di rigenerazione delle fibre muscolari o atrofia che provoca l'arricciamento delle pieghe vocali e l'incapacità della chiusura glottica ^{8 , 9 , 10 , 11} . Non esiste una sperimentata terapia medica in questo momento che può comPrevenire completamente o riabilitare questi cambiamenti legati all'età in questi muscoli.

La modulazione dell'efficacia della trasmissione neuromuscolare può influenzare notevolmente la prestazione neuromotoria. La famiglia delle neurotrofine comprende il fattore di crescita del nervo (NGF), il fattore di crescita del nervo derivato dal cervello (BDNF), la neurotrofina 3 (NTF3) e la NTF4 ^{12 , 13} . Le neurotrofine hanno dimostrato di modulare l'efficacia sinaptica ^{1 , 4} . Il fattore di crescita dell'epatocyte, il fattore di crescita trasformante beta e il fattore di crescita dei fibroblasti sono stati recentemente impiegati negli esseri umani per il trattamento delle cicatrici vocali ^{15 - 17} . NTF4 regola anche l'efficacia della NMJ; I topi che mancano di NTF4 mostrano NMJ disassemblati ^{11 , 18 , 19} . Questi studi portano ad effetti promettenti dei trattamentiT dei disturbi muscolari linfatici e denervazione con fattori di crescita.

Le terapie di iniezione diretta ai tessuti delle pieghe vocali non sono senza precedenti negli esseri umani. Ad esempio, le iniezioni locali della tossina botulinica sono attualmente utilizzate come un trattamento efficace per i disturbi neurologici che influenzano i muscoli della laringa, come la disfonia spasmodica e la paralisi nervosa laringe ricorrente bilaterale ^{20 , 21} . L'idrogel acido ialuronico è un altro iniettabile, usato per trattare la scocciatura vocale e l'insufficienza glottale ^{22 , 23} . La laringoscopia d'iniezione può essere usata per trattare una serie di disturbi della comunicazione ²⁴ . Questi metodi di iniezione diretta sono promettenti per migliorare la funzione vocale e deglutire nelle popolazioni che invecchiano.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Usa i topi maschi Fischer 344-Brown Norvegia a 6 e 30 mesi di età per questo protocollo. I ratti sono stati ottenuti dall'Istituto Nazionale di Colonia di Roditore di Aging. Abbiamo utilizzato i ratti per questo studio perché la struttura della laringa del ratto è simile a quella dell'uomo, funzionalmente funzionale alla protezione delle vie aeree e alle vocalizzazioni specifiche per specie. Questo studio è stato eseguito in conformità con la politica PHS sulla cura umana e l'uso di animali da laboratorio, La Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e la legge sulla protezione degli animali (7 USC et seq.); Il protocollo sull'utilizzo degli animali è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Kentucky.

1. Anestesia dei ratti

1. Preparare l'anestetico mescolando la cloridrato di ketamine (anestetico dissociativo) e cloridrato xilazine (sedativo e analgesico) in soluzione salina tamponata. Le concentrazioni di ketamina e xilazina nella soluzione finale sono 100 mg / 8 mg per kgPeso corporeo rispettivamente.
2. Iniettare le anestetiche nel ratto mediante somministrazione intraperitoneale usando una siringa con un ago da 25 G.
3. Determinare che il ratto è sufficientemente anestetizzato pinzando la punta o il piede con pinze. Se il topo non reagisce al pizzico, allora la chirurgia può iniziare. Se il topo reagisce al pizzico della punta con riflessi o contrazioni muscolari, attendere 1-2 minuti e ripetere il test di pizzicotto. Se il ratto reagisce di nuovo, sostituire il ratto con una nuova animale e ripetere la procedura a partire dal punto 1.2.
4. Applicare unguento oculare agli occhi del ratto, dopo che il ratto è immobile, per evitare che le cornee si asciugano.

2. Impianto osmotico della pompa

1. Posizionare il ventrale del ratto sulla zona chirurgica asettica. Amministrare meloxicam come farmaco preanestetico. Amministrare intraperitonealmente ad un dosaggio di 1-4 mg / kg di peso corporeo usando una siringa con un ago da 25 G.
2. Utilizzare le taglierine per rimuovere un approssimaCon uno spessore di 1 "x 1" di pelliccia dalla parte posteriore del collo e circa 1 "caudale di spalla tra le spalle. Rasare il più vicino possibile alla pelle.
3. Bagnare la schiena e il collo con l'etanolo disinfettante (70%).
4. Dopo la rasatura, strofinare l'aspetto dorsale del collo con 3 scrubs in successione di alcool iodio-alcool finitura con alcool.
5. Mantenere la temperatura corporea del ratto inserendola su un pannello di riscaldamento impostato a 34 ° C.
6. Riempire pompe osmotiche preparate asetticamente con 50 μL di NTF4 o salina per il trattamento sistemico di NTF4 ( Figura 1 ).
   1. Utilizzare un bisturi per realizzare un'incisione orizzontale di circa 2 cm di larghezza attraverso la pelle, solo cranica nello spazio tra la scapola. Sollevare il bordo posteriore dell'incisione con le pinze con una mano mentre inserisci la punta degli emostatici e spingete delicatamente alla parte posteriore all'incisione.
   2. Dopo che la punta degli hemostats è di circa 2 cm cRaniale all'incisione, aprire le maniglie sugli emostatici, espandendo le punte per formare una "tasca" vuota sottocutanea al sito di incisione. Questo sarà il sito di posizionamento per la pompa.
7. Orientare il portale di erogazione della pompa prima sull'inserimento per ridurre al minimo l'interazione del NTF4 e la guarigione del sito di incisione della tasca.
8. Consegnare 50 μL di soluzione salina NTF4 per 7-14 giorni. Il gruppo di 7 giorni ha ricevuto 6,72 mg / die di NTF4 per una dose totale di 47,04 mg. Il gruppo di 14 giorni ha ricevuto 6,72 mg / die per una dose totale di 94,08 mg di NTF4 ²⁵ .
9. Usare filo di sutura da 5-0 nylon, hemostati e pinze per chiudere l'incisione fatta per il posizionamento della pompa.
10. Osservare i ratti per almeno 30 minuti mentre recuperano da anestesia. I criteri per il completamento del monitoraggio includono l'animale che diventa attivo, muove in giro per la gabbia, l'acqua potabile, e inizia altre attività normali come la cura.
11. Monitorare gli animali quotidianamentePer la prima settimana osservando la guarigione del sito chirurgico, il consumo normale dell'alimentazione e dell'acqua e il passaggio di urine / feci e qualsiasi segno abnormale comportamentale di stress, dolore o altre complicazioni postoperatorie.
12. Se il ratto sembra essere in dolore o disturbo, fornire al ratto una iniezione sottocutanea di carprofen da 5 mg / kg ogni 24 ore per un massimo di 5 giorni per alleviare il dolore.
13. Se sembra che ci sia un'infezione, consultare un veterinario per far sì che la ferita si guari correttamente.
14. A seconda di quale gruppo sperimentale il ratto è dentro, rimuove la sutura in nylon da 5-0 7-10 giorni dopo la chirurgia per evitare irritazioni dal filo.

3. Anestesia di ratti per iniezione diretta

1. Disattiva il cibo dai ratti la notte prima della procedura. Ciò assicura che non ci sia cibo per bloccare l'endoscopio o l'ago di iniezione.
2. Pesare i ratti e preparare acepromazina 1-2 mg / kg di peso corporeo. Iniettare in modo intramuscolare (la posizione IM è laSinistra il muscolo tiroarytenoide).
3. Posizionare il ratto nella scatola di induzione. Indurre l'anestesia nella scatola di induzione con 5% isoflurano e 1 LO ₂ .
4. Spostare il ratto in un cono a naso con 2% isoflurano e 600 ml O ₂ .
5. Determinare che il ratto è sufficientemente anestetizzato pinzando la punta o il piede con pinze. Se il topo non reagisce al pizzico, il protocollo di iniezione può iniziare. Se il topo reagisce al pizzico della punta con riflessi o contrazioni muscolari, attendere 1-2 minuti e ripetere il test di pizzicotto. Se il ratto reagisce di nuovo, sostituire il ratto con una nuova animale e ripetere la procedura a partire dal punto 3.4.

4. Iniezione diretta e visualizzazione

1. Posizionare i dosaggi di 50 μl preparati asetticamente contenenti NTF4 o saline in un bagno di H ₂ O impostati a 25 ° C per 30 minuti prima dell'iniezione.
2. Posizionare il ratto in posizione supina e reclinata su una piattaforma di plexiglass ( figura 2 ). SusPend il ratto nella posizione reclinata dai loro incisivi frontali superiore attraverso un filo di guida strinse sulla parte superiore della piattaforma.
3. Fissare una siringa da 50 μm, 30 gauge, da 100 μL ad un endoscopio sinusale da 1,9 mm, 30 ° ( figura 3 ).
   NOTA: L'assieme della siringa è collegato tramite un jig che tiene saldamente la cannula alla parete esterna dell'endoscopio. L'endoscopio consente la visualizzazione delle pieghe vocali e la guida della siringa intraorale. La posizione della punta della cannula viene regolata prima di ogni animale per assicurare che la punta sia completamente visibile attraverso la vista endoscopica ( Figura 4 ).
4. Utilizzare un paio di pinze in gomma per estendere la linguetta e spostarla lateralmente. Successivamente, inserire un speculum di plastica per mantenere la penetrazione orale. Fai speculum da un barile da 5 ml di siringa in plastica tagliato a una lunghezza di 1,5 a 2 cm, con i bordi tagliati sbiaditi e lucidati lisci.
5. Spegnere le luci nel vanoM e collegare una sorgente di luce alogena all'endoscopio. Accendere il videoregistratore per catturare la procedura.
6. Immergere l'estremità distale dell'endoscopio in acqua calda per alcuni secondi per ridurre al minimo lo sviluppo della condensa sulla punta di vetro quando viene inserito nella bocca del ratto.
7. Usando feedback visivo dal monitor, guidare con cura l'ago nella zona della piega vocale sinistra.
8. Tempo l'iniezione della soluzione con la fase inspiratoria del ciclo respiratorio degli animali per accedere completamente alla piega vocale. Durante la fase inspiratoria della respirazione, la piega vocale è completamente esposta.
   1. Una volta che la piega vocale è completamente visibile, inserire l'ago nel tireoarotenoide sinistro, trovato lateralmente al bordo bianco mediale della piega vocale. Con l'ago posto, trasportare l'iniettore attraverso la depressione della siringa.
9. Spegnere la sorgente di luce alogena sull'endoscopio e sul lettore video e tornare indietro sul roLuci om.
10. Rimettere il ratto alla sua gabbia di casa e mettere su un tappetino di riscaldamento.
11. Lasciare recuperare il ratto prima di rimuovere dal tampone di riscaldamento. Sostituire il cibo e l'acqua nella gabbia.
12. Monitorare i ratti per 7 giorni dopo l'iniezione e poi eutanizzare. Rimuovere le laringe per la criocondutturazione ²⁴ .

5. Eutanizzazione dei ratti

1. Anestetizzare i ratti con cloridrato di ketamina e cloridrato di xilazina (100 mg / 8 mg per kg di iniezione intraperitoneale iniettabile).
2. Eutanizzare da exsanguination dopo una toracotomia mediale.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

I ratti sono stati eutanizzati dopo 2 settimane di infusione osmotica o una settimana dopo l'iniezione diretta di NTF4. Le laringe sono state raccolte, poste in cryoprotectant (30% saccarosio e 70% saline fosfato tamponato) e poi sezionate in serie in larghezza 10 μm con un criostato. L'invecchiamento dei muscoli laringei è influenzato dalla somministrazione di NTF4 ²⁵ . Oltre al ratto giovane e vecchio, abbiamo confrontato il lato iniettato e non iniett...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

I muscoli della laringe sono vulnerabili agli effetti sfavorevoli dell'invecchiamento. Studi precedenti hanno dimostrato variazioni nei muscoli linfari che prevedono cambiamenti nella dimensione della fibra, nel numero totale di fibre, nella capacità rigenerativa, nella dimensione e nella modifica della quantità di NMJ, oltre alle variazioni della funzione contrattile e dei cambi di isoenzima di miosina ^{4 , 11 , 27 ,...}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurotrophin 4	Pepro Tech	450-04	200 ng in 50 μL
Alzet Osmotic Pump	DURECT Corporation	2001D
30 ° endoscope	Stoltz	61029D
50 mm 30 gauge 100-μL syringe	Hamilton	84850 and 201812
saline (sodium chloride solution)	Sigma-Aldrich	S8776
ketamine hydrochloride	Henry Schein	56344
xylazine hydrochloride	Henry Schein	33198
25 G 5/8 needle	Becton-Dickinson	305901
1 mL syringe	Becton-Dickinson	309659
ophthalmic ointment	Henry Schein	8897
clippers	Oster	44-018
ethanol	Decon	2716
iodine (Betadine)	Purdue Pharma L.P.	606404
heating pad	Sunbeam	731-5
5-0 nylon suture thread	AD Surgical	PMN-518R6
crile hemostat	Fine Science Tools	13005-14
delicate suture tying forceps	Fine Science Tools	11063-07
meloxicam	Henry Schein	49756
carprofen	Merritt Veterinary Supplies	148700
antibiotic ointment	Henry Schein	57110
acepromizine Aceproject	Henry Schein	3845
isoflurane Isothesia	Henry Schein	50033
induction box (anesthetizing box)	Harvard Apparatus	50-0116
oxygen compressed tank	Scott Gross	UN1072
plexiglas platform	Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps	Fine science tools rubber	11075-00
liquid rubber for forceps above	Lowe's	42518
plastic spectula (BD syringe cut to length)	Becton-Dickinson	309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope	Kay-Pentax	RLS 9100 B
video recorder	Kay-Pentax
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389-500G
phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525	Thermo Scientific	HM 525
Gill 1 hematoxylin	VWR	10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic	Thermo Fisher Scientific	6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	S0819
Texas red-X phalloidin	Sigma-Aldrich	T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate	Thermo Fisher Scientific	B-13422
Small animal anaesthesia machine	Smiths Medical	CDS 9000