JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для описания использования нейротрофина 4 (NTF4) системно и непосредственно для ремоделирования мышц гортани, стареющих на коже.

Аннотация

Дисфункция гортани у пожилых людей является основной причиной инвалидности: от нарушений речи до дисфагии и потери защитных рефлексов дыхательных путей. Немногие, если таковые имеются, существуют методы лечения возрастной дисфункции гортани. Нейротрофины участвуют в мышечной иннервации и дифференциации нервно-мышечных узлов (NMJ). Считается, что нейротрофины усиливают нервно-мышечную передачу путем увеличения высвобождения нейротрансмиттеров. Нервно-мышечные соединения (NMJ) становятся меньше и менее многочисленны в стареющих мышцах гортани крысы, что свидетельствует о функциональной денервации. Мы изучили влияние NTF4 для будущего клинического применения в качестве терапевтического средства для улучшения функции старения человеческих гортанных мышц. Здесь мы предоставляем подробный протокол для системного применения и прямого впрыска NTF4 для изучения способности стареющей мышцы гортани крысы ремоделировать в ответ на применение NTF4. В этом методе крысы либо получали NTF4 либо системно через oSmotic насоса или путем прямого впрыска через голосовые складки. Затем мышцы гортани были рассечены и использованы для гистологического исследования морфологии и возрастной денервации.

Введение

Мышцы гортани быстро и последовательно сокращаются и подвержены неблагоприятным последствиям старения. Считается, что эта постоянная активность способствует голодным проблемам или дисфагии, наблюдаемым у лиц старше 65 лет 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Несколько молекулярных и патофизиологических механизмов способствуют этой возрастной дисфункции. Эти механизмы могут включать ремоделирование слизистой оболочки гортани, атрофию или потерю мышечных волокон, отсутствие регенерации мышечных волокон или атрофию, которая вызывает поклоны голосовых складок и неспособность закрыть лоскут 8 , 9 , 10 , 11 . В настоящее время нет доказанной медицинской терапии, которая можетПредотвращают или реабилитируют эти возрастные изменения в этих мышцах.

Модуляция эффективности нервно-мышечной передачи может значительно влиять на работу нейромотора. Семейство нейротрофинов включает фактор роста нервов (NGF), фактор роста нервных клеток мозга (BDNF), нейротрофин 3 (NTF3) и NTF4 12 , 13 . Показано, что нейротрофины модулируют синаптическую эффективность 1 , 4 . Фактор роста гепатоцитов, трансформирующий фактор роста бета и фактор роста фибробластов, недавно были использованы у людей для лечения рубцов 15-17 лет . NTF4 также регулирует эффективность NMJ; Мышей, не имеющих NTF4, показывают разобранные NMJs 11 , 18 , 19 . Эти исследования приводят к многообещающим последствиям леченияТ стареющих расстройств гортани и денервации с факторами роста.

Терапия прямой инъекции тканям голосовых складок не является беспрецедентной для человека. Например, местные инъекции ботулинического токсина в настоящее время используются в качестве эффективного лечения нарушений неврологического движения, которые влияют на мышцы гортани, такие как спазматическая дисфония и двусторонний рецидивирующий паралич гортани нерва 20 , 21 . Гигель гиалуроновой кислоты является еще одним инъекционным средством, которое используется для лечения шрамов вокальных складок и гортанной недостаточности 22 , 23 . Инъекционная ларингопластика может использоваться для лечения различных нарушений связи 24 . Эти прямые методы инъекции обещают улучшить вокальную функцию и глотать в популяциях старения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Используйте крыс норвежских самцов Fischer 344-Brown в возрасте 6 и 30 месяцев для этого протокола. Крыс получали из Национального института стареющей колонии грызунов. Мы использовали крыс для этого исследования, потому что структура гортани крысы аналогична структуре человека, функционально служащей для защиты дыхательных путей и видоспецифических вокализаций. Это исследование проводилось в соответствии с Политикой PHS по увлажнению и использованию лабораторных животных, Руководство NIH по уходу и использованию лабораторных животных и Закон о благосостоянии животных (7 USC и последующие); Протокол об использовании животных был одобрен Институтом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Кентукки.

1. Анестезия крыс

  1. Подготовьте анестетики, смешав кетамин гидрохлорид (диссоциативный анестетик) и гидрохлорид ксилазина (седативный и обезболивающий) в забуференном физиологическом растворе. Концентрации кетамина и ксилазина в конечном растворе составляют 100 мг / 8 мг на кгВес тела соответственно.
  2. Внедрить анестетики в крысу путем внутрибрюшинного введения с использованием шприца с иглой 25 G.
  3. Определите, что крысу достаточно обезболивают, зажав носок или ногу щипцами. Если крыса не реагирует на щепотку, операция может начаться. Если крыса реагирует на пальцы ног с рефлекторными или мышечными сокращениями, подождите 1-2 минуты и повторите тест пинча. Если крыса снова реагирует, замените крысу новым животным и повторите процедуру, начиная с шага 1.2.
  4. Нанесите офтальмическую мазь на глаза крысы, после того как крыса неподвижна, чтобы предотвратить высыхание роговицы.

2. Имплантация осмотического насоса

  1. Поместите крысу вентральную на асептической хирургической области. Администрирование meloxicam как preanesthetic лекарства. Администрирование внутрибрюшинно в дозе 1-4 мг / кг массы тела с помощью шприца с иглой 25 G.
  2. Используйте клиперы для удаления аппроксимацииTely 1 "x 1" квадрат меха из затылка и приблизительно 1 "хвостовой части пространства между плечами. Бритьйте как можно ближе к коже.
  3. Смочите спину и шею дезинфицирующим этанолом (70%).
  4. После бритья, вытрите спинной аспект шеи с 3 скрабами в последовательности йодной спиртовой отделки спиртом.
  5. Поддерживайте температуру тела крысы, помещая ее на нагревательную подушку, установленную на 34 ° C.
  6. Заполните асептически подготовленные осмотические насосы с 50 мкл NTF4 или физиологическим раствором для системной обработки NTF4 ( рисунок 1 ).
    1. Используйте скальпель, чтобы сделать горизонтальный разрез шириной около 2 см по коже, просто черепно, чтобы пространство между лопатками. Поднимите задний край разреза с помощью щипцов одной рукой, вставляя кончик гемостатов и осторожно выдвигая назад к разрезу.
    2. После того, как кончик гемостаза составляет приблизительно 2 см cРанион к разрезу, откройте ручки на гемостатах, расширяя кончики, чтобы сформировать полый «карман» подкожный участок разреза. Это будет место размещения насоса.
  7. Сначала ориентируйтесь на портал доставки насоса при вставке, чтобы свести к минимуму любое взаимодействие NTF4 и исцеление участка разрезания кармана.
  8. Доставьте 50 мкл солевого раствора NTF4 в течение 7-14 дней. 7-дневная группа получала 6,72 мг / день NTF4 для общей дозы 47,04 мг. 14-дневная группа получала 6,72 мг / сут для общей дозы 94,08 мг NTF4 25 .
  9. Используйте шовную нить 5-0, гемостаты и щипцы, чтобы закрыть разрез, сделанный для размещения насоса.
  10. Наблюдайте за крысами в течение минимум 30 минут, когда они оправляются от анестезии. Критерии для завершения мониторинга включают в себя активное животное, перемещение вокруг клетки, питьевую воду и начало других обычных видов деятельности, таких как уход.
  11. Ежедневный мониторинг животныхВ течение первой недели, наблюдая за исцелением хирургического участка, нормальным питанием и потреблением воды и прохождением мочи / фекалий и любыми аномальными поведенческими признаками стресса, боли или других послеоперационных осложнений.
  12. Если крыса испытывает боль или дистресс, предоставьте крысе 5 мг / кг подкожной инъекции карпрофена один раз каждые 24 часа в течение 5 дней для облегчения боли.
  13. Если есть инфекция, обратитесь к ветеринару, чтобы убедиться, что рана заживает должным образом.
  14. В зависимости от того, в какой экспериментальной группе крыса внутри, удалите 5-0 нейлоновый шов на 7-10 дней после операции, чтобы предотвратить раздражение нити.

3. Анестезия крыс для прямой инъекции

  1. Удерживайте пищу у крыс в ночь перед процедурой. Это гарантирует отсутствие пищи для блокировки эндоскопа или инъекционной иглы.
  2. Взвесьте крысы и подготовьте ацепромазин 1-2 мг / кг массы тела. Внедрение внутримышечно (расположение IM являетсяЛевая щитовидная мышца).
  3. Поместите крысу в индукционную коробку. Вызывают анестезию в индукционной коробке с 5% изофлураном и 1 LO 2 .
  4. Переместите крысу в носовой конус с 2% изофлураном и 600 мл O 2 .
  5. Определите, что крысу достаточно обезболивают, зажав носок или ногу щипцами. Если крыса не реагирует на пинч, тогда может начаться протокол инъекции. Если крыса реагирует на пальцы ног с рефлекторными или мышечными сокращениями, подождите 1-2 минуты и повторите тест пинча. Если крыса снова реагирует, замените крысу новым животным и повторите процедуру, начиная с шага 3.4.

4. Прямая инъекция и визуализация

  1. Поместите асептически приготовленные 50 мкл дозы, содержащие NTF4 или физиологический раствор, в ванну с H 2 O, установленную до 25 ° C в течение 30 минут перед инъекцией.
  2. Поместите крысу в положение спины и откинутого на платформу из плексигласа ( рис. 2 ). СусОткинуть крысу в откинутой позе от их фронтальных верхних резцов через направляющую проволоку, нанизанную на верхнюю часть платформы.
  3. Прикрепите шприц объемом 50 мм, 30 калибра, 100 мкл к эндоскопическому синусовому углублению диаметром 1,9 мм ( рис. 3 ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Узел шприца прикреплен через зажимное приспособление, которое крепко удерживает канюлю на внешней стенке эндоскопа. Эндоскоп позволяет визуализировать вокальные складки и наведение шприца внутриродовым. Положение наконечника канюли регулируют перед каждым животным, чтобы убедиться, что наконечник полностью и четко виден через эндоскопическое изображение ( рисунок 4 ).
  4. Используйте удлиненные язычки с помощью резиновых наконечников и передвиньте их в боковом направлении. После этого вставьте пластиковое зеркало для поддержания проницаемости для полости рта. Сделайте зеркало из 5-миллилитрового пластикового шприца, который разрезается на длину от 1,5 до 2 см, при этом режущие кромки отшлифованы и полируются ровно.
  5. Выключить свет в рулеМ и подключить галогенный источник света к эндоскопу. Включите видеомагнитофон, чтобы выполнить процедуру.
  6. Погрузите дистальный конец эндоскопа в теплую воду на несколько секунд, чтобы свести к минимуму развитие конденсации на стеклянном наконечнике при вставке в рот крысы.
  7. Используя визуальную обратную связь с монитором, аккуратно направляйте иглу в область левой вокальной складки.
  8. Время инъекции раствора с инспираторной фазой цикла дыхания животных для полного доступа к голосовой складке. Во время вдоха фаза дыхания вокальная складка полностью раскрывается.
    1. Как только вокальная сгиб будет полностью виден, вставьте иглу в левый тироартеноид, расположенный сбоку от белого медиального края вокальной складки. С иглой на месте, доставить инъекции через нажатие шприца.
  9. Отключите галогенный источник света на эндоскопе и видеоплеере и вернитесь на руОм.
  10. Верните крысу в свою домашнюю клетку и поместите на грелку.
  11. Позвольте крысе восстановить до удаления с грелки. Замените пищу и воду в клетке.
  12. Контролируйте крыс в течение 7 дней после инъекции, а затем эвтаназируйте. Удалите ларинги для криосекции 24 .

5. Эвтаназия крыс

  1. Анестезируйте крыс с помощью гидрохлорида кетамина и гидрохлорида ксилазина (100 мг / 8 мг на кг массы тела, вводимого внутрибрюшинно).
  2. Усыплять кровотечением после медиальной торакотомии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Крыс подвергали эвтаназии через 2 недели после введения осмотического насоса или через 1 неделю после прямой инъекции NTF4. Ларинги собирали, помещали в криопротектор (30% сахарозу и 70% забуференный фосфатом физиологический раствор), а затем последовательно секционирова?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мускулы гортани уязвимы к неблагоприятным последствиям старения. Предыдущие исследования продемонстрировали изменения в стареющих мышцах гортани, которые включают изменения размера волокна, общее количество волокон, регенеративную способность, размер и количественные изменения NMJ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального института глухоты и других нарушений связи (R21DC010806 - CAM и JCS и R01DC011285 - CAM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Neurotrophin 4Pepro Tech450-04200 ng in 50 μL
Alzet Osmotic PumpDURECT Corporation2001D
30 ° endoscopeStoltz61029D
50 mm 30 gauge 100-μL syringeHamilton84850 and 201812
saline (sodium chloride solution)Sigma-AldrichS8776
ketamine hydrochlorideHenry Schein56344
xylazine hydrochlorideHenry Schein33198
25 G 5/8 needleBecton-Dickinson305901
1 mL syringeBecton-Dickinson309659
ophthalmic ointmentHenry Schein8897
clippersOster44-018
ethanolDecon2716
iodine (Betadine)Purdue Pharma L.P.606404
heating padSunbeam731-5
5-0 nylon suture threadAD SurgicalPMN-518R6
crile hemostatFine Science Tools13005-14
delicate suture tying forcepsFine Science Tools11063-07
meloxicamHenry Schein49756
carprofenMerritt Veterinary Supplies148700
antibiotic ointmentHenry Schein57110
acepromizine AceprojectHenry Schein3845
isoflurane IsothesiaHenry Schein50033
induction box (anesthetizing box)Harvard Apparatus50-0116
oxygen compressed tankScott GrossUN1072
plexiglas platformSmall Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forcepsFine science tools rubber11075-00
liquid rubber for forceps aboveLowe's42518
plastic spectula (BD syringe cut to length)Becton-Dickinson309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscopeKay-PentaxRLS 9100 B
video recorderKay-Pentax
sucroseSigma-AldrichS0389-500G
phosphate buffered salineSigma-AldrichP4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525Thermo ScientificHM 525
Gill 1 hematoxylinVWR10143-142
Shandon eosin-Y alcoholicThermo Fisher Scientific6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbitSigma-AldrichS0819
Texas red-X phalloidinSigma-AldrichT7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugateThermo Fisher ScientificB-13422
Small animal anaesthesia machineSmiths MedicalCDS 9000

Ссылки

  1. Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
  2. Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
  3. Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
  4. Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
  5. Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
  6. Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
  7. Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
  8. Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
  9. Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
  10. Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
  11. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
  12. Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
  13. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
  14. Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
  15. Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
  16. Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
  17. Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
  18. Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
  19. Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
  20. Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
  21. Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
  22. Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
  23. Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
  24. Walker, W. F. Jr, Homberger, D. G. Anatomy and dissection of the rat. , Third Edition, W.H. Freeman and Company. New York. (1997).
  25. Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
  26. Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798(2016).
  27. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
  28. Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
  29. Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , Columbus, OH. (1980).
  30. Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
  31. Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1244 NTF4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены