A infusão subcutânea de neurotrofina 4 com bombas osmóticas ou injeção muscular direta melhora o envelhecimento dos músculos da laringe do rato

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever o uso de neurotrofina 4 (NTF4) sistematicamente e diretamente para remodelar os músculos laríngeos do envelhecimento do rato.

Resumo

A disfunção laríngea em idosos é uma das principais causas de incapacidade, de distúrbios de voz à disfagia e perda de reflexos protetores das vias aéreas. Poucas, se houver, existem terapias que visam a disfunção do músculo laríngeo relacionado à idade. As neurotrofinas estão envolvidas na inervação muscular e na diferenciação das junções neuromusculares (NMJs). Pensa-se que as neurotrofinas melhoram a transmissão neuromuscular ao aumentar a liberação do neurotransmissor. As junções neuromusculares (NMJs) tornam-se menores e menos abundantes no envelhecimento dos músculos da laringe do rato, com evidência de desnervação funcional. Nós exploramos os efeitos do NTF4 para o uso clínico futuro como um procedimento terapêutico para melhorar a função no envelhecimento dos músculos da laringe humana. Aqui, fornecemos o protocolo detalhado para aplicação sistêmica e injeção direta de NTF4 para investigar a capacidade do músculo laríngeo do rato em envelhecimento de remodelar em resposta à aplicação NTF4. Neste método, os ratos receberam NTF4 sistematicamente via oBomba smotic ou por injeção direta através das pregas vocais. Os músculos laríngeos foram então dissecados e utilizados para exame histológico de morfologia e denervação relacionada à idade.

Introdução

Os músculos laríngeos se contraem de forma rápida e consistente e são vulneráveis ​​aos efeitos adversos do envelhecimento. Espera-se que essa atividade constante contribua para problemas de voz ou disfagia observados em pessoas com mais de 65 anos de idade ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . Vários mecanismos moleculares e fisiopatológicos contribuem para esta disfunção relacionada à idade. Esses mecanismos podem incluir a remodelação da mucosa laríngea, a atrofia ou perda de fibras musculares, a falta de regeneração ou atrofia de fibras musculares que provoca curvatura das pregas vocais e incapacidade de fechamento gloteado ^{8 , 9 , 10 , 11} . Não há uma terapia médica comprovada neste momento que possa comPrever ou reabilitar essas mudanças relacionadas com a idade desses músculos.

A modulação da eficácia da transmissão neuromuscular pode influenciar significativamente o desempenho neuromotor. A família das neurotrofinas inclui o fator de crescimento nervoso (NGF), o fator de crescimento do nervo derivado do cérebro (BDNF), neurotrofina 3 (NTF3) e NTF4 ^{12 , 13} . Verificou-se que as neurotrofinas modulam a eficácia sináptica ^{1 , 4} . O fator de crescimento de hepatócitos, o fator de crescimento transformador beta e o fator de crescimento de fibroblastos foram recentemente utilizados em seres humanos para o tratamento de cicatrizes de pregas vocais de ^{15 a 17} . NTF4 também regula a eficácia NMJ; Ratos com falta de NTF4 mostram NMJs desmontados ^{11 , 18 , 19} . Esses estudos levam a efeitos promissores do tratamentoT do envelhecimento dos distúrbios do músculo laríngeo e da desnervação com fatores de crescimento.

A terapêutica de injeção direta aos tecidos das pregas vocais não é sem precedentes em seres humanos. Por exemplo, as injeções locais de toxina botulínica são atualmente utilizadas como um tratamento eficaz para distúrbios do movimento neurológico que afetam os músculos da laringe, como a disfonia espasmódica e paralisia bilateral do nervo laríngeo ^{20 , 21} . O hidrogel de ácido hialurônico é outro injetável, que é usado para tratar a queima de dobras vocais e insuficiência glotal ^{22 , 23} . A laringoplastia por injeção pode ser usada para tratar uma variedade de distúrbios de comunicação ²⁴ . Esses métodos de injeção direta são promissores para melhorar a função vocal e deglutição no envelhecimento populacional.

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Protocolo

Use ratos machos Fischer 344-Brown Norway com 6 e 30 meses de idade para este protocolo. Os ratos foram obtidos da colônia de roedores do Instituto Nacional do Envelhecimento. Utilizamos ratos para este estudo porque a estrutura da laringe de ratos é semelhante à do ser humano, servindo funcionalmente para a proteção das vias aéreas e vocalizações específicas de espécies. Este estudo foi realizado de acordo com a Política PHS sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório, O Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e a Lei de Bem-estar dos Animais (7 USC et seq.); O protocolo de uso de animais foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal (IACUC) da Universidade do Kentucky.

1. Anestesia de ratos

1. Prepare os anestésicos misturando cloridrato de cetamina (anestésico dissociativo) e cloridrato de xilazina (sedativo e analgésico) em solução salina tamponada. As concentrações de ketamina e xilazina na solução final são 100 mg / 8 mg por kgPeso corporal, respectivamente.
2. Injete os anestésicos no rato por administração intraperitoneal usando uma seringa com uma agulha de 25 G.
3. Determine que o rato está suficientemente anestesiado pressionando o pé ou o pé com fórceps. Se o rato não reagir à pitada, a cirurgia pode começar. Se o rato reage à prega do dedo do pé com contrações reflexas ou musculares, espere 1-2 minutos e repita o teste de pitada. Se o rato reage novamente, substitua o rato por um novo animal e repita o procedimento a partir do passo 1.2.
4. Aplique pomada oftálmica aos olhos do rato, depois que o rato estiver imóvel, para evitar que as córneas se sectem.

2. Implantação de bomba osmótica

1. Coloque o ventral do rato na área cirúrgica asséptica. Administrar meloxicam como medicamento pré-anestésico. Administrar intraperitonealmente a uma dosagem de 1-4 mg / kg de peso corporal usando uma seringa com uma agulha de 25 G.
2. Use cortadores para remover uma aproximação1 "x 1" quadrado de pele da parte de trás do pescoço e aproximadamente 1 "caudal de espaço entre os ombros. Rasgue o mais próximo possível da pele.
3. Molhe as costas eo pescoço com etanol desinfetante (70%).
4. Após o barbear, esfregue o aspecto dorsal do pescoço com 3 esfrega em sucessão de álcool iodo com o álcool.
5. Mantenha a temperatura corporal do rato, colocando-o sobre uma almofada de aquecimento ajustada para 34 ° C.
6. Preencha as bombas osmóticas preparadas assepticamente com 50 μL de NTF4 ou solução salina para tratamento NTF4 sistêmico ( Figura 1 ).
   1. Use um bisturi para fazer uma incisão horizontal de aproximadamente 2 cm de largura através da pele, apenas craniana para o espaço entre a escápula. Levante a extremidade posterior da incisão com fórceps com uma mão ao inserir a ponta dos hemostáticos e empurrando suavemente para posterior a incisão.
   2. Depois que a ponta dos hemostatos é de aproximadamente 2 cm cRanial para a incisão, abra as alças nos hemostáticos, expandindo as pontas para formar um "bolso" oco subcutâneo para o local da incisão. Este será o site de colocação da bomba.
7. Oriente o fim do portal de entrega da bomba primeiro após a inserção para minimizar qualquer interação do NTF4 e a cicatrização do site da incisão de bolso.
8. Entregue 50 μL de solução salina NTF4 durante 7 14 dias. O grupo de 7 dias recebeu 6,72 mg / dia de NTF4 para uma dose total de 47,04 mg. O grupo de 14 dias recebeu 6,72 mg / dia para uma dose total de 94,08 mg de NTF4 ²⁵ .
9. Use uma rosca de sutura de nylon 5-0, hemostáticos e fórceps para fechar a incisão feita para a colocação da bomba.
10. Observe os ratos durante um mínimo de 30 min à medida que se recuperam da anestesia. Os critérios para a conclusão do monitoramento incluem o animal se tornando ativo, movendo-se sobre a gaiola, bebendo água e iniciando outras atividades normais, como a preparação.
11. Monitore animais diariamenteDurante a primeira semana, observando a cicatrização do local cirúrgico, alimentação normal e consumo de água e passagem de urina / fezes e quaisquer sinais comportamentais anormais de estresse, dor ou outras complicações pós-operatórias.
12. Se o rato parece estar com dor ou angústia, forneça ao rato uma injeção subcutânea de 5 mg / kg de carprofeno uma vez a cada 24 h por até 5 dias para aliviar a dor.
13. Se parece haver uma infecção, consulte um veterinário para que a ferida se cure adequadamente.
14. Dependendo de qual grupo experimental o rato dentro, remova a sutura de nylon 5-0 7-10 dias após a cirurgia para evitar irritação da rosca.

3. Anestesia de ratos para injeção direta

1. Retire o alimento dos ratos a noite anterior ao procedimento. Isso garante que não há alimentos para bloquear o endoscópio ou a agulha de injeção.
2. Pesar ratos e preparar acepromazina 1-2 mg / kg de peso corporal. Injetar por via intramuscular (a localização IM é aMúsculo tireo-arteronóide esquerdo).
3. Coloque o rato na caixa de indução. Induzir anestesia na caixa de indução com 5% de isoflurano e 1 LO ₂ .
4. Mova o rato para um cone do nariz com 2% de isoflurano e 600 mL de O2.
5. Determine que o rato está suficientemente anestesiado pressionando o pé ou o pé com fórceps. Se o rato não reagir à pitada, o protocolo de injeção pode começar. Se o rato reage à prega do dedo do pé com contrações reflexas ou musculares, espere 1-2 minutos e repita o teste de pitada. Se o rato reage de novo, substitua o rato por um novo animal e repita o procedimento a partir do passo 3.4.

4. Injeção direta e visualização

1. Coloque doses 50 μL preparadas assepticamente contendo NTF4 ou solução salina em um banho de H ₂ O ajustado a 25 ° C durante 30 min antes da injeção.
2. Coloque o rato em posição supina e reclinada em uma plataforma de plexiglass ( Figura 2 ). SusColoque o rato na postura reclinada de seus incisivos superiores frontais através de um fio guia empurrado pela parte superior da plataforma.
3. Anexe uma seringa de 50 mm, 30 gauge, 100 μL a um endoscópio sinusal de 1,9 mm, 30 ° ( Figura 3 ).
   NOTA: A montagem da seringa está presa através de um gabarito que segura a cânula firmemente na parede externa do endoscópio. O endoscópio permite a visualização das pregas vocais e a orientação da seringa intra-oralmente. A posição da ponta da cânula é ajustada antes de cada animal para garantir que a ponta seja totalmente e claramente visível através da visão endoscópica ( Figura 4 ).
4. Use um par de fórmulas de borracha para estender a língua e movê-la lateralmente. Depois, insira um espéculo de plástico para manter a permeabilidade oral. Faça o espéculo de um tambor de seringa de plástico de 5 mL que é cortado para um comprimento de 1,5 a 2 cm, com as bordas cortadas deburadas e polidas lisas.
5. Desligue as luzes no rooM e coloque uma fonte de luz halógena no endoscópio. Ligue o gravador de vídeo para capturar o procedimento.
6. Mergulhe a extremidade distal do endoscópio em água morna por alguns segundos para minimizar o desenvolvimento de condensação na ponta de vidro quando inserido na boca do rato.
7. Usando feedback visual do monitor, guie cuidadosamente a agulha na área da prega vocal esquerda.
8. Tempo de injeção da solução com a fase inspiratória do ciclo de respiração dos animais para acessar completamente a prega vocal. Durante a fase inspiratória da respiração, a prega vocal é totalmente exposta.
   1. Uma vez que a prega vocal é totalmente visível, insira a agulha no tireoaritenóide esquerdo, encontrado lateral à borda mediana branca da prega vocal. Com a agulha no lugar, entregue o injeção através da depressão da seringa.
9. Desligue a fonte de luz halógena no endoscópio e no reprodutor de vídeo e volte-se no roOm luzes.
10. Retorne o rato para a sua gaiola de casa e coloque em uma almofada de aquecimento.
11. Permita que o rato se recupere antes da remoção da almofada de aquecimento. Substitua alimentos e água na gaiola.
12. Monitorar ratos durante 7 dias após a injeção e, em seguida, eutanizar. Remova as laringes para crioesecção ²⁴ .

5. Eutanização de ratos

1. Anestesiar ratos com cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina (100 mg / 8 mg por kg de injeção intraperitoneal injetada no peso corporal).
2. Eutanizar por exsanguinação após uma toracotomia mediana.

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Resultados

Os ratos foram eutanásicos após 2 semanas de infusão de bomba osmótica ou 1 semana após a injeção direta de NTF4. Larynges foram colhidos, colocados em crioprotectores (30% de sacarose e 70% de solução salina tamponada com fosfato) e depois seccionados em série em 10 μm de largura com um criostato. O envelhecimento dos músculos laríngeos é afetado pela administração de NTF4 ²⁵ . Além de ratos jovens e velhos, comparamos o lado injetado e não inje...

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Discussão

Os músculos laríngeos são vulneráveis ​​aos efeitos desfavoráveis ​​do envelhecimento. Estudos anteriores demonstraram alterações nos músculos da laringe envelhecidos que incluem mudanças no tamanho da fibra, número total de fibras, capacidade regenerativa, tamanho NMJ e alterações quantitativas, além de variações na função contrátil e mudanças da isoforma da miosina ^{4 , 11 , 27 ,}

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurotrophin 4	Pepro Tech	450-04	200 ng in 50 μL
Alzet Osmotic Pump	DURECT Corporation	2001D
30 ° endoscope	Stoltz	61029D
50 mm 30 gauge 100-μL syringe	Hamilton	84850 and 201812
saline (sodium chloride solution)	Sigma-Aldrich	S8776
ketamine hydrochloride	Henry Schein	56344
xylazine hydrochloride	Henry Schein	33198
25 G 5/8 needle	Becton-Dickinson	305901
1 mL syringe	Becton-Dickinson	309659
ophthalmic ointment	Henry Schein	8897
clippers	Oster	44-018
ethanol	Decon	2716
iodine (Betadine)	Purdue Pharma L.P.	606404
heating pad	Sunbeam	731-5
5-0 nylon suture thread	AD Surgical	PMN-518R6
crile hemostat	Fine Science Tools	13005-14
delicate suture tying forceps	Fine Science Tools	11063-07
meloxicam	Henry Schein	49756
carprofen	Merritt Veterinary Supplies	148700
antibiotic ointment	Henry Schein	57110
acepromizine Aceproject	Henry Schein	3845
isoflurane Isothesia	Henry Schein	50033
induction box (anesthetizing box)	Harvard Apparatus	50-0116
oxygen compressed tank	Scott Gross	UN1072
plexiglas platform	Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps	Fine science tools rubber	11075-00
liquid rubber for forceps above	Lowe's	42518
plastic spectula (BD syringe cut to length)	Becton-Dickinson	309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope	Kay-Pentax	RLS 9100 B
video recorder	Kay-Pentax
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389-500G
phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525	Thermo Scientific	HM 525
Gill 1 hematoxylin	VWR	10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic	Thermo Fisher Scientific	6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	S0819
Texas red-X phalloidin	Sigma-Aldrich	T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate	Thermo Fisher Scientific	B-13422
Small animal anaesthesia machine	Smiths Medical	CDS 9000