תת עורית נוירוטרופין 4 עירוי באמצעות אוסמוטי משאבות או הזרקת שרירים ישירה משפר הזדקנות עכברים שרירי הלוע.

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לתאר את השימוש של neurotrophin 4 (NTF4) באופן שיטתי ישירות כדי לשפץ עכברוש ההזדקנות שרירים הגרון.

Abstract

תפקוד לקוי של הגרון אצל קשישים הוא גורם עיקרי לחולי נכות, מהפרעות קוליות ועד לקשיי ראייה ואובדן רפלקסים מגנים על דרכי הנשימה. מעטים, אם בכלל, קיימים טיפולים כי המטרה גיל הקשורים לתפקוד שרירים בגרון. נויטרופונים מעורבים בעצב שרירים ובידול של צמתים ניירומוסקולריים (NMJs). הוא חשב כי neurotrophins לשפר את העברת neuromuscular על ידי הגדלת שחרור נוירוטרנסמיטר. הצמתים הניירומוסקולריים (NMJ) הופכים קטנים יותר ופחות בשפע בשרירי הגרון העכברים המזדקנים, עם ראיות לשימור תפקודי. בחנו את ההשפעות של NTF4 לשימוש קליני עתידי כטיפול לשיפור תפקוד ההזדקנות בשרירי הגרון האנושיים. כאן, אנו מספקים את פרוטוקול מפורט עבור יישום מערכתי הזרקת ישירה של NTF4 לחקור את היכולת של הזדקנות חולדה עכברוש הגרון לשפץ בתגובה יישום NTF4. בשיטה זו, חולדות או קיבלו NTF4 או באופן שיטתי דרך oמשאבה סמוטית או על ידי הזרקה ישירה דרך קפל ווקאלי. שרירי הלוע היו אז גזור ומשמש לבדיקת היסטולוגית של מורפולוגיה ושימור הקשורים לגיל.

Introduction

שרירי הגרון מתכווצים במהירות ועקביות, והם פגיעים לתופעות הלוואי של ההזדקנות. פעילות מתמדת זו נחשבת לתורמת לבעיות קוליות או לדיספגיה שנצפתה אצל אנשים מעל גיל 65 שנים ^{, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . מספר מנגנונים מולקולריים ו פתופיזיולוגיים תורמים לתפקוד לקוי הקשור לגיל. מנגנונים אלה יכולים לכלול שיפוץ של רירית הגרון, ניוון שריר או אובדן, חוסר סיבים שריר התחדשות או ניוון אשר גורם קשת של קפל ווקאלי חוסר יכולת של הסגר ^{8 , 9 , 10 , 11} . אין טיפול רפואי מוכח בשלב זה יכול comלמנוע או לשקם שינויים אלה הקשורים לגיל אלה שרירים.

אפנון האפקטיביות של שידור neuromuscular יכול להשפיע מאוד על הביצועים neuromotor. משפחת הנוירוטרופים כוללת גורם לגדילה עצבית (NGF), גורם גדילה עצבי המופק על ידי המוח (BDNF), נוירוטרופין 3 (NTF3) ו- NTF4 ^{12 , 13} . נוירוטרופים הוכחו כדי לווסת את יעילות הסינפטי ^{1 , 4} . גורם הצמיחה hepatocyte, הפיכת גורם גדילה ביתא גורם הגידול fibroblast לאחרונה נעשה שימוש בבני אדם לטיפול הצטלקות קפל ^{15 - 17} . NTF4 גם מסדיר את יעילות NMJ; עכברים חסרים NTF4 להראות מפורקים NMJs ^{11 , 18 , 19} . מחקרים אלה מובילים להשפעות מבטיחות של מטפליםT של הזדקנות שרירים הגרון ואת שימור עם גורמי גדילה.

טיפול הזרקה ישירה לרקמות של קפל ווקאלי הם לא תקדים בבני אדם. לדוגמה, זריקות מקומיות של toxin botulinum משמשים כיום כטיפול יעיל להפרעות תנועה נוירולוגיות המשפיעות על השרירים בגרון, כגון דיספוניה של עוויתות ושיתוק עצבי חוזר דו-צדדי חוזר ^{20 , 21} . חומצה היאלורונית הידרוגנית נוספת היא זריקה, המשמשת לטיפול מפחיד ווקאלי קיפול וחסר glutal ^{22 , 23} . הזריקה laryngoplasty ניתן להשתמש כדי לטפל במגוון של הפרעות בתקשורת ²⁴ . שיטות הזרקה ישירה אלו מקיימות הבטחה לשיפור תפקוד הקול והבלעה באוכלוסיות ההזדקנות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

השתמש זכר Fischer 344-Brown חולדות נורבגיה בגיל 6 ו 30 חודשים של גיל עבור פרוטוקול זה. חולדות התקבלו מן המכון הלאומי של זקנה מכרסמים המושב. השתמשנו עכברושים עבור מחקר זה, כי המבנה של הגרון חולדה דומה לזו של האדם, פונקציונלית המשרתים להגנה על דרכי הנשימה ו vocalizations המין המיוחד מחקר זה בוצע בהתאם למדיניות PHS על טיפול הומאני ושימוש בחיות מעבדה, מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, וחוק רווחת בעלי חיים (7 USC et seq); פרוטוקול השימוש בבעלי חיים אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) של אוניברסיטת קנטקי.

1. הרדמה של חולדות

1. הכן את ההרדמה על ידי ערבוב קטמין הידרוכלוריד (הרדמה דיסוציאטיבית) ו xylazine hydrochloride (הרגעה משכך כאבים) ב שנאגרו מלוחים. ריכוז ketamine ו xylazine בפתרון הסופי הם 100 מ"ג / 8 מ"ג לק"גמשקל הגוף בהתאמה.
2. להזריק את הרדמה לתוך החולדה על ידי הממשל intraperitoneal באמצעות מזרק עם מחט 25 G.
3. לקבוע כי החולדה הוא הרדים מספיק על ידי צביטה הבוהן או הרגל עם מלקחיים. אם החולדה לא מגיבה על קמצוץ, ואז הניתוח יכול להתחיל. אם החולדה מגיבה על קמצוץ הבוהן עם התכווצויות רפלקס או שריר, ואז לחכות 1-2 דקות לחזור על מבחן קמצוץ. אם החולדה מגיבה שוב, להחליף את החולדה עם בעל חיים חדש הליך חוזר החל מ שלב 1.2.
4. להחיל משחה עיניים לעיניים של חולדה, לאחר החולדה הוא נייח, כדי למנוע את הקרניות להתייבש.

2. אוסמוטי משאבת ההשתלה

1. מניחים את החולדה הגחון על אזור כירורגי aseptic. ניהול meloxicam כתרופה preanesthetic. ניהול intraperitoneally במינון של 1-4 מ"ג / ק"ג של משקל הגוף באמצעות מזרק עם מחט 25 G.
2. השתמש בקוצץ כדי להסיר קירובTale 1 "x 1" מרובע פרווה מגב הצוואר, וכ 1 "הזנב של שטח בין כתפיים. להתגלח קרוב ככל האפשר לעור.
3. רטוב את הגב והצוואר עם אתנול חיטוי (70%).
4. לאחר גילוח, לשפשף את היבט הגב של הצוואר עם 3 מקרצף ברצף של אלכוהול האלכוהול הגמר עם אלכוהול.
5. לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדה על ידי הנחת אותו על כרית חימום מוגדר 34 מעלות צלזיוס.
6. ממלאים משאבות אוסמוטי מוכן aseptically עם או 50 μL של NTF4 או מלוחים עבור טיפול NTF4 מערכתית ( איור 1 ).
   1. השתמש באזמל כדי לבצע חתך אופקית כ 2 ס"מ רחב דרך העור, רק גולגולתי לחלל בין scapulae. הרם את הקצה האחורי של החתך עם מלקחיים עם יד אחת תוך החדרת קצה hemostats בעדינות דוחף אחורי החתך.
   2. לאחר קצה hemostats הוא כ 2 ס"מ cרץ את החתך, לפתוח את הידיות על hemostats, הרחבת הקצות כדי ליצור חלול "כיס" תת עורית לאתר החתך. זה יהיה המיקום מיקום המשאבה.
7. אוריינט את המשאבה משלוח הפורטל בסוף הראשון עם הכניסה כדי למזער כל אינטראקציה של NTF4 ואת הריפוי של אתר החתך כיס.
8. ספק 50 μL של מלוחים NTF4 עבור 7 או 7 ימים. קבוצת 7 ימים קיבלה 6.72 מ"ג ליום של NTF4 במינון כולל של 47.04 מ"ג. קבוצת הגיל 14 קיבלה 6.72 מ"ג ליום עבור מינון כולל של 94.08 מ"ג של NTF4 ²⁵ .
9. השתמש חוט 5-0 ניילון תפר, hemostats ו מלקחיים כדי לסגור את החתך עשה עבור מיקום המשאבה.
10. שים לב חולדות במשך מינימום של 30 דקות כפי שהם להתאושש מהרדמה. הקריטריונים להשלמת הניטור כוללים את החיה להיות פעיל, נע על הכלוב, מי שתייה, ומתחילים פעילויות רגילות אחרות כגון טיפוח.
11. צג חיות היומיבשבוע הראשון על ידי התבוננות בריפוי של אתר כירורגי, תזונה נורמלית וצריכת מים וחולפת שתן / צואה, וכל סימנים התנהגותיים חריגים של לחץ, כאב או סיבוכים לאחר הניתוח.
12. אם חולדה נראה כואב או מצוקה, לספק חולדה עם 5 מ"ג / ק"ג הזרקת תת עורית של carprofen פעם כל 24 שעות עד 5 ימים כדי להקל על הכאב.
13. אם יש זיהום, להתייעץ עם וטרינר כדי לגרום כי הפצע מרפא כראוי.
14. בהתאם קבוצה ניסיונית החולדה ב, להסיר את תפר 5-0 ניילון 7-10 ימים לאחר הניתוח כדי למנוע גירוי מהחוט.

3. הרדמה של חולדות להזרקת ישיר

1. למנוע מזון מן החולדות בלילה לפני ההליך. זה מבטיח כי אין מזון לחסום את אנדוסקופ או מחט הזרקת.
2. לשקול חולדות ולהכין acepromazine 1-2 מ"ג / ק"ג משקל גוף. להזריק intramuscularly (מיקום IM הואשריר thyroarytenoid שמאל).
3. מניחים את החולדה בתיבה אינדוקציה. להשרות הרדמה בתיבה אינדוקציה עם 5% isoflurane ו 1 LO ₂ .
4. להעביר את החולדה על חרוט האף עם isoflurane 2% ו 600 מ"ל O ₂ .
5. לקבוע כי החולדה הוא הרדים מספיק על ידי צביטה הבוהן או הרגל עם מלקחיים. אם החולדה לא מגיבה על קמצוץ, אז פרוטוקול ההזרקה יכול להתחיל. אם החולדה מגיבה על קמצוץ הבוהן עם התכווצויות רפלקס או שריר, ואז לחכות 1-2 דקות לחזור על מבחן קמצוץ. אם החולדה מגיבה שוב, להחליף את החולדה עם בעל חיים חדש הליך חוזר החל מ שלב 3.4.

4. הזרקה ישירה ויזואליזציה

1. מקום מוכן aseptically 50 μL מינונים המכילים NTF4 או מלוחים ב H ₂ O אמבטיה להגדיר 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני ההזרקה.
2. מניחים את החולדה במצב שכיבה ו שכיבה על פלטפורמת פרספקס ( איור 2 ). סוסמכופפים את העכברוש בתנוחה השעורה מהחלק העליון של החותכות הקדמיות, דרך חוט תיל המתוח על החלק העליון של הרציף.
3. צרף 50 מ"מ, 30 מד, 100 מזרק μL ל 1.9 מ"מ, 30 ° סינוס אנדוסקופ ( איור 3 ).
   הערה: מכלול המזרק מחובר באמצעות חפיפה המחזיקה את הצינורית בחוזקה לקיר החיצוני של האנדוסקופ. האנדוסקופ מאפשר הדמיה של קפל ווקאלי והכוונה של מזרק intraorally. המיקום של קצה צינורית מותאם לפני כל חיה כדי להבטיח את קצה במלואו וברור לעין באמצעות תצוגה אנדוסקופית ( איור 4 ).
4. השתמש זוג מוטה גומי מורט להאריך את הלשון ולהזיז אותו רוחבית. לאחר מכן, הכנס משקולת פלסטיק כדי לשמור על הפטנט בעל פה. הפוך את speculum מ 5 מ"ל חבית פלסטיק חבית כי הוא חתך באורך של 1.5 עד 2 ס"מ, עם הקצוות לחתוך deburred ו מלוטש חלקה.
5. כבה את האורות ברוומ 'ו לצרף מקור האור הלוגן ל אנדוסקופ. הפעל את מקליט הווידאו כדי ללכוד את ההליך.
6. לטבול את הקצה הדיסטלי של אנדוסקופ במים חמים למשך כמה שניות כדי למזער את הפיתוח של עיבוי על קצה זכוכית כאשר מוכנס לתוך הפה של החולדה.
7. באמצעות משוב חזותי מהצג, בקפידה להנחות את המחט לאזור הקפל השמאלי השמאלי.
8. הזמן את הזרקת הפתרון עם השלב השראה של מחזור הנשימה של בעלי חיים כדי לגשת באופן מלא לקפל ווקאלי. במהלך שלב ההשראה של הנשימה, קפל הקול נחשף במלואו.
   1. לאחר קפל ווקאלי גלוי לחלוטין, הכנס את המחט לתוך thyroarytenoid שמאל, נמצא לרוחב קצה המדיאלי הלבן של קפל ווקאלי. עם המחט במקום, לספק את הזרקת דרך דיכאון של המזרק.
9. כבה את מקור האור הלוגן על אנדוסקופ ונגן וידאו, ופנה בחזרה על roאורות אום.
10. להחזיר את החולדה לכלוב הבית שלה במקום על כרית חימום.
11. אפשר עכברוש להתאושש לפני הסרת כרית החימום. החלף מזון ומים בכלוב.
12. מעקב חולדות במשך 7 ימים לאחר ההזרקה ולאחר מכן להרדים. הסר את הגרונות עבור cryosectioning ²⁴ .

5. הרדמה של חולדות

1. להרדים חולדות עם קטמין הידרוכלוריד ו xylazine hydrochloride (100 מ"ג / 8 מ"ג לכל ק"ג משקל גוף מוזרק זריקה intraperitoneal).
2. להרדים על ידי exsanguination לאחר thoracotomy המדיאלי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

חולדות היו מורדמים לאחר שבועיים של עירוי משאבת אוסמוטי או 1 שבוע לאחר הזרקה ישירה של NTF4. Larynges נקצרו, הניח cryoprotectant (סוכרוז 30% ו 70% פוספט שנאגרו מלוחים) ולאחר מכן מקוטע סדרתי ברוחב 10 מיקרומטר עם cryostat. הזדקנות שרירי הגרון מושפעים על ידי הממשל של NTF4

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שרירי הגרון חשופים להשפעות של הזדקנות. מחקרים קודמים הראו שינויים בשרירי הגרון המזדקנים הכוללים שינויים בגודל הסיבים, מספר הסיבים הכולל, יכולת התחדשות, גודל NMJ ושינויים בכמות, בנוסף לשינויים בתפקוד הקונסטרוקלי ובמיוסין איזופורם משמרות ^{4 ,}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurotrophin 4	Pepro Tech	450-04	200 ng in 50 μL
Alzet Osmotic Pump	DURECT Corporation	2001D
30 ° endoscope	Stoltz	61029D
50 mm 30 gauge 100-μL syringe	Hamilton	84850 and 201812
saline (sodium chloride solution)	Sigma-Aldrich	S8776
ketamine hydrochloride	Henry Schein	56344
xylazine hydrochloride	Henry Schein	33198
25 G 5/8 needle	Becton-Dickinson	305901
1 mL syringe	Becton-Dickinson	309659
ophthalmic ointment	Henry Schein	8897
clippers	Oster	44-018
ethanol	Decon	2716
iodine (Betadine)	Purdue Pharma L.P.	606404
heating pad	Sunbeam	731-5
5-0 nylon suture thread	AD Surgical	PMN-518R6
crile hemostat	Fine Science Tools	13005-14
delicate suture tying forceps	Fine Science Tools	11063-07
meloxicam	Henry Schein	49756
carprofen	Merritt Veterinary Supplies	148700
antibiotic ointment	Henry Schein	57110
acepromizine Aceproject	Henry Schein	3845
isoflurane Isothesia	Henry Schein	50033
induction box (anesthetizing box)	Harvard Apparatus	50-0116
oxygen compressed tank	Scott Gross	UN1072
plexiglas platform	Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps	Fine science tools rubber	11075-00
liquid rubber for forceps above	Lowe's	42518
plastic spectula (BD syringe cut to length)	Becton-Dickinson	309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope	Kay-Pentax	RLS 9100 B
video recorder	Kay-Pentax
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389-500G
phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525	Thermo Scientific	HM 525
Gill 1 hematoxylin	VWR	10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic	Thermo Fisher Scientific	6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	S0819
Texas red-X phalloidin	Sigma-Aldrich	T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate	Thermo Fisher Scientific	B-13422
Small animal anaesthesia machine	Smiths Medical	CDS 9000