L'infusion de neurotrophine sous-cutanée sous-cutanée à l'aide de pompes osmotiques ou d'injection directe par voie musculaire améliore le vieillissement des muscles du larynx du rat

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour décrire l'utilisation de la neurotrophine 4 (NTF4) systémique et directement pour remodeler les muscles laryngés du rat.

Résumé

Le dysfonctionnement du larynx chez les personnes âgées est une cause majeure d'invalidité, des troubles de la voix à la dysphagie et à la perte de réflexes protecteurs des voies aériennes. Peu de thérapies, le cas échéant, existent qui visent le dysfonctionnement du muscle laryngien lié à l'âge. Les neurotrophines sont impliquées dans l'innervation musculaire et la différenciation des jonctions neuromusculaires (NMJ). On pense que les neurotrophines augmentent la transmission neuromusculaire en augmentant la libération des neurotransmetteurs. Les jonctions neuromusculaires (NMJ) deviennent plus petites et moins abondantes dans le vieillissement des muscles laryngés du rat, avec des signes de dénervation fonctionnelle. Nous avons exploré les effets du NTF4 pour une utilisation clinique future en tant que thérapeutique pour améliorer la fonction dans le vieillissement des muscles laryngés humains. Ici, nous fournissons le protocole détaillé pour l'application systémique et l'injection directe de NTF4 pour étudier la capacité du vieillissement du muscle laryngé du rat à remodeler en réponse à l'application NTF4. Dans cette méthode, les rats ont soit reçu NTF4 soit systémiquement via oPompe smotique ou par injection directe à travers les plis vocaux. Les muscles laryngés ont ensuite été disséqués et utilisés pour l'examen histologique de la morphologie et la dénervation liée à l'âge.

Introduction

Les muscles laryngés se contractent rapidement et constamment, et sont vulnérables aux effets néfastes du vieillissement. On pense que cette activité constante contribue aux problèmes de la voix ou à la dysphagie chez les personnes de plus de 65 ans ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . Plusieurs mécanismes moléculaires et pathophysiologiques contribuent à ce dysfonctionnement lié à l'âge. Ces mécanismes peuvent inclure le remodelage de la muqueuse laryngée, l'atrophie ou la perte de fibres musculaires, le manque de régénération ou d'atrophie des fibres musculaires, ce qui entraîne l'inclinaison des plis vocaux et l'incapacité de la fermeture des glottes ^{8 , 9 , 10 , 11} . Il n'y a pas de thérapie médicale prouvée à ce moment qui peut comPrévenir ou réhabiliter complètement ces changements liés à l'âge dans ces muscles.

La modulation de l'efficacité de la transmission neuromusculaire peut influencer grandement la performance neuromoteuse. La famille des neurotrophines comprend le facteur de croissance nerveuse (NGF), le facteur de croissance du nerf dérivé du cerveau (BDNF), la neurotrophine 3 (NTF3) et le NTF4 ^{12 , 13} . Les neurotrophines ont montré qu'ils modulent l'efficacité synaptique ^{1 , 4} . Le facteur de croissance des hépatocytes, le facteur de croissance transformant bêta et le facteur de croissance des fibroblastes ont récemment été utilisés chez les humains pour le traitement des cicatrices de plomb vocal de ^{15 à 17 ans} . NTF4 régule également l'efficacité NMJ; Les souris dépourvues de NTF4 montrent des NMJ désassemblés ^{11 , 18 , 19} . Ces études conduisent à des effets prometteurs du traitementT des troubles du muscle laryngien vieillissant et la dénervation avec des facteurs de croissance.

La thérapie par injection directe aux tissus des plis vocaux n'est pas sans précédent chez les humains. Par exemple, les injections locales de toxine botulique sont actuellement utilisées comme traitement efficace pour les troubles du mouvement neurologique qui affectent les muscles du larynx, tels que la dysphonie spasmodique et la paralysie bilatérale du nerf laryngé récurrent ^{20 , 21} . L'hydrogel d'acide hyaluronique est un autre injectable, qui est utilisé pour traiter l'affection des plis vocaux et l'insuffisance glotale ^{22 , 23} . La laryngoplastie par injection peut être utilisée pour traiter une variété de troubles de la communication ²⁴ . Ces méthodes d'injection directe sont prometteuses pour améliorer la fonction vocale et la déglutition dans les populations vieillissantes.

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Protocole

Utilisez les rats mâles Fischer 344-Brown Norway à 6 et 30 mois pour ce protocole. Les rats ont été obtenus auprès de la colonie de rongeurs de l'Institut national de vieillissement. Nous avons utilisé des rats pour cette étude parce que la structure du larynx de rat est similaire à celle de l'humain, servant fonctionnellement pour la protection des voies respiratoires et les vocalisations spécifiques aux espèces. Cette étude a été réalisée conformément à la Politique de PHS sur les soins de santé et l'utilisation des animaux de laboratoire, Le Guide NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et la Loi sur le bien-être animal (7 USC et suivants); Le protocole d'utilisation des animaux a été approuvé par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université du Kentucky.

1. Anesthésie des rats

1. Préparer les anesthésiques en mélangeant du chlorhydrate de kétamine (anesthésie dissociative) et du chlorhydrate de xylazine (sédatif et analgésique) dans une solution saline tamponnée. Les concentrations de kétamine et de xylazine dans la solution finale sont de 100 mg / 8 mg par kgPoids corporel respectivement.
2. Injecter les anesthésiques dans le rat par administration intrapéritonéale en utilisant une seringue à l'aiguille de 25 G.
3. Déterminer que le rat est suffisamment anesthésié en pinçant l'orteil ou le pied avec une pince. Si le rat ne réagit pas au pincement, la chirurgie peut commencer. Si le rat réagit à la pincée de l'orteil avec des contractions réflexes ou musculaires, attendez 1-2 minutes et répétez le test de pincement. Si le rat réagit à nouveau, remplacez le rat par un nouvel animal et répétez la procédure à partir de l'étape 1.2.
4. Appliquer une pommade ophtalmique aux yeux du rat, après que le rat est immobile, pour éviter que les cornées ne se dessèchent.

2. Implantation de pompe osmotique

1. Placez le ventral du rat sur la zone chirurgicale aseptique. Administrer le meloxicam comme médicament pré-anesthésique. Administrer par voie intrapéritonéale à une dose de 1 à 4 mg / kg de poids corporel à l'aide d'une seringue à l'aiguille de 25 G.
2. Utilisez des tondeuses pour enlever une approximationUn carré de fourrure de 1 "x 1" du dos du cou et environ 1 "d'espace caudal entre les épaules. Raser le plus près possible de la peau.
3. Mouiller le dos et le cou avec de l'éthanol désinfectant (70%).
4. Après le rasage, frottez l'aspect dorsal du cou avec 3 gommages en succession d'alcool iodé avec de l'alcool.
5. Maintenir la température corporelle du rat en le plaçant sur un coussin chauffant réglé à 34 ° C.
6. Remplissez les pompes osmotiques préparées de manière aseptique avec 50 μL de NTF4 ou solution saline pour le traitement NTF4 systémique ( Figure 1 ).
   1. Utilisez un scalpel pour faire une incision horizontale d'environ 2 cm de large dans la peau, juste crânienne dans l'espace entre l'omoplate. Soulevez le bord postérieur de l'incision avec une pince avec une seule main tout en insérant la pointe des hémostats et en poussant doucement à la suite de l'incision.
   2. Après que la pointe des hémostats soit d'environ 2 cm cCourants à l'incision, ouvrez les poignées sur les hémostats, élargissant les pointes pour former une "poche" creuse sous-cutanée sur le site de l'incision. Ce sera le site de placement de la pompe.
7. Orientez le portail de livraison de la pompe avant d'être inséré pour minimiser toute interaction du NTF4 et la guérison du site d'incision de poche.
8. Livrer 50 μL de solution saline NTF4 pendant 7 14 jours. Le groupe de 7 jours a reçu 6,72 mg / jour de NTF4 pour une dose totale de 47,04 mg. Le groupe de 14 jours a reçu 6,72 mg / jour pour une dose totale de 94,08 mg de NTF4 ²⁵ .
9. Utilisez un fil de suture en nylon 5-0, des hémastes et des pinces pour fermer l'incision pour le placement de la pompe.
10. Observez les rats pendant au moins 30 minutes à mesure qu'ils se remettent de l'anesthésie. Les critères d'achèvement de la surveillance incluent l'animal en train de devenir actif, le déplacement de la cage, l'eau potable et le début d'autres activités normales telles que le toilettage.
11. Surveiller les animaux tous les joursPendant la première semaine en observant la cicatrisation du site chirurgical, la consommation normale d'alimentation et d'eau, le passage d'urine / excréments et tout signe de comportement anormal du stress, de la douleur ou d'autres complications post-opératoires.
12. Si le rat semble souffrir ou détresse, fournir au rat une injection sous-cutanée de 5 mg / kg de carprofène une fois toutes les 24 h pendant 5 jours pour soulager la douleur.
13. S'il semble y avoir une infection, consultez un vétérinaire afin de s'assurer que la plaie se guérit correctement.
14. Selon le groupe expérimental sur lequel le rat est entré, enlever la suture de nylon 5-0 7-10 jours après la chirurgie pour éviter l'irritation du fil.

3. Anesthésie des rats pour injection directe

1. Retenir les aliments des rats la veille de la procédure. Cela garantit qu'il n'y a pas de nourriture pour bloquer l'endoscope ou l'aiguille d'injection.
2. Peser les rats et préparer l'accepromazine 1-2 mg / kg de poids corporel. Injecter par voie intramusculaire (l'emplacement IM est leMuscle thyroaryténoïde gauche).
3. Placez le rat dans la boîte d'induction. Induire l'anesthésie dans la boîte d'induction avec 5% d'isoflurane et 1 LO ₂ .
4. Déplacez le rat à un cône de nez avec 2% d'isoflurane et 600 ml de O ₂ .
5. Déterminer que le rat est suffisamment anesthésié en pinçant l'orteil ou le pied avec une pince. Si le rat ne réagit pas au pincement, le protocole d'injection peut commencer. Si le rat réagit à la pincée de l'orteil avec des contractions réflexes ou musculaires, attendez 1-2 minutes et répétez le test de pincement. Si le rat réagit à nouveau, remplacez le rat par un nouvel animal et répétez la procédure à partir de l'étape 3.4.

4. Injection directe et visualisation

1. Placer des doses de 50 μL préparées de manière aseptique contenant du NTF4 ou une solution saline dans un bain de H ₂ O réglé à 25 ° C pendant 30 minutes avant l'injection.
2. Placez le rat en position couchée et couchée sur une plate-forme en plexiglas ( figure 2 ). SusPendent le rat dans la position inclinée à partir de leurs incisives supérieures frontales par un fil de guidage accroché sur le dessus de la plate-forme.
3. Fixez une seringue de 50 mm, 30 jauges, 100 μL à un endoscope sinusal de 1,9 mm, 30 ° ( Figure 3 ).
   REMARQUE: L'ensemble de la seringue est fixé par un gabarit qui maintient fermement la canule à la paroi externe de l'endoscope. L'endoscope permet de visualiser les plis vocaux et le guidage de la seringue par voie intra-orale. La position de la pointe de la canule est ajustée avant chaque animal pour s'assurer que la pointe est complètement et clairement visible via la vue endoscopique ( Figure 4 ).
4. Utilisez une pince à pointe en caoutchouc pour étendre la langue et la déplacer latéralement. Ensuite, insérez un spéculum en plastique pour maintenir la perméabilité par voie orale. Faire le spéculum d'un cylindre de seringue plastique de 5 mL qui est coupé sur une longueur de 1,5 à 2 cm, les bords découpés étant ébavurés et polis lisses.
5. Éteignez les lumières dans le rooM et attacher une source de lumière halogène à l'endoscope. Activez le magnétoscope pour capturer la procédure.
6. Immergez l'extrémité distale de l'endoscope dans de l'eau tiède pendant quelques secondes pour minimiser le développement de la condensation sur la pointe du verre lorsqu'il est inséré dans la bouche du rat.
7. En utilisant le retour visuel du moniteur, orientez soigneusement l'aiguille vers la zone du pli vocal gauche.
8. Temps d'injection de la solution avec la phase inspiratoire du cycle de respiration des animaux pour accéder pleinement au pli vocal. Pendant la phase inspiratoire de la respiration, le pli vocal est pleinement exposé.
   1. Une fois que le pli vocal est complètement visible, insérez l'aiguille dans le thyroarythénoïde gauche, qui se trouve latéralement au bord médian blanc du pli vocal. Avec l'aiguille en place, transmettre l'injecte par dépression de la seringue.
9. Éteignez la source de lumière halogène sur l'endoscope et le lecteur vidéo, et tournez-vous sur le roOm lights.
10. Retournez le rat à sa cage de maison et placez-le sur un coussin chauffant.
11. Laisser le rat se rétablir avant de le retirer du coussin chauffant. Remplacez les aliments et l'eau dans la cage.
12. Surveiller les rats pendant 7 jours après l'injection puis l'euthanasier. Supprimer les larynges pour la cryotypie ²⁴ .

5. Euthanisation des rats

1. Anesthésier les rats avec du chlorhydrate de kétamine et du chlorhydrate de xylazine (100 mg / 8 mg par kg d'injection intrapéritonéale injectée par le poids corporel).
2. Éuthaniser par une exsanguination suite à une thoracotomie médiale.

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Résultats

Les rats ont été euthanasiés après 2 semaines de perfusion de pompe osmotique ou 1 semaine après injection directe de NTF4. Les larynges ont été récoltés, placés en cryoprotecteur (30% de saccharose et 70% de solution salée tamponnée au phosphate), puis séchés en série sur 10 μm de large avec un cryostat. Le vieillissement des muscles laryngés est affecté par l'administration de NTF4 ²⁵ . En plus du rat jeune et ancien, nous avons comparé le...

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Discussion

Les muscles laryngés sont vulnérables aux effets défavorables du vieillissement. Des études antérieures ont démontré des changements dans les muscles laryngés vieillissants qui incluent des changements dans la taille de la fibre, le nombre total de fibres, la capacité de régénération, la taille NMJ et les changements de quantité, en plus des variations de la fonction contractile et des changements d'isoforme de myosine ^{4 , 11 ,}

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurotrophin 4	Pepro Tech	450-04	200 ng in 50 μL
Alzet Osmotic Pump	DURECT Corporation	2001D
30 ° endoscope	Stoltz	61029D
50 mm 30 gauge 100-μL syringe	Hamilton	84850 and 201812
saline (sodium chloride solution)	Sigma-Aldrich	S8776
ketamine hydrochloride	Henry Schein	56344
xylazine hydrochloride	Henry Schein	33198
25 G 5/8 needle	Becton-Dickinson	305901
1 mL syringe	Becton-Dickinson	309659
ophthalmic ointment	Henry Schein	8897
clippers	Oster	44-018
ethanol	Decon	2716
iodine (Betadine)	Purdue Pharma L.P.	606404
heating pad	Sunbeam	731-5
5-0 nylon suture thread	AD Surgical	PMN-518R6
crile hemostat	Fine Science Tools	13005-14
delicate suture tying forceps	Fine Science Tools	11063-07
meloxicam	Henry Schein	49756
carprofen	Merritt Veterinary Supplies	148700
antibiotic ointment	Henry Schein	57110
acepromizine Aceproject	Henry Schein	3845
isoflurane Isothesia	Henry Schein	50033
induction box (anesthetizing box)	Harvard Apparatus	50-0116
oxygen compressed tank	Scott Gross	UN1072
plexiglas platform	Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps	Fine science tools rubber	11075-00
liquid rubber for forceps above	Lowe's	42518
plastic spectula (BD syringe cut to length)	Becton-Dickinson	309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope	Kay-Pentax	RLS 9100 B
video recorder	Kay-Pentax
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389-500G
phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525	Thermo Scientific	HM 525
Gill 1 hematoxylin	VWR	10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic	Thermo Fisher Scientific	6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	S0819
Texas red-X phalloidin	Sigma-Aldrich	T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate	Thermo Fisher Scientific	B-13422
Small animal anaesthesia machine	Smiths Medical	CDS 9000