浸透圧ポンプまたは直接的筋肉注射を用いる皮下ニューロトロフィン4注入は、老齢ラット喉頭筋を増強する

要約

ここでは、ラットの老化喉頭筋をリモデリングするために、ニューロトロフィン4（NTF4）の使用を全身的かつ直接的に記述するためのプロトコールを提示する。

要約

高齢者における喉頭機能不全は、声調障害から嚥下障害および気道保護反射障害の主要な原因である。年齢関連の喉頭筋機能不全を対象とする治療法は、あるとしてもごくわずかです。ニューロトロフィンは、神経筋接合部（NMJ）の筋肉の神経支配および分化に関与する。神経栄養因子は、神経伝達物質放出を増加させることによって神経筋伝達を増強すると考えられている。神経筋接合部（NMJ）は、ラットの喉頭筋の老化において、機能低下を示す証拠とともに、より小さく、豊富ではない。私たちは、ヒトの喉頭筋の高齢化における機能を改善するための治療薬としての将来の臨床用途へのNTF4の影響を探った。ここでは、NTF4の適用に応答してラット喉頭筋の老化能力を調べるための、NTF4の全身投与および直接注射のための詳細なプロトコールを提供する。この方法では、ラットはNTF4を全身的に oまたは声帯を介して直接注入することによって行われる。喉頭筋を解剖し、形態学および年齢関連の脱神経の組織学的検査に用いた。

概要

喉頭の筋肉は急速かつ一貫して収縮し、老化の悪影響を受け易い。この一定の活動は、65歳以上の人の^{1日 、 2日 、 3日 、 4日 、 5日 、 6日 、 7日に}観察される声の問題または嚥下障害に寄与すると考えられている。いくつかの分子的および病態生理学的機序がこの年齢関連機能不全に寄与する。これらのメカニズムには、喉頭粘膜の改造、筋繊維萎縮または喪失、筋繊維再生の欠如、または声帯の屈曲および声門閉鎖の不可能化を引き起こす萎縮が含まれ得る（8,9,10,11）。現時点で実証された治療法はありませんこれらの筋肉の年齢に関連した変化を徹底的に防止またはリハビリします。

神経筋伝達の有効性の調節は、神経運動の性能に大きく影響する可能性がある。ニューロトロフィンのファミリーには、神経成長因子（NGF）、脳由来神経成長因子（BDNF）、ニューロトロフィン3（NTF3）およびNTF4 ^{12,13が含まれる} 。ニューロトロフィンは、シナプスの効力を調節することが示されている^1,4 。肝細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータおよび線維芽細胞成長因子は、最近、ヒトにおいて声帯瘢痕の治療のために使用されている15-17。 NTF4はNMJの有効性も規制している。 NTF4を欠くマウスは、分解されたNMJ11,18,19を示す。これらの研究は、治療薬の有望な効果をもたらす老人性喉頭筋障害の老化および成長因子による衰弱。

声帯の組織への直接注射療法は、ヒトにおいて前例のないことではない。例えば、ボツリヌス毒素の局所注入は、現在、喉頭の筋肉に影響を与える神経運動障害、例えば痙攣性発声障害および両側性再発性喉頭神経麻痺に対する有効な治療として使用されている^20,21 。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、別の注射剤であり、声帯怖さと声門不全を治療するために使用される^22,23 。注射喉頭形成術は、様々なコミュニケーション障害を治療するために使用することができる²⁴ 。これらの直接注射方法は、高齢者の声機能および嚥下を改善することを約束している。

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プロトコル

このプロトコールには、オスのFischer 344-Brownノルウェーラットを6ヶ月齢および30ヶ月齢で使用する。ラットは国立老化げっ歯類コロニーから入手した。ラット喉頭の構造はヒトのものと類似しており、機能的に気道保護および種特異的発声に役立つので、この研究のためにラットを使用した。この研究は、実験動物の人間のケアおよび使用に関するPHS方針に従って行われ、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイド、および動物福祉法（7 USC以下）;動物使用プロトコールは、ケンタッキー大学の施設動物用ケアおよび使用委員会（IACUC）によって承認された。

1.ラットの麻酔

1. 緩衝生理食塩水中でケタミン塩酸塩（解離麻酔薬）と塩酸キシラジン（鎮静薬と鎮痛薬）を混合して麻酔薬を調製する。最終溶液中のケタミンおよびキシラジンの濃度は、100mg / 8mg / kg体重をそれぞれ測定した。
2. 25Gの針を備えた注射器を用いて腹腔内投与によりラットに麻酔薬を注入する。
3. つま先または足を鉗子で挟むことによってラットが十分に麻酔されていることを確認する。ラットがピンチに反応しない場合、手術が始まります。ラットが反射または筋収縮を伴ってつま先のつまみに反応する場合は、1-2分待ってピンチ試験を繰り返します。ラットが再び反応する場合は、ラットを新しい動物に交換し、ステップ1.2から始まる手順を繰り返す。
4. 角膜が乾燥するのを防ぐために、ラットが動かなくなった後、ラットの眼に眼科用軟膏を塗布する。

2.浸透圧ポンプインプラント

1. ラットを腹側の無菌手術領域に配置する。メラキシカムを麻酔薬として投与する。 25Gの針を備えた注射器を使用して体重1kgあたり1-4mgの用量で腹腔内投与する。
2. クリッパーを使って近似値を削除する首の後ろから毛皮を1 "x 1"平方に、肩の間に約1 "の尾を付けてください。できるだけ皮膚に近づけてください。
3. エタノール（70％）を消毒して背中と首を濡らします。
4. シェービングした後、アルコールでヨウ素 - アルコール仕上げをしながら、3回のスクラブで首の背面を擦ってください。
5. 34℃に設定された加熱パッド上に置くことによってラットの体温を維持する。
6. 全身NTF4処理のために、50μLのNTF4または生理食塩水で無菌的に調製した浸透圧ポンプを充填する（ 図1 ）。
   1. メスを使用して、肩甲骨間の空間に頭皮だけで約2cmの幅の水平切開を行う。片側の手で鉗子で切開の後端を持ち上げながら、止血の先端を挿入し、切開の後部を静かに押す。
   2. 止血鉗子の先端が約2cm cの後喉頭部を切開部に切開し、止血鉗子のハンドルを開き、切開部の皮下に中空の「ポケット」を形成するために先端を広げる。これはポンプの設置場所になります。
7. NTF4とポケット切開部位の治癒との相互作用を最小限にするために、挿入時にポンプ送達ポータルの端部を先に向けます。
8. いずれかのNTF4生理食塩水50μLを7 14日間送達する。 7日群には6.72mg /日のNTF4を投与し、総投与量は47.04mgであった。 14日群は6.72mg /日を受け、総用量94.08mgのNTF4 ^{25を与えた} 。
9. 5-0ナイロン縫合糸、止血鉗子を使用して、ポンプを配置するために作られた切開を閉じる。
10. 彼らが麻酔から回復するにつれて、ラットを最低30分間観察する。モニタリングの完了基準は、動物が活動的になり、ケージの周りを移動し、水を飲み、グルーミングなどの他の正常な活動を開始することを含む。
11. 動物を毎日監視する最初の1週間は、手術部位の治癒、正常な飼料および水の消費、尿/糞の通過、およびストレス、痛みまたは他の術後合併症の異常な行動徴候を観察することにより、
12. ラットに痛みや苦痛があると思われる場合は、痛みを和らげるために、カルプロフェンの5mg / kg皮下注射を24時間毎に5日間まで与える。
13. 感染が疑われる場合は、獣医に相談して、傷が適切に治癒するようにしてください。
14. ラットが入っている実験群に応じて、糸からの刺激を防ぐために、手術の7-10日後に5-0ナイロン縫合糸を外す。

3.直接注射用ラットの麻酔

1. 処置の前夜にラットの食物を控える。これにより、内視鏡または注射針を塞ぐ食物がないことが保証される。
2. ラットを秤量し、アセプロマジン1〜2mg / kg体重を調製する。筋肉内に注射する（IMの場所は甲状腺機能亢進症の筋肉を残した）。
3. 誘導箱にラットを置きます。 5％イソフルランおよび1 LO ₂を有する誘導ボックス内の麻酔を誘導する。
4. 2％イソフルランおよび600mLのO ₂を用いてラットをノーズコーンに移動する。
5. つま先または足を鉗子で挟むことによってラットが十分に麻酔されていることを確認する。ラットがピンチに反応しない場合、注入プロトコールを開始することができる。ラットが反射または筋収縮を伴ってつま先のつまみに反応する場合は、1-2分待ってピンチ試験を繰り返します。ラットが再び反応する場合、ラットを新しい動物に交換し、ステップ3.4から手順を繰り返す。

直接注入および視覚化

1. NTF4または生理食塩水を含む無菌的に調製した50μL用量を、注入前に25℃に設定したH ₂ O浴に30分間置く。
2. プレキシガラスプラットホーム上の仰臥位およびリクライニング位置にラットを配置する（ 図2 ）。サスラットを前傾姿勢で、プラットホームの頂部を横切って引っ張られたガイドワイヤーを介して、前頭部の切歯から懸垂する。
3. 50 mm、30ゲージ、100μLシリンジを1.9 mm、30°の洞内視鏡に取り付けます（ 図3 ）。
   注：シリンジアセンブリは、カニューレを内視鏡の外壁にしっかりと保持する治具を介して取り付けられています。内視鏡は、声帯の視覚化および注射器の口腔内誘導を可能にする。カニューレ先端の位置は、各動物の前に調整され、先端が内視鏡視野（ 図4 ）によって完全かつ明確に視認可能であることを保証する。
4. 舌を伸ばして横に動かすには、ゴムで先端を覆われた鉗子のペアを使用します。その後、口腔開存性を維持するためにプラスチックの鏡を挿入します。 1.5〜2 cmの長さに切断された5 mLのプラスチックシリンジバレルから検鏡を行い、切断された端をバリ取りして滑らかに研磨する。
5. ロアーのライトを消すハロゲン光源を内視鏡に取り付ける。手順をキャプチャするには、ビデオレコーダーをオンにします。
6. ラットの口に挿入したときにガラス先端に結露が発生するのを最小限にするために、内視鏡の遠位端を温水に数秒間浸します。
7. モニターからの視覚フィードバックを使用して、針を注意深く左の声帯の領域に導く。
8. 声帯に完全にアクセスするために、動物の呼吸サイクルの吸息段階で、溶液の注入に時間を合わせる。呼吸の吸気段階の間、声帯は完全に露出される。
   1. 声帯が完全に見えるようになったら、針を声帯の白い内側の縁の横方向に見られる左甲状腺腫に挿入します。注射針を適所に置いて、シリンジの押し込みによって注射液を送達する。
9. 内視鏡とビデオプレーヤーのハロゲン光源をオフにして、オムライト。
10. ラットをそのホームケージに戻し、加熱パッド上に置く。
11. 加熱パッドから取り出す前にラットを回復させる。ケージ内の食品と水を交換してください。
12. 注射後7日間ラットをモニターし、安楽死させる。凍結切除のための喉頭を取り除く²⁴ 。

5.ラットの安楽死

1. ラットをケタミン塩酸塩およびキシラジン塩酸塩（100mg / kg体重当たり8mgの腹腔内注射）で麻酔する。
2. 内側のthoracotomy後に放血によって安楽死させる。

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結果

2週間の浸透圧ポンプ注入後またはNTF4の直接注入後1週間後にラットを安楽死させた。喉頭を収穫し、凍結保護剤（30％スクロースおよび70％リン酸緩衝生理食塩水）に入れ、次にクライオスタットで10μmの幅で連続的に切片化した。高齢の喉頭筋はNTF4の投与によって影響を受ける²⁵ 。若年ラットおよび老齢ラットに加えて、我々は、甲状腺機能亢進?...

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ディスカッション

喉頭の筋肉は、老化の好ましくない影響を受け易い。以前の研究では、収縮機能およびミオシンアイソフォームシフトの変化に加えて、繊維サイズの変化、繊維の総数、再生能力、NMJサイズおよび量の変化を含む老齢喉頭筋の変化が示されている4,11,27,30,31 。高齢の喉頭筋は、ニューロトロフィンの適用によって変化させることができる。これらの変化は容易に測定することができる。した?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurotrophin 4	Pepro Tech	450-04	200 ng in 50 μL
Alzet Osmotic Pump	DURECT Corporation	2001D
30 ° endoscope	Stoltz	61029D
50 mm 30 gauge 100-μL syringe	Hamilton	84850 and 201812
saline (sodium chloride solution)	Sigma-Aldrich	S8776
ketamine hydrochloride	Henry Schein	56344
xylazine hydrochloride	Henry Schein	33198
25 G 5/8 needle	Becton-Dickinson	305901
1 mL syringe	Becton-Dickinson	309659
ophthalmic ointment	Henry Schein	8897
clippers	Oster	44-018
ethanol	Decon	2716
iodine (Betadine)	Purdue Pharma L.P.	606404
heating pad	Sunbeam	731-5
5-0 nylon suture thread	AD Surgical	PMN-518R6
crile hemostat	Fine Science Tools	13005-14
delicate suture tying forceps	Fine Science Tools	11063-07
meloxicam	Henry Schein	49756
carprofen	Merritt Veterinary Supplies	148700
antibiotic ointment	Henry Schein	57110
acepromizine Aceproject	Henry Schein	3845
isoflurane Isothesia	Henry Schein	50033
induction box (anesthetizing box)	Harvard Apparatus	50-0116
oxygen compressed tank	Scott Gross	UN1072
plexiglas platform	Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps	Fine science tools rubber	11075-00
liquid rubber for forceps above	Lowe's	42518
plastic spectula (BD syringe cut to length)	Becton-Dickinson	309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope	Kay-Pentax	RLS 9100 B
video recorder	Kay-Pentax
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389-500G
phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525	Thermo Scientific	HM 525
Gill 1 hematoxylin	VWR	10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic	Thermo Fisher Scientific	6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	S0819
Texas red-X phalloidin	Sigma-Aldrich	T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate	Thermo Fisher Scientific	B-13422
Small animal anaesthesia machine	Smiths Medical	CDS 9000