La infusión subcutánea de neurotrofina 4 con bombas osmóticas o inyección muscular directa mejora el envejecimiento de los músculos laríngeos de la rata

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para describir el uso de la neurotrofina 4 (NTF4) sistemática y directamente para remodelar los músculos laríngeos envejecidos en ratas.

Resumen

La disfunción laríngea en los ancianos es una causa importante de discapacidad, desde trastornos de voz hasta disfagia y pérdida de los reflejos protectores de las vías respiratorias. Existen pocas terapias, si las hay, que apuntan a la disfunción del músculo laríngeo relacionada con la edad. Las neurotrofinas participan en la inervación muscular y la diferenciación de las uniones neuromusculares (NMJs). Se cree que las neurotrofinas potencian la transmisión neuromuscular aumentando la liberación del neurotransmisor. Las uniones neuromusculares (NMJs) se hacen más pequeñas y menos abundantes en los músculos laríngeos de rata envejecidos, con evidencia de denervación funcional. Exploramos los efectos de NTF4 para uso clínico futuro como un terapéutico para mejorar la función en el envejecimiento de los músculos laríngeos humanos. Aquí, proporcionamos el protocolo detallado para la aplicación sistémica y la inyección directa de NTF4 para investigar la capacidad de envejecimiento de la rata músculo laríngeo para remodelar en respuesta a la aplicación de NTF4. En este método, las ratas recibieron NTF4 ya sea sistemáticamente a través de oSmotic o por inyección directa a través de los pliegues vocales. Luego se diseccionaron los músculos laríngeos y se utilizaron para el examen histológico de morfología y la denervación relacionada con la edad.

Introducción

Los músculos laríngeos se contraen rápida y consistentemente y son vulnerables a los efectos adversos del envejecimiento. Se cree que esta actividad constante contribuye a problemas de voz o disfagia observados en personas mayores de 65 años ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . Varios mecanismos moleculares y fisiopatológicos contribuyen a esta disfunción relacionada con la edad. Estos mecanismos pueden incluir la remodelación de la mucosa laríngea, la atrofia o pérdida de las fibras musculares, la falta de regeneración de las fibras musculares o la atrofia que provoca el arqueamiento de los pliegues vocales y la incapacidad del cierre de la glotis ^{8 , 9 , 10 , 11} . No hay terapia médica comprobada en este momento que pueda comPara prevenir o rehabilitar estos cambios relacionados con la edad en estos músculos.

La modulación de la efectividad de la transmisión neuromuscular puede influir en gran medida en el rendimiento neuromotor. La familia de neurotrofinas incluye el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor de crecimiento nervioso derivado del cerebro (BDNF), la neurotrofina 3 (NTF3) y NTF4 ^{12 , 13} . Se ha demostrado que las neurotrofinas modulan la eficacia sináptica ^{1 , 4} . El factor de crecimiento de los hepatocitos, el factor de crecimiento transformante beta y el factor de crecimiento de los fibroblastos se han utilizado recientemente en seres humanos para el tratamiento de las cicatrices de los pliegues vocales ^{15 - 17} . NTF4 también regula la eficacia de NMJ; Los ratones que carecen de NTF4 muestran NMJs desmontados ^{11 , 18 , 19} . Estos estudios llevan a efectos prometedores de tratamientosT de trastornos del músculo laríngeo envejecido y denervación con factores de crecimiento.

La terapéutica de inyección directa a los tejidos de los pliegues vocales no es sin precedentes en los seres humanos. Por ejemplo, las inyecciones locales de toxina botulínica se utilizan actualmente como un tratamiento eficaz para los trastornos del movimiento neurológico que afectan a los músculos de la laringe, como la disfonía espasmódica y la parálisis bilateral del nervio laríngeo recurrente ^{20 , 21} . El hidrogel de ácido hialurónico es otro inyectable, que se utiliza para tratar la cicatrización del pliegue vocal y la insuficiencia glotal ^{22 , 23} . La laringoplastia por inyección se puede utilizar para tratar una variedad de trastornos de la comunicación ²⁴ . Estos métodos de inyección directa prometen mejorar la función vocal y tragar en las poblaciones de envejecimiento.

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Protocolo

Utilizar las ratas macho Fischer 344-Brown Noruega a los 6 y 30 meses de edad para este protocolo. Las ratas se obtuvieron de la colonia de roedores del Instituto Nacional de Envejecimiento. Utilizamos las ratas para este estudio debido a que la estructura de la laringe de rata es similar a la del ser humano, sirviendo funcionalmente para la protección de las vías respiratorias y las vocalizaciones específicas de cada especie. Este estudio se realizó de acuerdo con la Política PHS sobre Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio, La Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Ley de Bienestar Animal (7 USC et seq.); El protocolo de uso animal fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Kentucky.

1. Anestesia de Ratas

1. Prepare los anestésicos mezclando clorhidrato de ketamina (anestésico disociativo) e hidrocloruro de xilazina (sedante y analgésico) en solución salina tamponada. Las concentraciones de ketamina y xilazina en la solución final son 100 mg / 8 mg por kgPeso corporal respectivamente.
2. Inyectar los anestésicos en la rata por administración intraperitoneal usando una jeringa con una aguja de 25 G.
3. Determine que la rata está suficientemente anestesiada pinchando el dedo del pie o el pie con fórceps. Si la rata no reacciona al pellizco, entonces la cirugía puede comenzar. Si la rata reacciona a la pinza del dedo del pie con contracciones reflejas o musculares, espere 1-2 min y repita la prueba de pellizco. Si la rata reacciona de nuevo, sustituir la rata con un nuevo animal y repetir el procedimiento a partir de la etapa 1.2.
4. Aplique un ungüento oftálmico a los ojos de la rata, después de que la rata esté inmóvil, para evitar que las córneas se sequen.

2. Implantación de la bomba osmótica

1. Coloque la rata ventral en el área quirúrgica aséptica. Administrar meloxicam como medicamento preanestésico. Administrar intraperitonealmente a una dosis de 1-4 mg / kg de peso corporal usando una jeringa con una aguja de 25 G.
2. Utilice las podadoras para quitar una aproximaTely 1 "x 1" cuadrado de piel de la parte posterior del cuello, y aproximadamente 1 "caudal de espacio entre los hombros.Afeitar tan cerca de la piel como sea posible.
3. Moje la espalda y el cuello con etanol desinfectante (70%).
4. Después del afeitado, frote el aspecto dorsal del cuello con 3 matorrales en sucesión de alcohol yodado con alcohol.
5. Mantenga la temperatura corporal de la rata colocándola sobre una almohadilla calentadora ajustada a 34 ° C.
6. Llenar las bombas osmóticas preparadas asépticamente con 50 μL de NTF4 o solución salina para el tratamiento sistémico con NTF4 ( Figura 1 ).
   1. Utilice un bisturí para hacer una incisión horizontal de aproximadamente 2 cm de ancho a través de la piel, sólo craneal al espacio entre las escápulas. Levantar el borde posterior de la incisión con una pinza con una mano mientras se inserta la punta de los hemostatos y empujar suavemente posterior a la incisión.
   2. Después de la punta de los hemostatos es de aproximadamente 2 cm cRanial a la incisión, abrir las manijas en los hemostatos, la expansión de las puntas para formar un hueco "bolsillo" subcutánea a la incisión sitio. Este será el sitio de colocación de la bomba.
7. Oriente el extremo del portal de suministro de la bomba primero al insertarlo para minimizar cualquier interacción del NTF4 y la cicatrización del sitio de la incisión del bolsillo.
8. Entregar 50 μL de solución salina NTF4 durante 7 14 días. El grupo de 7 días recibió 6,72 mg / día de NTF4 para una dosis total de 47,04 mg. El grupo de 14 días recibió 6,72 mg / día para una dosis total de 94,08 mg de NTF4 [ ^25] .
9. Utilice hilo de sutura de nylon 5-0, hemostatos y fórceps para cerrar la incisión para la colocación de la bomba.
10. Observar las ratas durante un mínimo de 30 min como se recuperan de la anestesia. Los criterios para completar el monitoreo incluyen el animal que se hace activo, moviéndose alrededor de la jaula, bebiendo agua, y comenzando otras actividades normales tales como aseo.
11. Monitoree los animales diariamenteDurante la primera semana observando la curación del sitio quirúrgico, el consumo normal de alimento y agua y el paso de orina / heces, y cualquier signo de comportamiento anormal de estrés, dolor u otras complicaciones postoperatorias.
12. Si la rata parece tener dolor o angustia, proporcione a la rata una inyección subcutánea de 5 mg / kg de carprofeno una vez cada 24 h durante hasta 5 días para aliviar el dolor.
13. Si parece haber una infección, consulte a un veterinario para asegurarse de que la herida cicatriza correctamente.
14. Dependiendo de qué grupo experimental de la rata adentro, quite la sutura de nylon 5-0 7-10 días después de la cirugía para prevenir la irritación del hilo.

3. Anestesia de Ratas para Inyección Directa

1. Retirar los alimentos de las ratas la noche antes del procedimiento. Esto asegura que no hay alimento para bloquear el endoscopio o la aguja de inyección.
2. Pesar las ratas y preparar acepromazina 1-2 mg / kg de peso corporal. Inyectar por vía intramuscular (la localización IM es laMúsculo tireoaritenoideo izquierdo).
3. Coloque la rata en la caja de inducción. Inducir la anestesia en la caja de inducción con 5% de isoflurano y 1 LO2.
4. Mueva la rata a un cono de la nariz con isoflurano al 2% y 600 ml de O ₂ .
5. Determine que la rata está suficientemente anestesiada pinchando el dedo del pie o el pie con fórceps. Si la rata no reacciona al pellizco, entonces el protocolo de inyección puede comenzar. Si la rata reacciona a la pinza del dedo del pie con contracciones reflejas o musculares, espere 1-2 min y repita la prueba de pellizco. Si la rata reacciona de nuevo, reemplace la rata con un nuevo animal y repita el procedimiento comenzando desde el paso 3.4.

4. Inyección directa y visualización

1. Colocar las dosis preparadas asépticamente de 50 μl que contengan NTF4 o solución salina en un baño de H ₂ O fijado a 25 ° C durante 30 minutos antes de la inyección.
2. Coloque la rata en posición supina y reclinada sobre una plataforma de plexiglás ( Figura 2 ). SusPend la rata en la postura reclinada de sus incisivos superiores frontales a través de un alambre guía amarrado a través de la parte superior de la plataforma.
3. Conecte una jeringa de 50 mm, calibre 30, de 100 μL a un endoscopio sinusal de 1,9 mm, 30 ° ( Figura 3 ).
   NOTA: El conjunto de la jeringa está unido a través de una plantilla que sujeta la cánula firmemente a la pared externa del endoscopio. El endoscopio permite la visualización de los pliegues vocales y la guía de la jeringuilla por vía intraoral. La posición de la punta de la cánula se ajusta antes de cada animal para asegurar que la punta sea totalmente y claramente visible a través de la vista endoscópica ( Figura 4 ).
4. Use un par de pinzas con punta de goma para extender la lengua y moverla lateralmente. Después, insertar un espéculo de plástico para mantener la permeabilidad oral. Hacer el espéculo de un barril de 5 ml de plástico de la jeringa que se corta a una longitud de 1,5 a 2 cm, con los bordes de corte desbarbado y pulido suave.
5. Apagar las luces en el rooM y conecte una fuente de luz halógena al endoscopio. Encienda la videograbadora para capturar el procedimiento.
6. Sumerja el extremo distal del endoscopio en agua tibia durante unos segundos para minimizar el desarrollo de condensación en la punta de vidrio cuando se inserta en la boca de la rata.
7. Utilizando la retroalimentación visual desde el monitor, guíe cuidadosamente la aguja hasta el área del pliegue vocal izquierdo.
8. Tiempo de la inyección de la solución con la fase inspiratoria del ciclo de la respiración de los animales para acceder plenamente el pliegue vocal. Durante la fase inspiratoria de la respiración, el pliegue vocal está completamente expuesto.
   1. Una vez que el pliegue vocal es totalmente visible, insertar la aguja en el tiroiritenoideo izquierdo, que se encuentra lateral al borde mediano blanco del pliegue vocal. Con la aguja en su lugar, entregar el inyectado a través de la depresión de la jeringa.
9. Apague la fuente de luz halógena en el endoscopio y el reproductor de vídeo, yLuces om
10. Vuelva la rata a su jaula de casa y coloque en una almohadilla de calefacción.
11. Deje que la rata se recupere antes de retirarla de la almohadilla de calentamiento. Reemplace los alimentos y el agua en la jaula.
12. Monitor de ratas durante 7 días después de la inyección y luego euthanize. Quitar las laringes para la criosección ²⁴ .

5. Eutanasia de Ratas

1. Anestesiar las ratas con hidrocloruro de ketamina y clorhidrato de xilazina (100 mg / 8 mg por kg de peso corporal inyectado inyección intraperitoneal).
2. Euthanize por exsanguination después de una toracotomía medial.

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Resultados

Las ratas se sacrificaron después de 2 semanas de infusión de bomba osmótica o 1 semana después de la inyección directa de NTF4. Las laringes se cosecharon, se colocaron en crioprotector (sacarosa al 30% y solución salina tamponada con fosfato al 70%) y luego se seccionaron en serie en anchos de 10 μm con un criostato. El envejecimiento de los músculos laríngeos se ven afectados por la administración de NTF4 [ ^25] . Además de rata joven y vieja, compara...

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Discusión

Los músculos laríngeos son vulnerables a los efectos desfavorables del envejecimiento. Estudios previos han demostrado cambios en el envejecimiento de los músculos laríngeos que incluyen cambios en el tamaño de las fibras, el número total de fibras, la capacidad regenerativa, el tamaño NMJ y los cambios de cantidad, además de las variaciones en la función contráctil y la isoforma de la miosina ^{4 , 11 , 27 ,}...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurotrophin 4	Pepro Tech	450-04	200 ng in 50 μL
Alzet Osmotic Pump	DURECT Corporation	2001D
30 ° endoscope	Stoltz	61029D
50 mm 30 gauge 100-μL syringe	Hamilton	84850 and 201812
saline (sodium chloride solution)	Sigma-Aldrich	S8776
ketamine hydrochloride	Henry Schein	56344
xylazine hydrochloride	Henry Schein	33198
25 G 5/8 needle	Becton-Dickinson	305901
1 mL syringe	Becton-Dickinson	309659
ophthalmic ointment	Henry Schein	8897
clippers	Oster	44-018
ethanol	Decon	2716
iodine (Betadine)	Purdue Pharma L.P.	606404
heating pad	Sunbeam	731-5
5-0 nylon suture thread	AD Surgical	PMN-518R6
crile hemostat	Fine Science Tools	13005-14
delicate suture tying forceps	Fine Science Tools	11063-07
meloxicam	Henry Schein	49756
carprofen	Merritt Veterinary Supplies	148700
antibiotic ointment	Henry Schein	57110
acepromizine Aceproject	Henry Schein	3845
isoflurane Isothesia	Henry Schein	50033
induction box (anesthetizing box)	Harvard Apparatus	50-0116
oxygen compressed tank	Scott Gross	UN1072
plexiglas platform	Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps	Fine science tools rubber	11075-00
liquid rubber for forceps above	Lowe's	42518
plastic spectula (BD syringe cut to length)	Becton-Dickinson	309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope	Kay-Pentax	RLS 9100 B
video recorder	Kay-Pentax
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389-500G
phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525	Thermo Scientific	HM 525
Gill 1 hematoxylin	VWR	10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic	Thermo Fisher Scientific	6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	S0819
Texas red-X phalloidin	Sigma-Aldrich	T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate	Thermo Fisher Scientific	B-13422
Small animal anaesthesia machine	Smiths Medical	CDS 9000