Subkutane Neurotrophin-4-Infusion unter Verwendung von Osmotik-Pumpen oder direkter Muskel-Injektion verbessert die Ratten-Larynx-Muskeln

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Verwendung von Neurotrophin 4 (NTF4) systemisch und direkt zu modulieren Rattenalterung Larynx Muskeln zu beschreiben.

Zusammenfassung

Kehlkopfdysfunktion bei älteren Menschen ist eine Hauptursache für Behinderung, von Stimmungsstörungen bis hin zu Dysphagie und Verlust von Atemwegsschutzreflexen. Nur wenige, wenn überhaupt, gibt es Therapien, die eine altersbedingte Larynxmuskel-Dysfunktion erreichen. Neurotrophine sind an der Muskelinnervation und Differenzierung von neuromuskulären Übergängen (NMJs) beteiligt. Es wird angenommen, dass Neurotrophine die neuromuskuläre Transmission durch Erhöhung der Neurotransmitterfreisetzung verstärken. Die neuromuskulären Kreuzungen (NMJs) werden kleiner und weniger reich an alternden Ratten-Larynxmuskeln, mit Anzeichen einer funktionalen Denervation. Wir untersuchten die Auswirkungen von NTF4 auf zukünftige klinische Anwendung als Therapeutikum zur Verbesserung der Funktion bei der Alterung menschlicher Larynxmuskulatur. Hier stellen wir das detaillierte Protokoll für die systemische Anwendung und die direkte Injektion von NTF4 zur Verfügung, um die Fähigkeit des alternden Ratten-Larynxmuskels zu untersuchen, um in Reaktion auf NTF4-Applikation umzuwandeln. Bei dieser Methode erhielten Ratten entweder NTF4 entweder systemisch über oSmotische Pumpe oder durch direkte Injektion durch die Stimmlippen. Larynxmuskeln wurden dann seziert und für die histologische Untersuchung der Morphologie und der altersbedingten Denervation verwendet.

Einleitung

Larynx Muskeln kontrahieren schnell und konsequent und sind anfällig für die nachteiligen Auswirkungen des Alterns. Diese ständige Aktivität wird dazu gedacht, zu Stimmproblemen oder Dysphagie bei Personen über 65 Jahre im Alter von ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} zu helfen. Mehrere molekulare und pathophysiologische Mechanismen tragen zu dieser altersbedingten Dysfunktion bei. Diese Mechanismen können die Umgestaltung von Kehlkopfschleimhaut, Muskelfaseratrophie oder -verlust, Mangel an Muskelfaser-Regeneration oder Atrophie, die eine Verbeugung der Stimmlippen und Unfähigkeit des Glottis-Verschlusses ^{8 , 9 , 10 , 11} bewirken ^{, umfassen} . Es gibt keine bewährte medizinische Therapie zu diesem Zeitpunkt, die comDiese altersbedingten Veränderungen in diesen Muskeln zu verhindern oder zu rehabilitieren.

Die Modulation der Wirksamkeit der neuromuskulären Transmission kann die Neuromotorleistung stark beeinflussen. Die Familie der Neurotrophine umfasst den Nervenwachstumsfaktor (NGF), den Gehirn-abgeleiteten Nervenwachstumsfaktor (BDNF), Neurotrophin 3 (NTF3) und NTF4 ^{12 , 13} . Es wurde gezeigt, dass Neurotrophine die synaptische Wirksamkeit ^{1 , 4} modulieren. Hepatocytenwachstumsfaktor, transformierende Wachstumsfaktor Beta und Fibroblastenwachstumsfaktor wurden vor kurzem beim Menschen für die Behandlung von Stimmfalten Narben ^{15 - 17} verwendet. NTF4 reguliert auch die NMJ-Wirksamkeit; Mäuse ohne NTF4 zeigen zerlegt NMJs ^{11 , 18 , 19} . Diese Studien führen zu vielversprechenden Wirkungen von BehandlungenT der alternden Larynxmuskelstörungen und der Denervation mit Wachstumsfaktoren.

Direkte Injektionstherapeutika zu den Geweben der Stimmlippen sind beim Menschen nicht beispiellos. Zum Beispiel werden lokale Injektionen von Botulinumtoxin derzeit als wirksame Behandlung für neurologische Bewegungsstörungen verwendet, die die Muskeln im Kehlkopf beeinflussen, wie krampfhafte Dysphonie und bilaterale rezidivierende Larynxnervenlähmung ^{20 , 21} . Hyaluronsäure-Hydrogel ist eine weitere injizierbare, die verwendet wird, um Stimmfalten Angst und Glottal Insuffizienz ^{22 , 23 zu} behandeln. Injektion Laryngoplastie kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Kommunikationsstörungen zu behandeln ²⁴ . Diese Direktinjektionsmethoden versprechen, die Stimmfunktion und das Schlucken in alternden Populationen zu verbessern.

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Protokoll

Verwenden Sie männliche Fischer 344-Brown Norwegen Ratten in 6 und 30 Monate alt für dieses Protokoll. Ratten wurden von der National Institute of Aging Nagetier Kolonie erhalten. Wir haben Ratten für diese Studie verwendet, weil die Struktur des Rattenkehlkopfes ähnlich der des Menschen ist, funktionell für den Atemwegsschutz und Spezies-spezifische Vokalisationen dient Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der PHS-Politik auf humane Pflege und Verwendung von Labor-Tiere durchgeführt, Der NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und das Tierschutzgesetz (7 USC ff.); Wurde das Tiernutzungsprotokoll vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Kentucky genehmigt.

1. Anästhesie der Ratten

1. Bereiten Sie die Anästhetika vor, indem Sie Ketaminhydrochlorid (dissoziatives Anästhetikum) und Xylazinhydrochlorid (Beruhigungsmittel und Analgetikum) in gepufferter Kochsalzlösung mischen. Die Konzentrationen von Ketamin und Xylazin in der Endlösung betragen 100 mg / 8 mg pro kgKörpergewicht.
2. Injektion der Anästhetika in die Ratte durch intraperitoneale Verabreichung unter Verwendung einer Spritze mit einer 25 G-Nadel.
3. Bestimmen Sie, dass die Ratte genügend betäubt ist, indem Sie den Zeh oder den Fuß mit einer Pinzette einklemmen. Wenn die Ratte nicht auf die Prise reagiert, dann kann die Operation beginnen. Wenn die Ratte auf die Zehen-Prise mit Reflex- oder Muskelkontraktionen reagiert, dann warten Sie 1-2 min und wiederholen Sie den Prise Test. Wenn die Ratte wieder reagiert, ersetzen Sie die Ratte durch ein neues Tier und wiederholen Sie das Verfahren ab Schritt 1.2.
4. Tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Augen der Ratte, nachdem die Ratte unbeweglich ist, um zu verhindern, dass die Hornhäute austrocknen.

2. Osmotische Pumpenimplantation

1. Lege die Ratte ventral auf den aseptischen chirurgischen Bereich. Meloxicam als präanästhetische Medikamente verabreichen. Intraperitoneal in einer Dosierung von 1-4 mg / kg Körpergewicht unter Verwendung einer Spritze mit einer 25 G-Nadel verabreichen.
2. Verwenden Sie Clippers, um eine approxima zu entfernen1 "x 1" Quadrat des Pelzes von der Rückseite des Halses, und ungefähr 1 "kaudal des Raumes zwischen den Schultern. Rasieren Sie so nah an der Haut wie möglich.
3. Den Rücken und den Nacken mit deminfizierendem Ethanol (70%) benetzen.
4. Nach der Rasur, schrubben die dorsalen Aspekt des Halses mit 3 Scrubs in Folge von Jod-Alkohol Finishing mit Alkohol.
5. Halten Sie die Körpertemperatur der Ratte, indem Sie sie auf einen Heizkissen legen, der auf 34 ° C eingestellt ist.
6. Füllen Sie aseptisch hergestellte osmotische Pumpen mit entweder 50 μl NTF4 oder Kochsalzlösung für die systemische NTF4-Behandlung (Abbildung 1 ).
   1. Benutzen Sie ein Skalpell, um einen horizontalen Schnitt ungefähr 2 cm breit durch die Haut zu bilden, gerade kranial zum Raum zwischen den scapulae. Heben Sie die hintere Kante des Schnittes mit einer Pinzette mit einer Hand an, während Sie die Spitze der Hämostaten einsetzen und vorsichtig nach hinten in den Einschnitt schieben.
   2. Nach der Spitze der Hämostaten ist ca. 2 cm cRanial zum Einschnitt, öffnen Sie die Griffe auf den Hämostaten, erweitern die Spitzen, um eine hohle "Tasche" subkutan zu der Inzisionsstelle zu bilden. Dies ist die Platzierungsstelle für die Pumpe.
7. Richten Sie das Pumpenförderportal zuerst nach der Einfügung aus, um jegliche Wechselwirkung des NTF4 und die Heilung der Pocket Inzisionsstelle zu minimieren.
8. 50 μl NTF4 Kochsalzlösung für 7 14 Tage geben. Die 7-tägige Gruppe erhielt 6,72 mg / Tag NTF4 für eine Gesamtdosis von 47,04 mg. Die 14-tägige Gruppe erhielt 6,72 mg / Tag für eine Gesamtdosis von 94,08 mg NTF4 ²⁵ .
9. Verwenden Sie 5-0 Nylon Naht Faden, Hämostaten und Pinzette, um den Einschnitt für Pumpe Platzierung zu schließen.
10. Beobachten Sie die Ratten für mindestens 30 min, wie sie sich von der Anästhesie erholen. Kriterien für die Vollendung der Überwachung gehören das Tier aktiv, bewegt sich über den Käfig, Trinkwasser, und beginnen andere normale Aktivitäten wie Pflege.
11. Tiere täglich überwachenFür die erste Woche durch Beobachtung der Heilung der chirurgischen Stelle, normale Futtermittel und Wasserverbrauch und Verabschiedung von Urin / Kot und irgendwelche abnorme Verhaltenszeichen von Stress, Schmerzen oder anderen postoperativen Komplikationen.
12. Wenn die Ratte in Schmerzen oder Not zu sein scheint, versorgen Sie die Ratte mit einer 5 mg / kg subkutanen Injektion von Carprofen einmal alle 24 Stunden für bis zu 5 Tage, um Schmerzen zu lindern.
13. Wenn es scheint, eine Infektion zu sein, konsultieren Sie einen Tierarzt, um zu folgen, dass die Wunde richtig heilt.
14. Je nachdem, welche experimentelle Gruppe die Ratte in innen, entfernen Sie die 5-0 Nylon Naht 7-10 Tage nach der Operation, um Reizungen aus dem Faden zu verhindern.

3. Anästhesie der Ratten für die direkte Injektion

1. Verzehr von den Ratten in der Nacht vor dem Eingriff. Dadurch wird sichergestellt, dass es keine Nahrung gibt, um das Endoskop oder die Injektionsnadel zu blockieren.
2. Wiegen Sie Ratten und bereiten Sie Acepromazin 1-2 mg / kg Körpergewicht vor. Inaktiv intramuskulär (der IM - Standort ist derLinks thyroarytenoid muskel).
3. Legen Sie die Ratte in die Induktionsbox. Anästhesie im Induktionskasten mit 5% Isofluran und 1 LO ₂ induzieren.
4. Bewegen Sie die Ratte auf einen Nasenkonus mit 2% Isofluran und 600 ml O ₂ .
5. Bestimmen Sie, dass die Ratte genügend betäubt ist, indem Sie den Zeh oder den Fuß mit einer Pinzette einklemmen. Wenn die Ratte nicht auf die Prise reagiert, kann das Injektions-Protokoll beginnen. Wenn die Ratte auf die Zehen-Prise mit Reflex- oder Muskelkontraktionen reagiert, dann warten Sie 1-2 min und wiederholen Sie den Prise Test. Wenn die Ratte wieder reagiert, ersetzen Sie die Ratte durch ein neues Tier und wiederholen Sie das Verfahren ab Schritt 3.4.

4. Direkteinspritzung und Visualisierung

1. Platzieren Sie aseptisch hergestellte 50-μL-Dosierungen, die NTF4 oder Kochsalzlösung enthalten, in einem H ₂ O-Bad, das auf 25 ° C für 30 min vor der Injektion eingestellt wurde.
2. Legen Sie die Ratte in eine Rückenlage und verstellbare Position auf einer Plexiglas-Plattform (Abbildung 2 ). SusHängen Sie die Ratte in die zurückgelehnte Haltung von ihren vorderen oberen Schneidezähnen über einen Führungsdraht, der über die Oberseite der Plattform geschleudert wird.
3. Befestigen Sie eine 50 mm, 30 gauge, 100 μl Spritze auf ein 1,9 mm, 30 ° Sinus Endoskop (Abbildung 3 ).
   HINWEIS: Die Spritzenanordnung wird über eine Lehre befestigt, die die Kanüle fest an der Außenwand des Endoskops hält. Das Endoskop ermöglicht die Visualisierung der Stimmlippen und die Injektion der Spritze. Die Position der Kanülenspitze wird vor jedem Tier eingestellt, um sicherzustellen, dass die Spitze über die endoskopische Ansicht vollständig sichtbar ist (Abbildung 4 ).
4. Verwenden Sie eine gummi-pippige Pinzette, um die Zunge zu verlängern und verschieben Sie sie seitlich. Danach legen Sie ein Plastikspekulum ein, um die mündliche Durchgängigkeit zu bewahren. Machen Sie das Spekulum aus einem 5 ml Plastikspritzenfaß, der auf eine Länge von 1,5 bis 2 cm geschnitten ist, wobei die Schnittkanten entgratet und poliert sind.
5. Schalte die Lichter ausM und befestige eine Halogen-Lichtquelle zum Endoskop. Schalten Sie den Videorecorder ein, um die Prozedur zu erfassen.
6. Tauchen Sie das distale Ende des Endoskops für einige Sekunden in warmes Wasser ein, um die Entwicklung der Kondensation auf der Glasspitze zu minimieren, wenn sie in den Mund der Ratte eingeführt wird.
7. Mit der visuellen Rückmeldung vom Monitor führen Sie die Nadel sorgfältig in den Bereich der linken Stimmlippe.
8. Zeit die Injektion der Lösung mit der Inspirationsphase des Atmungszyklus der Tiere, um vollständig auf die Stimmfalte zuzugreifen. Während der inspiratorischen Phase der Atmung ist die Stimmfalte vollständig ausgesetzt.
   1. Sobald die Stimmfalte vollständig sichtbar ist, stecke die Nadel in das linke Thyreoheldoid ein, das seitlich zur weißen medialen Kante der Stimmlippe gefunden wird. Mit der Nadel an Ort und Stelle, liefern die Injektion durch Depression der Spritze.
9. Schalten Sie die Halogen-Lichtquelle auf dem Endoskop und dem Videoplayer aus und drehen Sie den Rack wieder anOm leuchtet
10. Bringt die Ratte in den Hauskäfig zurück und platziere auf einem Heizkissen.
11. Lassen Sie die Ratte vor dem Entfernen aus dem Heizkissen zurückgewinnen. Ersetzen Sie Nahrung und Wasser im Käfig.
12. Überwachen Sie Ratten für 7 Tage nach der Injektion und dann euthanisieren. Entfernen Sie die Larynges für die Kryoschaltung ²⁴ .

5. Euthanisierung von Ratten

1. Anästhesieren von Ratten mit Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid (100 mg / 8 mg pro kg Körpergewicht injiziert intraperitoneale Injektion).
2. Euthanisieren durch Exsanguination nach einer medialen Thorakotomie.

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Ergebnisse

Die Ratten wurden nach 2 Wochen osmotischer Pumpeninfusion oder 1 Woche nach Direkteinspritzung von NTF4 euthanasiert. Larynge wurden geerntet, in Kryoschutzmittel (30% Saccharose und 70% phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gegeben und dann seriell in 10 & mgr; m Breite mit einem Kryostat geschnitten. Alterung der Larynxmuskulatur wird durch die Verabreichung von NTF4 ²⁵ beeinflusst. Neben der jungen und alten Ratte verglichen wir die injizierte und nicht inji...

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Diskussion

Larynxmuskulatur ist anfällig für die ungünstigen Auswirkungen des Alterns. Frühere Studien haben Veränderungen in der Alterung der Kehlkopfmuskulatur gezeigt, die Veränderungen in der Fasergröße, die Gesamtzahl der Fasern, die Regenerationsfähigkeit, die NMJ-Größe und die Mengenänderungen zusätzlich zu den Variationen der kontraktilen Funktion und der Myosin-Isoformverschiebungen ^{4 , 11 , 27 ,}

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurotrophin 4	Pepro Tech	450-04	200 ng in 50 μL
Alzet Osmotic Pump	DURECT Corporation	2001D
30 ° endoscope	Stoltz	61029D
50 mm 30 gauge 100-μL syringe	Hamilton	84850 and 201812
saline (sodium chloride solution)	Sigma-Aldrich	S8776
ketamine hydrochloride	Henry Schein	56344
xylazine hydrochloride	Henry Schein	33198
25 G 5/8 needle	Becton-Dickinson	305901
1 mL syringe	Becton-Dickinson	309659
ophthalmic ointment	Henry Schein	8897
clippers	Oster	44-018
ethanol	Decon	2716
iodine (Betadine)	Purdue Pharma L.P.	606404
heating pad	Sunbeam	731-5
5-0 nylon suture thread	AD Surgical	PMN-518R6
crile hemostat	Fine Science Tools	13005-14
delicate suture tying forceps	Fine Science Tools	11063-07
meloxicam	Henry Schein	49756
carprofen	Merritt Veterinary Supplies	148700
antibiotic ointment	Henry Schein	57110
acepromizine Aceproject	Henry Schein	3845
isoflurane Isothesia	Henry Schein	50033
induction box (anesthetizing box)	Harvard Apparatus	50-0116
oxygen compressed tank	Scott Gross	UN1072
plexiglas platform	Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps	Fine science tools rubber	11075-00
liquid rubber for forceps above	Lowe's	42518
plastic spectula (BD syringe cut to length)	Becton-Dickinson	309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope	Kay-Pentax	RLS 9100 B
video recorder	Kay-Pentax
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389-500G
phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525	Thermo Scientific	HM 525
Gill 1 hematoxylin	VWR	10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic	Thermo Fisher Scientific	6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit	Sigma-Aldrich	S0819
Texas red-X phalloidin	Sigma-Aldrich	T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate	Thermo Fisher Scientific	B-13422
Small animal anaesthesia machine	Smiths Medical	CDS 9000