体外在拟南芥中受精卵分化和胚模式的活体细胞成像的胚珠培养

摘要

这份手稿描述了一个体外胚珠培养方法, 使受精卵和胚胎的活细胞成像的拟南芥。该方法用于在受精卵分化过程中对细胞内动力学进行可视化, 并对发育中的胚胎的胞命运规范进行研究。

摘要

在大多数开花植物中, 受精卵和胚都深藏在母体组织中, 因此长期以来一直是它们动态发展的奥秘;例如, 受精卵对立如何建立体轴, 以及胚胎在器官形成过程中如何指定各种细胞的命运。这份手稿描述了一个体外胚珠培养方法, 以执行受精卵和胚胎的活体细胞成像的拟南芥。优化的培养基允许受精卵或早期胚胎长成肥沃的植物。将其与聚 (烷) micropillar 阵列器件相结合, 在同一位置的液体介质中保存胚珠。这种固定是至关重要的观察相同的胚珠在显微镜下数天, 从合分裂到晚期胚胎阶段。由此产生的活细胞成像可用于监测受精卵极化的 real-time 动力学, 如细胞核迁移和细胞骨架重排, 以及胚胎模式中的细胞分裂时序和电池命运规范。此外, 这种胚珠培养系统可以与抑制剂结合, 分析各种因素对胚胎发育的影响, 并与光学操作, 如激光干扰, 以检查细胞通讯的作用。

引言

生物体的基本身体计划由单细胞受精卵发育而来。在大多数开花植物中, 合分裂产生一个顶端和一个基底细胞, 分别发育成芽和根,¹。因此, 了解植物体在胚胎发生过程中是如何形成的是很重要的, 但是没有一个有效的工具可以直接观察受精卵和胚胎的动态, 因为它们在花朵深处发育。在一些单子叶植物种, 如玉米和大米, 一个体外受精方法已经建立^2,3。在这种方法中, 分离的精子和卵细胞被电或化学熔化, 生成的细胞可以发展成一个肥沃的植物。然而, 在双子植物, 没有体外受精方法, 可以产生适当的胚胎, 大概是由于同步细胞周期状态的男性和女性的配子^4,5。此外, 胚周围组织 (胚乳) 在胚胎发育中起重要作用⁶。

在一个模型双子物种,一. 南芥, 一个体外培养方法是通过专注于整个胚珠, 其中包含胚胎和胚乳的⁷。该系统成功地用于分析各种化学试剂对胚胎发生的影响, 但由于其存活率低, 不宜用于延时成像。因此, 开发了一种新的体外胚珠培养体系, 以便早于合子阶段开始, 并在高比例的⁸中产生肥沃的植株。经多次试验, 发现 Nitsch 培养基和海藻糖对胚珠的存活率有显著提高⁸。此外, 由于胚珠随着它的生长而扩展, 因此经常从显微镜的观察场移开, 因此开发了一种用于在培养基⁹中固定胚珠的硅橡胶装置。该设备使长期成像 3-4 天, 这是足够的跟踪发展从受精卵到心脏阶段的胚胎。使用这种方法, 不仅在正常条件下, 而且在化学抑制剂或各种突变体背景下, 也可以可视化受精卵极化和胚模式的动态,^{8,10 ,11}。

图 1: 用于显示受精卵和胚胎通过胚珠的特定荧光标记的原理图。
拟南芥受精卵发育成胚珠中的胚, 这是在花深处产生的。在这个体外培养系统中, 通过胚珠观察受精卵和胚胎, 因此使用其他胚珠组织中没有表达的特定荧光标记是很重要的。 请单击此处查看此图的较大版本.

研究方案

1. 制备 体外 胚珠培养基

1. 为 体外培养的液体培养基 (和 #34; N5T 培养基和 #34;) 含有 1x Nitsch 基盐混合物, 5% (w/v) 海藻糖二水合物, 0.05% (w/v) 2-(n-吗) 磺酸 (MES)-KOH (pH 5.8) 和 1x Gamborg 和 #39; s 维生素溶液.
2. 使用 KOH 调整 pH 值为 5.8.
3. 通过灭菌 (121 和 #176; C, 20 min) 对介质进行消毒, 或者通过0.22 和 #181; m 过滤器过滤.
   注: 灭菌介质可存储在4和 #176; C 为 2-3 月.

2。Micropillar 阵列设备的制备

1. 用刀、刀片或剪刀将 Micropillar 设备切割成玻璃部分 (14 毫米和 #966;) 35 mm 的玻璃底盘.
   注: 在以前的论文 ^{8 , 9} 中描述了该设备构造的完整过程, 因此此处省略了详细信息。玻璃底盘的体积较小, 如4井或96井板, 可用于短期成像而不使用该设备.
2. 在紫外线照射下, 在15分钟内对硅橡胶设备的上部进行消毒.
3. 使用方形尖端镊子将该设备翻转过来, 并将其置于 UV 光下15分钟以消毒底部.
4. 将灭菌的硅橡胶设备转移到 35 mm 培养皿中, 添加 N5T 介质, 直到设备完全浸泡在介质中 (约 5-7 毫升).
5. 把盘子放进真空室, 减少对德加的压力。将吸尘器保持3小时至一夜, 直到设备中的空气被介质取代.
   注: 该装置可在强真空下通过气泡分离.
6. 将该设备从盘中取出, 用方形尖端镊子将其放在纸巾上, 将多余的介质放在侧面和底部.
   注意: micropillar 阵列上的介质 (上表面) 不应被移除, 因为这将用于胚珠的培养.
7. 将设备传输到 76 mm x 26 mm 的滑动玻璃上, 确保将 micropillar 部分保持为上部, 并将设备与 35 mm 培养皿盖盖在一起, 以防止在下列胚珠萃取过程中干燥.

3。丝解剖和胚珠提取

1. 用70% 乙醇擦拭针 (0.40 mm) 和细镊子。针很容易通过将它附着在注射器或木棍上来处理.
2. 检查植物的花序, 并选择合适的角果进行实验。大约5毫米角果包含受精卵, 并且 8-10 毫米角果包括幼小球状胚胎.
3. 使用镊子将角果, 并将其放在 76 x 26 mm 滑动玻璃上的双面胶带上。一个丝包含约 40-60 胚珠, 和 3-4 角果 ( 即 , 120-240 胚珠) 是足够的一个设备.
4. 打开丝 (子房壁) 以在显微镜下使用灭菌针和镊子查看胚珠。仅切割子房壁, 使胚珠未损坏.
5. 将打开的丝转到 N5T 的设备上 (在步骤2.7 中准备), 然后用针或镊子将胚珠释放到介质中.
6. 将一个小盖玻璃 (18 mm x 18 mm) 放到该设备上, 将胚珠推入 micropillar 阵列中的空间.
7. 通过用镊子或手指水平拉动盖子玻璃以去除多余的介质.
8. 将该设备倒置, 将其放入 35 mm 的玻璃底盘中, 并通过使用方形尖端镊子将其粘贴到玻璃上, 轻轻按压该设备.
9. 将 N5T 介质轻轻地倒入玻璃底盘中, 迁中瓶, 直到将其完全浸泡在介质中, 然后用石蜡膜封住盘.
   注: 该设备可以回收, 但太旧的设备很容易脱离玻璃底部。此外, 如果在步骤2.5 中未完全脱, 则该设备可能会浮动, 或者介质被浇得太快.

图 2: 示例准备的示意图程序.
此示意图流对应于步骤3.5 到4.1。 请单击此处查看此图的较大版本.

4. 延时成像

1. 将在步骤3.9 中准备的玻璃底盘放在倒置显微镜下, 并选择合适的胚珠来聚焦。 注意: 由于胚珠在舞台、位置和方向上各不相同, 因此应通过检查其标记荧光来找到合适的胚珠.
2. 根据显微镜系统的制造商和 #39 的指示启动实时成像.
   注意: 显微镜设备和参数是多种多样的, 因此用户应该选择适合实验目的的合适设置。例如, 此手稿中使用的设置在 表 1 中列出.

显微镜 激光扫描倒置显微镜 (A1R MP) 旋转盘共聚焦倒置显微镜 (CSU-W1) 箱式倒置共焦显微镜系统具有稳定的孵化室 (CV1000) 过滤器

设备/设置	图 3 (A) 和补充视频1和 4	图 3 (B) 和补充视频 2	辅助视频 3
激光	钛: 蓝宝石飞秒脉冲激光	488 nm 和 561 nm ld 激光器	488 nm 和 561 nm ld 激光器
O目的透镜和 #160;	40X 浸水物镜 (na = 1.15) 与浸没介质	60X 硅油浸泡物镜 (na = 1.30), 安装在压电聚焦驱动器	40X 物镜 (na = 0.95)
检测或	外部 non-descanned GaAsP PMT 探测器	EMCCD 摄像机	EMCCD 摄像机
分色镜像	DM495 和 DM560	DM488/561	DM400-410/488/561
> 带通滤波器;534/30 nm 和 578/105 nm	带通滤波器; 520/35 nm 和 593/46 nm	带通滤波器; 520/50 nm 和 617/73 nm
切片沿 z-axis	31 z 堆栈与1和 #181; m 间隔时间	17 z 堆栈与3和 #181; m 间vals	7 z 堆栈, 具有5和 #181; m 间隔时间
时间间隔	20 分钟	5 分钟	10 分钟

表 1:本手稿中使用的显微镜系统和设置.
显微镜和参数是多种多样的, 因此每个用户都应该选择合适的实验系统.

3. 检查获取的图像序列, 并将其转换为常规电影格式, 如. avi 或。 注意: 如果显微镜软件无法将图像输出为电影格式, 则可以将图像保存为. tif, 然后在 ImageJ 中打开它们, 这是一个由 NIH 图像启发的开源程序, 用于更改文件类型。ImageJ 提供: https://imagej.nih.gov/ij/。ImageJ 也可以用来做一个 Z s塔克电影, 如最大强度投影, 如所述: https://imagej.net/Z-functions.

结果

利用这种胚珠培养体系, 可以跟踪受精卵极化和胚模式的生存动力学。这是一个成就, 因为以前没有技术来可视化的 real-time 行为的受精卵和胚胎, 这是隐藏在母亲的组织深处。图 3A和补充视频 1显示年轻合子中的微管 (MTs) 在尖端区域¹⁰中累计为一个横向环。这 MT 圆环被维护, 当受精卵拉长在顶端方向。在完成合子伸长和?...

讨论

这份手稿介绍了一个简单的体外胚珠培养协议, 这是有效的使用在活细胞成像的发展受精卵和胚胎。

根据胚阶段的需要, 对该装置的设计进行优化。第一个被开发的设备是一个 microcage 阵列调整方向和固定胚珠⁹的位置, 然后构造一个 micropillar 设备来更有效地捕获胚珠⁸。此外, micropillars 比 microcage 更薄、更柔软, 因此不会在长期观察中?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nitsch basal salt mixture	Duchefa	N0223
trehalose dihydrate	Wako Pure Chemical	206-18455
MES	Dojindo	345-01625
Gamborg’s vitamin solution	Sigma-Aldrich	G1019
35-mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D111300
35 mm culture dish	Corning	430588
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
76 × 26 mm slide glass	Matsunami Glass	S1225
18 × 18 mm slide glass	Matsunami Glass	C018181
needle (gauge 0.40 mm)	Terumo	NN-2719S
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
A1R MP	Nikon	A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF
CSU-W1	Yokogawa Electric		It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.
CV1000	Yokogawa Electric	CV1000-SP84