במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

Summary

כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית טיפוח שיטה המאפשרת הדמיה לחיות תאים של תודרנית מופרות, העוברים. בשיטה זו הוא מנוצל כדי להמחיש את הדינמיקה תאיים במהלך זיגוטה קיטוב מפרט הגורל תא בפיתוח עוברי.

Abstract

רוב הצמחים פורחים, זיגוטה את ואת העובר מוסתרים עמוק בתוך רקמת אמא, ובכך כבר זמן רב המסתורין של איך הם מפתחים באופן דינאמי; לדוגמה, איך הזיגוטה קוטביות (ניגודים) להקים את ציר הגוף, איך העובר מציין הגורלות תא שונים במהלך היווצרות האיברים. כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית תרבות שיטה לבצע הדמיה לחיות תאים של פיתוח מופרות, העוברים של תודרנית לבנה. המדיום טיפוח ממוטבת מאפשר מופרות או עוברי מוקדם כדי לגדול לתוך צמחים פורייה. על ידי שילוב זה עם מכשיר מערך של micropillar poly(dimethylsiloxane) (PDMS), ביצית מתקיים המדיום הנוזלי באותה תנוחה. הקיבעון הזה חיוני להתבונן באותה ביצית תחת מיקרוסקופ במשך מספר ימים ממחלקת zygotic לבמה העובר מאוחר. ההדמיה לחיות תאים וכתוצאה מכך ניתן לנטר את הדינמיקה בזמן אמת של קיטוב זיגוטה, כגון העברה גרעינית ו שחלוף שלד התא, וגם לעיתוי חלוקת התא תא מפרט הגורל במהלך העובר המתבנת. יתר על כן, שיטת הטיפוח הזאת ביצית יכול להיות משולב עם טיפולים מעכב כדי לנתח את השפעת גורמים שונים על התפתחות העובר, ועם מניפולציות אופטי כמו שיבוש לייזר כדי לבחון את תפקידה של תקשורת.

Introduction

התוכנית גוף בסיסי של אורגניזם מתפתח זיגוטה חד־תאיות. ברוב הצמחים פורחים, חטיבת zygotic מחוללת על הפסגה של התאים הבזליים, אשר לפתח לתוך לירות ואת שורש, בהתאמה¹. לכן, חשוב להבין איך נוצר בגוף הצמח במהלך מופרה, אך לא היה כלי יעיל כדי לצפות ישירות את הדינמיקה של החיים מופרות, עוברי כי הם מפתחים עמוק בתוך הפרח. מספר מינים monocot, כגון תירס, אורז, שיטת הפריה במבחנה כבר הוקמה^2,3. בשיטה זו, מבודד זרע ותאי ביצה הם התמזגו חשמלית או כימית, התא שנוצר יכול להתפתח צמח פורה. עם זאת, בצמחים dicot, יש אין במבחנה שיטת הדישון יכול לייצר עוברי תקין, ככל הנראה מפאת מצב בלתי-מסונכרנות מחזור התא של זכר ונקבה גמטות^4,5. בנוסף, הרקמה שמסביב העובר (האנדוספרם) משחק תפקידים חשובים העובר פיתוח⁶.

במינים dicot מודל, לבנה א, שיטת טיפוח במבחנה פותחה על-ידי התמקדות כל ביצית, אשר מכיל העובר ואת האנדוספרם⁷. מערכת זו שימשה בהצלחה כדי לנתח את ההשפעות של ריאקטיבים כימיים שונים על מופרה, אבל היא לא מתאימה הדמיה בצילום מואץ כי יש לו סיכויי הישרדות נמוכה. לכן, הרומן במבחנה ביצית טיפוח מערכת פותחה על מנת להתחיל מוקדם ככל השלב זיגוטה ולייצר צמחים פורייה-יחס גבוה⁸. לאחר ניסויים שונים, זה היה למצוא אותה מדיום Nitsch, טרהלוז לשפר באופן משמעותי את שיעור ההישרדות של ovules⁸. בנוסף, כי שלייה מתרחב כפי שהוא גדל ולכן לעתים קרובות יוצא מהשדה תצפית במיקרוסקופ, מכשיר PDMS פותחה כדי לתקן את ביצית ב בינוני⁹. המכשיר PDMS איפשרה ההדמיה לטווח ארוך 3-4 ימים, וזה מספיק כדי לעקוב אחר ההתפתחות זיגוטה העובר בשלב הלב. באמצעות שיטה זו, הוא הופך להיות אפשר לדמיין את הדינמיקה של קיטוב זיגוטה, העובר תכנים, לא רק בתנאים רגילים, אבל גם בנוכחות מעכבי כימי או שונים רקעים מוטציה^{8,10 ,11}.

איור 1: תרשים סכמטי של הסמנים פלורסנט ספציפיים המשמשים מופרות באופן חזותי של עוברי דרך ביצית.
הזיגוטה תודרנית מתפתח העובר בתוך ביצית, אשר נוצר בתוך הפרח. ב במבחנה שיטת הטיפוח הזאת, זיגוטה את ואת העובר הם נצפו דרך להפרייה, ולכן חשוב להשתמש מסוים סמנים פלורסנט אינם מבוטאים ברקמות אחרות ביצית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Protocol

1. הכנה של המדיום תרבות חוץ גופית של ביצית

1. הופכים את המדיום הנוזלי לתרבות ביצית הפרייה (" N5T בינוני ") המכילה 1 x Nitsch הבזליים תערובת, 5% (w/v) טרהלוז וגופרית והרכבו 0.05 % (w/v) 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES)-קו (pH 5.8), ו- 1 x Gamborg ' פתרון ויטמין s.
2. להתאים את ה-pH ל 5.8 עם קו-
3. לחטא המדיום מאת autoclaving זה (121 מעלות צלזיוס, 20 דקות) או סינון זה דרך מסנן 0.22-מיקרומטר.
   הערה: המדיום סטיריליים שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 חודשים.

2. הכנת המכשיר מערך Micropillar PDMS

1. לחתוך את המכשיר micropillar PDMS על ידי סכין, גילוח או מספריים כדי להתאים לתוך החלק זכוכית (φ 14 מ מ) של צלחת זכוכית-התחתון 35 מ מ.
   הערה: הנוהל המלא של הבנייה התקן PDMS מתואר ניירות הקודם ^{8 , 9}, ולכן הפרטים מושמטים כאן. זכוכית-התחתון מנות עם אמצעי אחסון קטן יותר, כגון לוחות 4-ובכן או 96-ובכן, יכול לשמש עבור הדמיה לטווח קצר בלי המכשיר.
2. Sterilize בחלק העליון של המכשיר PDMS תחת אור UV במשך 15 דקות
3. הפעל את ההתקן PDMS ליד באמצעות פינצטה קצה מרובע, תשאיר את זה מתחת UV אור למשך 15 דקות לחטא התחתון.
4. להעביר את המכשיר PDMS סטיריליים לתוך תבשיל תרבות 35 מ מ ולהוסיף המדיום N5T עד המכשיר לחלוטין טבולים המדיום (כ 5-7 מ"ל).
5. לשים את הצלחת לתוך תא ואקום, ולהפחית את הלחץ דגה. לשמור על שואב אבק עבור h 3 ללון עד האוויר במכשיר מוחלף על-ידי מדיום.
   הערה: המכשיר יכול להיות מנותק על ידי בועות אוויר תחת ואקום חזק.
6. לקחת את המכשיר מתוך קערה על ידי החזקתה עם פינצטה קצה מרובע ושים אותו על מגבת נייר כדי להסיר את בינונית נוספת בצד ולמטה.
   הערה: המדיום על המערך micropillar (משטח עליון) אין להסירו כי הוא ישמש לגידול ביצית.
7. להעביר את המכשיר על גבי זכוכית שקופית 76 מ"מ x 26 מ"מ, המבטיח לשמור את החלק micropillar כמו הצד העליון, ולכסות את ההתקן עם 35 מ מ תרבות מאכל המכסה כדי למנוע המדיום ממנו להתייבש במהלך החילוץ ביצית הבאה.

3. Silique ניתוח והפקת ביצית

1. לחטא מחט (0.40 מ מ G) עם פינצטה בסדר על ידי מנגב עם 70% אתנול. המחט מתבצע בקלות על ידי הצמדתו מקל מזרק או עץ.
2. לבדוק את התפרחת של הצמח ובחר את siliques המתאים לניסוי. Siliques כ 5 מ מ מכילים מופרות, siliques 8-10 מ מ כולל צעירים העוברים הכדוריים.
3. לסלק את siliques באמצעות פינצטה, ומניחים אותם על סרט הדבקה דו-צדדי על כוס שקופית 76 x 26 מ מ. אחד silique מכיל על 40-60 ovules, 3-4 siliques (כלומר, ovules 120-240) מספיקים עבור התקן אחד.
4. פתח את silique (קיר השחלה) כדי לראות את ovules בתוך באמצעות מחט סטיריליים פינצטה תחת stereomicroscope. לחתוך רק את הקיר השחלה כך ovules אינן פגומות.
5. להעביר את silique נפתח אל המדיום N5T במכשיר PDMS (להכין בשלב 2.7), ולשחרר את ovules לתוך האמצעי עם מחט או פינצטה.
6. שמה כוס כיסוי קטן (18 מ מ x 18 מ"מ) על גבי המכשיר PDMS כדי לדחוף את ovules לתוך השטחים במערך micropillar.
7. תוריד את הזכוכית המכסה על-ידי משיכתו אופקית באמצעות פינצטה או האצבעות כדי להסיר בינונית נוספת.
8. הפוך את ההתקן PDMS למקם אותו לתוך צלחת זכוכית-התחתון 35 מ מ, מעט הקש את המכשיר על ידי דחיפת באמצעות את הפינצטה מרובע עצה בשביל להקל הזכוכית.
9. בינוני N5T שופכים בעדינות לתוך הזכוכית-התחתון צלחת על ידי decanting הבקבוק בינונית עד המכשיר PDMS לחלוטין טבולים המדיום, לאטום את המנה עם סרט פרפין.
   הערה: המכשיר PDMS ניתן למחזר, אך התקנים ישנים מדי מנותקים בקלות מהחלק התחתון זכוכית. בנוסף, המכשיר יכול לעוף אם זה לא הוא לחלוטין degassed בשלב 2.5 או המדיום הוא שפך מהר מדי.

איור 2: סכימטי נוהל הכנת הדוגמא.
לזרימה סכמטית לשלבי 3.5 ל 4.1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

4. time-lapse הדמיה

1. למקם את המנה זכוכית-התחתון זה הוכן בשלב 3.9-מיקרוסקופ הפוכה, ובחר ovules מתאימים כדי להתמקד על.
   הערה: כי ovules נבדלים הבמה, מיקום, כיוון, ovules מתאים צריך להימצא על-ידי בדיקת קרינה פלואורסצנטית שלהם סמן.
2. להתחיל לחיות-ההדמיה על פי היצרן ' s ההוראות של מערכת מיקרוסקופ.
   הערה: פרמטרים וציוד מיקרוסקופ הן מגוונות, ובכך המשתמשים צריך לבחור את ההגדרות המתאימות מתאימים לצורך הניסוי. כדוגמה, ההגדרות המשמשות כתב יד זה מפורטים בטבלה 1-

< td > הלהקה לעבור מסננים; 534/30 nm ו- 578/105 nm

ציוד/הגדרת	איור 3 (א) ומשלימה קטעי וידאו 1 ו- 4	איור 3 (ב) ו- 2 הסרטונים משלימה	משלימה 3 הסרטונים
סריקה בלייזר הפוכה מיקרוסקופ (A1R MP)	מיקרוסקופ	ספינינג-דיסק קונאפוקלית מיקרוסקופ הפוכה (CSU-W1)	תיבת סוג הפוכה מיקרוסקופ קונפוקלי המערכת עם תא הדגירה יציב (CV1000)
לייזר	לייזר הפמטו-שנייה Ti:sapphire	לייזרים LD 488 ננומטר, 561-ננומטר	לייזר LD 488 ננומטר, 561-nm
O עדשה bjective	40 X עדשה המטרה טבילה במי (נה = 1.15) טבילה בינונית	60 X עדשה המטרה של טבילה שמן סיליקון (NA = 1.30), רכוב על כונן המוקד Piezo	40 X עדשה המטרה (NA = 0.95)
זיהוי או	חיצוניים שאינם descanned PMT חאספ גלאי	EMCCD מצלמה	מצלמה EMCCD
Dichroic מראה	DM495, DM560	DM488/561	DM400-410/488/561
מסנן	הלהקה לעבור מסננים; 520/35 ננומטר, 593/46 ננומטר	הלהקה לעבור מסננים; 520/50 ננומטר, 617/73 nm
פרוסה לאורך ציר z	z-במחסן 31 עם מרווחי 1-מיקרומטר	z-במחסן 17 עם 3-מיקרומטר אינטר vals	z-במחסן 7 עם 5-מיקרומטר מרווחי
מרווח הזמן	20 דקות	5 דקות	10 דקות

טבלה 1: מיקרוסקופים ומערכות ההגדרות המשמשות בכתב היד.
מיקרוסקופים והפרמטרים הן מגוונות, וכך כל משתמש צריך לבחור את המערכת המתאימים לניסוי.

3. לבדוק את רצף תמונות נרכשות, ולהמיר אותו לתבנית סרט כלליות, כגון .avi או .mov למצגת.
   הערה: אם התוכנה המיקרוסקופ לא פלט את התמונות כתבנית סרט, זה אפשרי לשמור את התמונות. tif ולאחר מכן לפתוח אותם ב- ImageJ, תוכנית קוד פתוח בהשראת התמונה NIH, כדי לשנות את סוג הקובץ. ImageJ הינה מסופקת במלון: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ יכול לשמש גם כדי להפוך Z-sטאק הסרט, כגון התחזית בעוצמה מקסימלית, כפי שמתואר ב: https://imagej.net/Z-functions.

תוצאות

באמצעות שיטת הטיפוח הזאת ביצית, שיטה זו יכולים לעקוב אחר הדינמיקה החיים של קיטוב זיגוטה, העובר המתבנת. זה הישג כי בעבר היה שום טכניקה כדי להמחיש את אופן הפעולה בזמן אמת של הזיגוטה ואת העובר, אשר מוסתרים עמוק בתוך רקמת אמא. איור 3A ו- 1 וידאו משלימה לה...

Discussion

כתב יד זה מציג פשוט במבחנה ביצית טיפוח פרוטוקול זה יעיל לשימוש ההדמיה לחיות תאים של פיתוח מופרות עוברי.

העיצוב של המכשיר PDMS עשוי להזדקק אופטימיזציה לפי השלב העובר. המכשיר המפותח הראשון היה מערך microcage כדי להתאים את הכיוון וכדי לתקן את המיקום של ovules⁹ולאחר מכן...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nitsch basal salt mixture	Duchefa	N0223
trehalose dihydrate	Wako Pure Chemical	206-18455
MES	Dojindo	345-01625
Gamborg’s vitamin solution	Sigma-Aldrich	G1019
35-mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D111300
35 mm culture dish	Corning	430588
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
76 × 26 mm slide glass	Matsunami Glass	S1225
18 × 18 mm slide glass	Matsunami Glass	C018181
needle (gauge 0.40 mm)	Terumo	NN-2719S
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
A1R MP	Nikon	A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF
CSU-W1	Yokogawa Electric		It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.
CV1000	Yokogawa Electric	CV1000-SP84