생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

요약

이 원고는 체 외에 난 재배 방법을 라이브 셀 이미징 애기 zygotes 및 배아의 수를 설명 합니다. 이 메서드는 zygote 분극 동안 세포내 역학 및 배아 개발 세포 운명 명세를 시각화 하기 위해 이용 된다.

초록

대부분의 현 화 식물에 어머니 조직에 깊이 숨겨진 zygote과 태아 하 고 따라서 그것은 오래. 개발 방법의 신비 예를 들어는 zygote 몸 축 설정 하에서 어떻게 하 고 어떻게 태아 장기 형성 동안 다양 한 세포 운명을 지정 합니다. 이 원고는 체 외에 난 문화 메서드를를 라이브 셀 이미징 zygotes과 애기 thaliana의 배아 개발에 대해 설명 합니다. 최적화 된 재배 매체 zygotes 또는 초기 배아 비옥한 식물에 성장 수 있습니다. Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar 배열 장치와 함께 그것을 결합 하 여는 난 같은 위치에 액체 매체에서 개최 됩니다. 이 기정은 늦은 배아 단계에 zygotic 부문에서 몇 일 동안 관찰 하는 현미경 같은 난 중요 합니다. 결과 라이브 셀 이미징 핵 이동 및 골격 재배열, 및 또한 세포 분열 타이밍 및 배아 패턴화 하는 동안 세포 운명 명세와 같은 접합 자 분극의 실시간 역학을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 배아 개발, 다양 한 요인의 영향을 분석할 억제제 치료와 레이저-셀 통신의 역할을 검토 중단 등 광학 조작이 난 재배 시스템에 결합할 수 있습니다.

서문

체의 기본적인 몸 계획 단 세포 접합 자에서 개발 한다. 대부분 꽃 식물, zygotic 사업부는 꼭대기와 촬영 및 루트, 각각¹로 발전 하는 기저 세포를 생성 합니다. 따라서, embryogenesis, 동안 식물 몸은 형성 하는 방법을 이해 하는 것이 중요 하다 하지만 그들은 꽃에서 깊은 곳에서 개발 하기 때문에 직접 생활 zygotes 및 배아의 역학을 관찰 하는 효과적인 도구가 되지 않았습니다. 옥수수, 쌀, 등 여러 monocot 종, 체 외에서 수정 방법 설립된^2,3되었습니다. 이 방법에서는, 고립 된 정자 및 난 자 세포 융합 하는 전기적 또는 화학적으로, 그리고 생성 된 셀 비옥한 식물으로 개발할 수 있습니다. 그러나, dicot 식물, 체 외에서 수정 방법 남성과 여성 gametes^4,5의 세포 주기 비 동기화 상태 때문에 아마도 적절 한 배아를 생산할 수 있다. 또한, 태아를 둘러싼 조직 (endosperm) 배아 개발⁶에 중요 한 역할을 담당합니다.

모델 dicot 종, A. thaliana, 생체 외에서 재배 방법 배아와 endosperm⁷포함 전체 난에 초점을 맞춤 으로써 개발 되었다. 이 시스템은 성공적으로 embryogenesis에 다양 한 화학 시 약의 효과 분석 하는 데 사용 됩니다 하지만 낮은 생존 율을가지고 있기 때문에 시간 경과 영상에 적합 하지 않습니다. 따라서, 소설 체 외에 난 재배 시스템 접합 자 단계도 일찍 시작 하 고 높은 비율⁸에 비옥한 식물 생산 개발 되었다. 다양 한 실험 후 그 니 매체 발견 이었고, 트 레 할 로스는 크게 ovules⁸의 생존 율을 개선. 또한, 때문에 난 그것은 성장 하 고 따라서 현미경의 관측 분야에서 자주 이동 확장, PDMS 장치 매체⁹에 난을 해결 하기 위해 개발 되었다. PDMS 장치는 심장-단계 배아에는 접합 자에서 개발을 추적 하기에 충분 한 3-4 일에 대 한 장기적인 이미지를 사용할 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 그것은 된다 zygote 양극 화와 패턴, 뿐만 아니라 정상적인 조건 하에서 하지만 또한 화학 억제제 존재 또는 다양 한 돌연변이 배경^{8,10에서에서 배아의 역학을 시각화 수 ,11}.

그림 1: 특정 형광 마커 난 통해 배아 Zygotes 시각화 하는 데 사용의 회로도.
애기 zygote 꽃 깊숙한 생성 되는 난에 배아로 발전 한다. 이 체 외에서 배양 시스템, zygote 및 태아는 난을 통해 관찰 하 고 따라서 다른 난 조직에 표시 되지 않는 특정 형광 마커를 사용 하는 것이 중요 하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

프로토콜

1. 준비 체 외에 난 배양의

1. 확인 생체 외에서 난 문화에 대 한 액체 매체 (" N5T 매체 ") 1 x Nitsch 기초 소금 혼합물, 5% (w/v) 트 레 할 로스가 수화물, 0.05 포함 하 % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic 산 (MES)-코 (pH 5.8), 및 1 x Gamborg ' s 비타민 솔루션.
2. 코와 5.8에 pH를 조정.
3. 압력가 마로 소독 하 여 매체 소독 (121 ° C, 20 분) 또는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.
   참고: 소독된 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 2-3 개월.

2. PDMS Micropillar 배열 장치 준비

1. PDMS micropillar 장치 칼, 면도날 또는 35 m m 유리 하단 접시의 유리 부분 (14 m m φ)에 맞게가 위로 잘라.
   참고: 이전 논문 ^{8 , 9}, PDMS 장치 건설의 전체 절차를 설명 하 고 여기에 세부 사항을 생략 됩니다 따라서. 4 잘 또는 96 잘 접시와 같은 더 작은 양으로 유리 하단 요리 단기 이미징 장치 없이 사용할 수 있습니다.
2. Sterilize 15 분의 자외선 아래 PDMS 장치 상단의
3. 평방 팁 핀셋을 사용 하 여 의해 PDMS 장치 그리고 15 분 하단 소독 빛 자외선 아래 계속.
4. 35mm 문화 접시에 멸 균된 PDMS 장치를 전송 하 고 장치는 완전히 매체 (대략 5-7 mL)에 젖 었 때까지 N5T 매체를 추가.
5. 진공 챔버에 접시를 넣어 고 드에 압력을 감소 시키기. 유지 장치에 공중 매체에 의해 대체 될 때까지 하룻밤에 3 h에 대 한 진공 청소기.
   참고: 장치는 강한 진공에서 공기 방울에 의해 분리 될 수 있다.
6. 장치 요리에서 평방 팁 핀셋으로 잡고 고 측면과 하단에 추가 매체를 제거 하는 종이 타월에 넣어.
   참고:이 난 재배에 사용 될 것입니다 micropillar 배열 (상부 표면)에 매체를 제거 하지 합니다.
7. 76 x 26 mm 슬라이드 유리, micropillar 부분 위쪽으로 계속 보장에 장치 전송 하 고 다음 난 추출 하는 동안 밖으로 건조에서 매체를 방지 하기 위해 35mm 문화 접시 뚜껑 장치 커버.

3. Silique 절 개 및 난 추출

1. 70% 에탄올으로 닦아 하 여 바늘 (0.40 m m G) 및 정밀한 족집게를 소독. 바늘 주사기 또는 나무 막대기에 부착 하 여 쉽게 처리 됩니다.
2. 식물의 꽃이 핌을 확인 하 고 실험에 대 한 적절 한 siliques를 선택 합니다. 약 5 m m siliques 포함 zygotes, 그리고 젊은 구형 배아를 포함 하는 8-10 m m siliques.
3. 핀셋를 사용 하 여는 siliques를 소비 세와 76 x 26 mm 슬라이드 유리에 양면 테이프에 그들을 배치. 에 대 한 포함 한 silique 40-60 ovules, 그리고 3-4 siliques (즉, 120-240 ovules)는 한 장치에 대 한 충분 한.
4. 멸 균된 바늘과는 stereomicroscope에서 핀셋을 사용 하 여 내부 ovules를 볼 수 silique (난소 벽)를 엽니다. ovules 손상 되지만 난소 벽 컷.
5. (2.7 단계에서 준비), PDMS 장치에 열린된 silique N5T 매체에 전송 눌렀다가 ovules 매체에 바늘 또는 핀셋.
6. Micropillar 배열에 공간에는 ovules을 PDMS 장치에 작은 덮개 유리 (18 x 18 mm)을 넣어.
7. 가로 추가 매체를 제거 하려면 사용 하 여 핀셋 또는 손가락을 당겨 덮개 유리를 벗고.
8. PDMS 장치를 뒤집어서, 35 m m 유리 하단 접시에 배치 하 고 약간 유리에 붙어 스퀘어 팁 핀셋을 사용 하 여 추진 하 여 장치를 누릅니다.
9. 유리 바닥으로 부드럽게 부 어 N5T 매체 PDMS 장치는 완전히 매체에 배어 때까지 중간 병 decanting 여 접시와 파라핀 영화와 함께 접시를 봉인.
   참고: PDMS 장치 재활용 될 수 있지만 너무 오래 된 장치는 쉽게 유리 바닥에서 분리. 또한, 장치 단계 2.5에서에서 완전히 degassed 하지은 또는 매체는 너무 빨리 부 어 떠 있습니다.

그림 2: 샘플 준비에 대 한 도식 절차.
이 도식 흐름 단계 3.5 4.1에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. 시간 경과 영상

1. 는 거꾸로 한 현미경에 3.9 단계에서 준비 된 유리 하단 접시를 놓고 고에 초점에 적합 한 ovules를 선택 합니다.
   참고: 단계, 위치 및 방향에는 ovules 다르므로 적당 한 ovules 발견 한다 그들의 표식 형광을 확인 하 여.
2. 제조 업체에 따라 라이브 이미징 시작 ' 현미경 시스템의 s 지시.
   참고: 현미경 장비와 매개 변수는, 다양 하 고 따라서 사용자 실험 목적에 맞는 적절 한 설정을 선택 해야 합니다. 예를 들어,이 원고에 사용 되는 설정을 표 1에 나열 됩니다.

< td > 대역 통과 필터; 534/30 nm 및 578/105 nm

장비/설정	그림 3 (A) 및 추가 비디오 1과 4	그림 3 (B) 및 추가 비디오 2	보충 비디오 3
현미경	레이저 스캔 현미경 (A1R MP) 거꾸로	회전 디스크 confocal 거꾸로 현미경 (CSU-W1)	상자 형 반전 confocal 현미경 시스템 안정 인큐베이션 챔버 (CV1000)
레이저	Ti:sapphire 펨 펄스 레이저	488-561-nm 및 LD 레이저	488-561-nm 및 LD 레이저
O bjective 렌즈	물 침수 렌즈 X 40 (나 = 1.15) 침수 매체와	실리콘 기름 침수 렌즈 X 60 (나 = 1.30), 압 전 초점 드라이브에 탑재 된	40 X 렌즈 (나 = 0.95)
검색 또는	외부 descanned 비 GaAsP PMT 검출기	EMCCD 카메라	EMCCD 카메라
Dichroic 거울	DM495 및 DM560	DM488/561	DM400-410/488/561
필터	대역 통과 필터, 520/35, 및 593/46 nm	대역 통과 필터, 520/50 nm와 617/73 nm
z 축 따라 슬라이스	1 µ m 간격으로 31 z-스택	17 z-스택 3 µ m와 인터 벌 스	7 z-5 µ m 간격으로 스택
시간 간격	20 분	5 분	10 분

표 1:는 현미경 시스템 및이 원고에 사용 된 설정을.
현미경 및 매개 변수는 다양 한, 그리고 따라서 각 사용자는 실험에 적합 한 시스템을 선택 해야 합니다.

3. 획득된 한 이미지 시퀀스를 확인 하 고.avi 또는.mov 프레 젠 테이 션에 대 한 같은 일반적인 동영상 포맷 변환.
   참고: 현미경 소프트웨어는 동영상 포맷으로 이미지 출력 수 없습니다, 경우.tif로 이미지를 저장 하 여 다음 ImageJ, 오픈 소스 프로그램 NIH 이미지 파일 형식을 변경 하 여 영감된에서 그들을 엽니다. ImageJ에서 제공 됩니다: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ Z-s를 만들기 위해 사용할 수 있습니다.에 설명 된 대로 최대 강도 프로젝션, 같은 영화를 감싸 다: https://imagej.net/Z-functions.

결과

이 난 재배 시스템을 사용 하 여이 메서드는 zygote 분극 및 모방 하는 태아의 생활 역학을 추적할 수 있습니다. 이 때문에 이전 zygote와 배아, 어머니 조직에 깊이 숨겨져 있는 실시간 동작을 시각화 하 아무 기술 성과 이다. 그림 3A 와 보조 비디오 1 젊은 zygote에서 microtubules (MTs) subapical 지역¹⁰가로 링 축적 보여준다. 이 산 ...

토론

이 원고는 간단한 체 외에 난 재배 하는 프로토콜 zygotes와 배아 개발의 라이브 셀 이미징에 사용 하기 위해 효율적인 소개 합니다.

PDMS 장치 디자인은 배아 단계에 따라 최적화를 할 수 있습니다. 첫 번째 개발된 장치 microcage 배열 방향을 조정 하 고 수정 ovules⁹의 위치를 그리고 다음 micropillar 장치 ovules를 보다 효율적으로 함정을 건설 되었다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nitsch basal salt mixture	Duchefa	N0223
trehalose dihydrate	Wako Pure Chemical	206-18455
MES	Dojindo	345-01625
Gamborg’s vitamin solution	Sigma-Aldrich	G1019
35-mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D111300
35 mm culture dish	Corning	430588
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
76 × 26 mm slide glass	Matsunami Glass	S1225
18 × 18 mm slide glass	Matsunami Glass	C018181
needle (gauge 0.40 mm)	Terumo	NN-2719S
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
A1R MP	Nikon	A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF
CSU-W1	Yokogawa Electric		It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.
CV1000	Yokogawa Electric	CV1000-SP84