Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

Özet

Bu el yazması Arabidopsis zigotları ve embriyo canlı hücre görüntüleme sağlar bir vitro ovule yetiştirme yöntemini açıklar. Bu yöntem sırasında zigot polarizasyon hücre içi dinamikleri ve gelişmekte olan embriyo hücre kader belirtimi görselleştirmek için kullanılmaktadır.

Özet

Çoğu çiçekli bitkiler, zigot ve embriyo anne dokuda derin gizlenir ve böylece uzun nasıl dinamik olarak geliştirmek bir gizem olmuştur; Örneğin, nasıl vücut eksen kurmak için zigot polarizes ve nasıl embriyo organ oluşumu sırasında çeşitli hücre kaderi belirtir. Bu el yazması bir vitro ovule kültür yöntemi zigotları ve embriyoların Arabidopsis thalianageliştirme canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek için açıklar. En iyi duruma getirilmiş ekimi orta zigotları veya erken embriyo bereketli bitkiler büyümek için izin verir. Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar dizi aygıtı ile birleştirerek, ovule aynı konumda sıvı ortamda tutulur. Bu fiksasyon bir mikroskop altında aynı ovule geç embriyo aşamasına zygotic bölümden birkaç gün gözlemlemek çok önemlidir. Elde edilen canlı hücre görüntüleme zigot polarizasyon, nükleer geçiş ve sitoiskeleti düzenlenmesi ve aynı zamanda hücre bölünmesi zamanlama ve hücre kader belirtimi embriyo desenlendirme sırasında gibi gerçek zamanlı dinamikleri izlemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu ovule yetiştirme sistemi çeşitli faktörlerin etkilerini embriyo gelişimini incelemek için önleyici tedaviler ile ve hücre-hücre iletişim rolü incelemek için lazer bozulma gibi optik manipülasyonlar ile birleştirilebilir.

Giriş

Bir organizmanın temel vücut planı tek hücreli bir zigot geliştirir. Çoğu çiçekli bitkilerde bir apikal ve ateş ve kök, sırasıyla¹geliştirmek bir Bazal Hücre zygotic bölümü oluşturur. Bu nedenle, bitki vücut embriyogenez sırasında nasıl oluştuğunu anlamak önemlidir, ancak değil onlar derin çiçek geliştirmek çünkü doğrudan oturma zigotları ve embriyo dinamiklerini gözlemlemek için etkili bir araç olmuştur. Mısır ve pirinç, gibi birçok monocot türü bir vitro fertilizasyon yöntemi kurulan^2,3olmuştur. Bu yöntemde, izole sperm ve yumurta hücreleri elektriksel olarak veya kimyasal olarak erimiş ve oluşturulan hücre bereketli bir bitki gelişebilir. Ancak, dicot bitkiler, uygun embriyolar, muhtemelen kadın ve erkek gamet^4,5senkronize olmayan hücre döngüsü durumu nedeniyle üretebilir yok vitro fertilizasyon yöntemi yoktur. Buna ek olarak, embriyo çevreleyen doku (endosperm) embriyo gelişimi⁶' önemli rol oynar.

Bir modeli dicot tür, A. thaliana, vitro ekimi yöntemi embriyo ve endosperm⁷içeren tüm ovule üzerinde odaklanarak tarafından geliştirilmiştir. Bu sistem başarıyla embriyogenez çeşitli kimyasal reaktifler etkilerini çözümlemek için kullanılan, ancak düşük sağkalım oranı olduğundan zaman hata görüntüleme için uygun değildir. Bu nedenle, bir roman vitro ovule yetiştirme sistemi zigot sahne olarak erken başlamak ve yüksek oranı⁸bereketli bitkiler üretmek amacıyla geliştirilmiştir. Çeşitli denemeler sonra o Nitsch orta bulundu ve trehalose ovules⁸survival oranı önemli ölçüde geliştirilmiş. Buna ek olarak, bu büyür ve bu nedenle sık sık mikroskop gözlem alanı uzak taşır ovule genişletir çünkü PDMS aygıt ovule orta⁹' düzeltmek için geliştirilmiştir. PDMS aygıt bir zigot geliştirmeden kalp-sahne embriyo için izlemek yeterli için 3-4 gün, uzun vadeli görüntüleme etkin. Bu yöntemi kullanarak, zigot polarizasyon ve biçimlenme, sadece normal koşullar altında ama aynı zamanda kimyasal inhibitörleri varlığında veya çeşitli mutant arka planlar^{8,10 embriyo dinamiklerini görselleştirmek mümkün olur ,11}.

Resim 1: Belirli floresan zigotları görselleştirmek ve Ovule aracılığıyla embriyolar için kullanılan veri işaretleyicilerini şematik diyagramı.
Derin çiçek içinde oluşturulan ovule bir embriyo içine Arabidopsis zigot geliştirir. Bu vitro yetiştirme sisteminde zigot ve embriyo ile ovule gözlenir ve böylece diğer ovule dokularda ifade değil belirli floresan işaretçileri kullanmak önemlidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protokol

1. hazırlık In Vitro Ovule kültür orta

1. yapmak sıvı ortamı içinde vitro ovule kültür için (" N5T orta ") 1 x Nitsch Bazal tuz karışımı, %5 (w/v) trehalose dihydrate, 0,05 içeren % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic asit (MES)-KOH (pH 5,8) ve 1 x Gamborg ' s vitamini çözüm.
2. KOH ile 5.8 için pH ayarlama.
3. Orta (121 ° C, 20 dk) veya bir 0,22-µm filtresi filtre tarafından ısıyla sterilize.
   Not: Steril orta için 2-3 ay 4 ° C'de saklanabilir.

2. PDMS Micropillar dizi aygıtı hazırlanması

1. kesme bıçağı, jilet veya cam parçası bir 35 mm cam alt çanak (14 mm φ) sığacak şekilde makas PDMS micropillar aygıt.
   Not: PDMS aygıt inşaat tam prosedürü önceki kağıtları ^{8 , 9} ' anlatılan ve böylece detayları burada göz ardı edilir. Cam-alt yemekleri, 4-şey veya 96-şey tabak gibi daha küçük birimler ile-ebilmek var olmak kullanılmış için aygıtı olmayan kısa vadeli düşsel.
2. Sterilize PDMS cihaz 15 dakika süreyle UV ışık altında üst tarafında
3. Kare uç cımbız kullanarak tarafından PDMS aygıtı ve UV altında alt sterilize etmek 15 dk hafif devam.
4. Steril PDMS aygıt bir 35 mm kültür kabına aktarmak ve cihazın tamamen orta (yaklaşık 5-7 mL) batırılmış kadar N5T orta ekleyin.
5. Çanak vakum bir odaya koyun ve degas basıncı azaltmak. Cihazın havada medyum tarafından değiştirilene kadar gece 3 h için vakumlama devam.
   Not: Cihaz hava kabarcıkları güçlü vakum altında tarafından müstakil.
6. Kare uç cımbız ile tutarak yemek aygıtı almak ve ekstra orta alt ve yan üzerinde kaldırmak için kağıt havlu koyarsın.
   Not: Bu ovule ekimi için kullanılır çünkü micropillar dizi (üst yüzey) medyada tamamen kaldırılmaması gerekir.
7. Micropillar parçası olarak üst tarafı tutmak için sağlanması bir 76 mm x 26 mm slayt cam üzerine bu aygıtı ve 35 mm kültür çanak kapağı aşağıdaki ovule ayıklama sırasında kurumasını üzerinden orta önlemek için aygıtla kapak.

3. Silique diseksiyon ve Ovule çıkarma

1. Sterilize iğne (0.40 mm G) ve iyi cımbız % 70 etanol ile silerek. İğne kolayca bir şırınga veya ahşap sopa ekleyerek ele.
2. Bitki önümüzdeki kontrol ve deney için uygun siliques seçin. Yaklaşık 5 mm siliques zigotları içeren ve 8-10 mm siliques genç küresel embriyo içerir.
3. Cımbız kullanarak siliques tüketim ve onları çift taraflı bant 76 x 26 mm slayt camına yerleştirin. Bir silique içeren hakkında 40-60 ovules ve 3-4 siliques (Yani, 120-240 ovules) bir aygıt için yeterlidir.
4. Steril iğne ve bir stereomicroscope altında cımbız kullanarak içinde ovules görmek için silique (yumurtalık duvar) açın. Ovules hasar görmemiş sadece Over duvar kesti.
5. (2,7 adımda hazırlanan) PDMS aygıtta N5T orta açılan silique transfer ve ovules orta iğne veya cımbız ile serbest.
6. Ovules micropillar dizideki alanlarda içine itmek için PDMS cihazın üzerine küçük bir kapak bardak (18 x 18 mm) koymak.
7. Cam yatay olarak ekstra orta kaldırmak için cımbız veya parmak kullanarak çekerek çıkar.
8. PDMS aygıt ters çevirin, bir 35 mm cam alt çanak yerleştirin ve biraz cam sopa kare uç cımbız kullanarak basarak cihazın basın.
9. Cam alt içine yavaşça dökün N5T orta çanağı PDMS cihazın tamamen ortamda batırılmış kadar orta şişe decanting ve parafin film ile çanak mühür.
   Not: PDMS aygıtı geri dönüştürülmüş olabilir, ama çok eski aygıtları kolayca cam alttan ayrılır. Ayrıca, cihazın tamamen adım 2.5 degassed değil veya orta çok çabuk dökülür savrulabilir.

Resim 2: için numune hazırlama şematik yordam.
Bu şematik akış adımları 3.5 4.1 karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. time-lapse Imaging

1. ters bir mikroskop 3.9 adımda hazırlanan cam alt çanak yerleştirin ve odaklanmak için uygun ovules seçin.
   Not: sahne, pozisyon ve yönde ovules farklı olduğundan, uygun ovules onların işaret Floresans kontrol ederek bulunabilir.
2. Başlamak canlı görüntüleme üreticiye göre ' s yönergeleri mikroskop sistemi.
   Not: Mikroskop ekipman ve parametreleri çeşitlidir ve böylece kullanıcılar için deneme amaçlı uygun uygun ayarları seçmeniz gerekir. Örneğin, Tablo 1 ' de bu el yazması kullanılan ayarları listelenir.

< td > bant geçiren Filtre; 534/30 nm ve 578/105 nm

ekipman/koyma	şekil 3 (A) ve tamamlayıcı Videolar 1 ve 4	Şekil 3 (B) ve tamamlayıcı Video 2	tamamlayıcı Video 3
mikroskop	lazer tarama mikroskop (A1R MP) ters	dönen disk confocal ters mikroskop (CSU-W1)	Kutu-tip ters confocal mikroskop sistem istikrarlı kuluçka Odası (CV1000) ile
lazer	Ti:sapphire femtosecond pulse lazer	488-nm ve 561-nm LD lazerler	488-nm ve 561-nm LD lazer
O bjective lens	40 X su-daldırma objektif lens (NA = 1,15) daldırma orta ile	60 X silikon yağı daldırma objektif lens (NA 1,30 =), bir Piezo odak sürücüde takılı	40 X objektif lens (NA = 0,95)
Algıla veya	dış descanned sigara GaAsP Devresel_ödeme dedektörü	EMCCD kamera	EMCCD kamera
Dichroic ayna	DM495 ve DM560	DM488/561	DM400-410/488/561
filtre	bant geçiren Filtre; 520/35 nm ve 593/46 nm	bant geçiren Filtre; 520/50 nm ve 617/73 nm
z ekseni boyunca dilim	31 z-Baca'ya 1 µm aralıkları	17 z-Baca'ya 3 µm Inter vals	7 z-Baca'ya 5-µm aralıkları
zaman aralığı	20 dk	5 dk	10 min

Tablo 1: Mikroskop sistemleri ve bu el yazması kullanılan ayarları.
Parametreleri ve mikroskoplar çeşitlidir ve böylece her kullanıcı deney için uygun sistemi seçmelisiniz.

3. elde edilen görüntü sırası kontrol ve .avi ya da .mov sunu için gibi genel film biçime dönüştürmek.
   Not: belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı görüntüleri bir film biçimi olarak çıktı olamaz eğer mümkün .tif görüntüleri kaydetmek ve sonra onları ImageJ, açık kaynaklı bir program tarafından NIH görüntü dosya türünü değiştirmek için ilham açın. ImageJ adlı sağlanır: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ bir Z-s yapmak için de kullanılabilir.Film, maksimum yoğunluk projeksiyon gibi açıklandığı gibi tuck: https://imagej.net/Z-functions.

Sonuçlar

Bu ovule yetiştirme sistemi kullanarak, bu yöntem zigot polarizasyon ve embriyo desenlendirme yaşam dinamikleri izleyebilirsiniz. Daha önce yoktu çünkü gerçek zamanlı davranışı anne dokuda derin gizli olan zigot ve embriyo, görselleştirmek için hiçbir teknik bir başarı 's. Şekil 3A ve tamamlayıcı Video 1 genç zigot içinde mikrotübüller (MTs) subapical bölge¹⁰enine bir halka olarak birikir gös...

Tartışmalar

Bu el yazması zigotları ve embriyo geliştirme canlı hücre görüntülemede etkilidir bir basit vitro ovule ekimi protokol tanıttı.

PDMS aygıt tasarım optimizasyonu embriyo sahne göre gerekebilir. Bir microcage dizi yönlendirmesini ayarlamak için ve ovules⁹konumunu düzeltmek için ilk geliştirilen cihaz olduğunu ve o zaman micropillar aygıt ovules daha verimli bir şekilde yakalamak için inşa edilmiş⁸. Ayrıca, micropil...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nitsch basal salt mixture	Duchefa	N0223
trehalose dihydrate	Wako Pure Chemical	206-18455
MES	Dojindo	345-01625
Gamborg’s vitamin solution	Sigma-Aldrich	G1019
35-mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D111300
35 mm culture dish	Corning	430588
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
76 × 26 mm slide glass	Matsunami Glass	S1225
18 × 18 mm slide glass	Matsunami Glass	C018181
needle (gauge 0.40mm)	Terumo	NN-2719S
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
A1R MP	Nikon	A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF
CSU-W1	Yokogawa Electric		It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.
CV1000	Yokogawa Electric	CV1000-SP84