体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

要約

本稿では体外胚珠栽培手法についてシロイヌナズナ受精および胚の住セルイメージ投射を可能にします。このメソッドを利用して、受精卵の偏波の中に細胞内動態と初期胚細胞運命決定を可視化します。

要約

ほとんどの顕花植物の受精および胚は母組織の奥深くに隠されて、従ってそれは長年どのように彼らを動的に開発の謎たとえば、どのように受精は体軸や器官形成の時に胚が様々 な細胞運命を指定する方法を確立する分極します。本稿では、受精とシロイヌナズナの胚の開発の住セルイメージ投射を実行する胚珠体外培養法について説明します。最適化された培地では、受精卵や初期胚肥沃な植物に成長することができます。ポリジメチルシロキサン (PDMS) 駆動式マイクロピラー アレイ デバイスと組み合わせて、胚珠は同じ位置に液体培地で開催されます。この固定は、ココヤシの部門から数日間胚後期に顕微鏡下で同じ胚珠を観察することが重要です。結果住セルイメージ投射を使用して核移行と細胞骨格の再編とも細胞分裂のタイミングや胚パターン形成時の細胞運命仕様など、受精卵の偏波の実時間ダイナミクスを監視できます。さらに、胚発育に及ぼす諸因子の影響を分析する阻害剤治療と細胞間コミュニケーションの役割を調べるレーザー破壊などの光の操作は、この胚珠培養システムを結合できます。

概要

単細胞受精卵から有機体の基本的なボディ計画を開発します。ほとんどの顕花植物のココヤシ部門は、樹状突起と撮影やルート、¹それぞれに発展する基底のセルを生成します。したがって、胚発生に伴う植物体を形成する方法を理解することが重要だが、彼らは花に深く成長するのでリビング受精および胚のダイナミクスを直接観測する効果的なツールをされていません。トウモロコシ、米などのいくつかの単子葉種体外受精法は確立された^2,3をされています。この方法では分離精子と卵細胞を電気的または化学的に、融合し、生成されたセル、肥沃な工場に開発。ただし、双子葉植物植物の雄性と雌性の配偶子の^4、5の細胞周期の非同期状態のためおそらく適切な胚を作り出すことができる体外受精法ではありません。さらに、胚周囲組織 (胚乳) は、胚の開発⁶で重要な役割を果たしています。

モデルの双子葉植物の種、シロイヌナズナ、体外の栽培方法は、胚と胚乳の⁷を含む全体の胚珠に焦点を当てによって開発されました。このシステムは正常に様々 な化学試薬の胚発生に及ぼすを分析に使用されたが、低い生存率をもっているため時間経過イメージ投射のため適していません。そこで、新規培養胚珠の栽培システムは、受精卵の段階として早期に開始高比⁸で肥沃な植物を生成するために開発されました。様々 な試験後 Nitsch 培地が分かったし、トレハロースが胚珠⁸の生存率を大幅に向上します。さらに、胚珠の展開としては成長して、従って頻繁に顕微鏡の観察フィールドから移動、ために、⁹の中の胚珠を修正する PDMS 装置が開発されました。PDMS デバイスは、心期胚には受精卵から開発をトレースするのに十分である 3-4 日間の長期的なイメージングが有効になります。このメソッドを使用して、それは偏波受精卵・胚のパターンだけでなく通常の条件下でも低分子阻害剤の存在下でまたは様々 な突然変異体の背景^{8,10 のダイナミクスを可視化することが可能になります。 ,11}。

図 1: 視覚化受精し胚を胚珠を使用特定の蛍光マーカーの模式図。
シロイヌナズナの受精卵は、花の奥深くに生成される胚珠の胚に開発しています。体外培養システム、受精卵・胚胚珠、観察、従って他の胚珠組織で表されない特定の蛍光マーカーを使用することが重要です。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

プロトコル

1 体外 胚珠培養培地の調製

1. を 体外 の胚珠培養用液体培地 (" N5T 中 ") 1 x Nitsch 基底塩混合物、5% (w/v) トレハロース二水和物、0.05 を含む。% (w/v) の 2-(N morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES)-島 (pH 5.8) 1 x Gamborg ' s ビタミン ソリューションです
。
2. 島の 5.8 に pH を調整します
。
3. は、オートクレーブに入れることによって媒体を滅菌 (121 ° C、20 分) または、0.22 μ m フィルターをフィルタ リングします
   。 注: 滅菌媒体格納できる 4 ° C で 2 - 3ヶ月
。

2。PDMS 駆動式マイクロピラー アレイ素子の作製

1. カット ナイフ、かみそりの刃または 35 mm ガラス底皿のガラスの部分 (14 mm φ) に収まるようにハサミで PDMS 駆動式マイクロピラー デバイス
   。 注: PDMS 装置建設の完全な手順は前論文 ^{8 , 9} で説明、ここでこうして、詳細は省略します。デバイスがなくても短期的なイメージングのため 4 ウェルまたは 96 ウェルのプレートなどの小さいボリュームでガラス底培養皿を使用できます
。
2. 定置滅菌 15 分の紫外線の下で PDMS 装置の上側
3. 正方形のチップ ピンセットを使用してによって PDMS 装置を切り、底を殺菌する 15 分の軽い UV の下でそれを維持します
。
4. 35 mm ディッシュに滅菌の PDMS デバイスを転送し、デバイスは培地 (約 5-7 mL) で完全に浸漬されるまで N5T 培地を追加します
。
5. 料理を真空チャンバーに入れて、ガスを抜き圧力を減らします。一夜にしてデバイスの空気が媒体によって置き換えられるまで 3 時間掃除機を維持します
   。 注: デバイスは、強力な真空の下で空気の泡で切り離すことが
。
6. 皿から正方形のチップ ピンセットでそれを保持することによって、デバイスを取るし、サイドと下部に余分なメディアを取り出してペーパー タオルの上に置く
   。 注: これが胚珠の耕作のために使用されるため、駆動式マイクロピラー アレイ (上面) に媒体を削除しないでください
。
7. アッパー サイドとして駆動式マイクロピラーの部分を保つために確保、76 mm × 26 mm スライド ガラス上にデバイスを転送し、次の胚珠抽出中に完全に乾くことから媒体を防ぐために 35 mm の文化料理ふた付きのデバイスをカバーします
。

3。Silique 郭清と胚珠抽出

1. 70% エタノールで拭くことによって針 (0.40 mm G) と高級ピンセットを消毒します。針は、注射器や木の棒に接続し、簡単に処理します
。
2. は、植物の花序をチェックし、実験のための適切な siliques を選択します。約 5 mm siliques 含む受精卵と 8-10 mm siliques 若い球状胚があります
。
3. は、ピンセットを使用して、siliques を消費税し、76 × 26 mm スライド グラス上に両面テープの上に置きます。について 1 つの silique が含まれています 40 60 胚珠と 3-4 siliques (すなわち 120-240 胚珠) が 1 つのデバイスにとって十分です
。
4. は、滅菌注射針と顕微鏡下で、ピンセットを使用して胚珠を表示する silique (子房壁) を開きます。胚珠は破損していないように子房壁のみをカットします
。
5. (2.7 の手順で準備) PDMS のデバイスに N5T 中に開かれた silique を転送し、針やピンセットで媒体に胚珠をリリースします
。
6. 駆動式マイクロピラー アレイ内のスペースに胚珠をプッシュする PDMS デバイス上に小さなカバー ガラス (18 mm × 18 mm) を配置します
。
7. 余分なメディアを削除するピンセットや指を使用して横に引いてカバーガラスを脱ぐ
。
8. PDMS デバイスを裏返し、35 mm ガラス底皿に置き、少しガラスに固執する正方形のチップ ピンセットを使用してを押してデバイスを押し
。
9. ガラス底にそっと注ぐ N5T 媒体まで PDMS 装置は中、ずぶ濡れ中瓶をデカントで皿し、パラフィン フィルムが付いている皿をシールします
   。 注: PDMS デバイスは、リサイクルすることができますが、あまりにも古いデバイスは、ガラス底から容易に切り離します。手順 2.5 では完全に脱がないまたは媒体は余りにすぐに注がれる場合デバイスがさらに、浮かぶかもしれない
。

図 2: 試料の概略プロシージャ
。 このフロー図は、手順 3.5 から 4.1 に対応します。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。

4 低速度撮影画像

倒立顕微鏡、3.9 ステップで準備されたガラス底皿を配置し集中する適切な胚珠をオン]

1. .
   。 注: ステージ、位置、および方向で、胚珠が異なりますので適切な胚珠発見されるべき自分のマーカーの蛍光をチェックしています
。
2. は、メーカーによるとライブ イメージングを開始 ' 顕微鏡システムの指示
   。 注: 顕微鏡装置およびパラメーター多様であり従ってユーザーが実験目的に合った適切な設定を選択する必要があります。例として、この原稿で使用される設定は、表 1 に示す
。

< td> バンドパス フィルター;534/30 nm と 578/105 nm

機器/設定	図 3 (A) および補足のビデオ 1 4	図 3 (B) および補足のビデオ 2	補足動画 3
顕微鏡	倒立レーザー走査顕微鏡 (A1R MP)	回転ディスク共焦点倒立顕微鏡 (CSU W1)	ボックス型逆安定したインキュベーション室 (CV1000) と共焦点顕微鏡システム
レーザー	フェムト秒パルス レーザー	488 nm および 561 nm の LD レーザ	488 nm および 561 nm の LD レーザ
O組込めますレンズ	水浸対物レンズ × 40 (NA = 1.15) 浸漬媒体	シリコーン油浸対物レンズ X 60 (NA = 1.30)、ピエゾ フォーカス ドライブにマウントされている	40 X 対物レンズ (NA = 0.95)
検出または	外部非 descanned GaAsP PMT 検出器	EMCCD カメラ	EMCCD カメラ
ダイクロイック ミラー	DM495 と DM560	DM488/561	DM400-410/488/561
フィルター	バンドパス フィルター; 520/35 nm、および 593/46 nm	バンドパス フィルター; 520/50 nm と 617/73 nm
z 軸に沿ったスライス	1 μ m 間隔で 31 z スタック	17 z スタック 3 μ m の間ヴァルス	5 μ m 間隔で 7 z スタック
時間	20 分	5 分	10 分

テーブル 1:顕微鏡システム、この原稿で使用される設定します
。 顕微鏡とパラメーターは多様であり従って各ユーザーは、実験のための適切なシステムを選択してください

。

3. 取得イメージ シーケンスを確認し、.avi またはプレゼンテーションに .mov などの一般的なムービー形式に変換します
   。 注: 顕微鏡のソフトウェアは、ムービー形式として、映像を出力できませんは、ImageJ、NIH イメージ、ファイルの種類を変更するに触発されたオープン ソース プログラムで開いて .tif として画像を保存することが可能。ImageJ を提供しています: https://imagej.nih.gov/ij/。ImageJ は、Z s を作るためにも使用できます。説明したように最大強度投影など、ムービーを挟む: https://imagej.net/Z-functions です
。

結果

このメソッドはこの胚珠培養システムを用いた偏波受精卵・胚パターン形成生活動態をトレースできます。これは、以前母親組織に深く隠されている受精卵及び胚のリアルタイム挙動を可視化する技術がなかったので成果です。図 3 aと補足のビデオ 1若い受精卵における微小管 (MTs) 穎地域¹⁰の横のリングとして蓄?...

ディスカッション

本稿では、単純な体外胚珠栽培プロトコルは、受精卵や胚の開発の住セルイメージ投射で使用するため効率的を紹介します。

PDMS 装置の設計は、胚の段階に応じて最適化を必要があります。開発の最初のデバイスは microcage 配列方向を調整し、胚珠⁹の位置を修正してより効率的に胚珠をトラップし、駆動式マイクロピラー デバイスを構築しまし?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nitsch basal salt mixture	Duchefa	N0223
trehalose dihydrate	Wako Pure Chemical	206-18455
MES	Dojindo	345-01625
Gamborg’s vitamin solution	Sigma-Aldrich	G1019
35-mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D111300
35 mm culture dish	Corning	430588
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
76 × 26 mm slide glass	Matsunami Glass	S1225
18 × 18 mm slide glass	Matsunami Glass	C018181
needle (gauge 0.40mm)	Terumo	NN-2719S
Immersion medium Immersol W 2010	Zeiss	444969-0000-000
A1R MP	Nikon	A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF
CSU-W1	Yokogawa Electric		It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.
CV1000	Yokogawa Electric	CV1000-SP84