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摘要

线粒体含有几种黄素依赖的酶, 可以产生活性氧 (ROS)。由于不需要的副作用, 监测线粒体中单个部位的 ROS 释放具有挑战性。我们提出了一种简单, 廉价的方法直接评估的本地率的 ROS 释放使用纯化 flavoenzymes 和微板块荧光。

摘要

据报道, 线粒体可以包含多达12种酶源的活性氧 (ROS)。大多数这些网站包括黄素依赖的呼吸复合体和脱氢酶, 产生超氧化物的混合物 (O 2) 和过氧化氢 (H 2 O 2).由于抗氧化剂防御系统的存在和侧面反应, 也形成 O2/H2O2, 因此, 对孤立线粒体中单个站点的 ROS 产生潜能的准确量化可能会有挑战性。使用可破坏线粒体生物能学的非特异性抑制剂也可以通过改变其他生产场所的 ROS 释放来降低测量结果。在这里, 我们提出了一个简单的方法, 同时测量 H2O2释放和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 生产的纯化黄素链脱氢酶。为了我们的目的, 我们用纯化的丙酮酸脱氢酶复合物 (PDHC) 和αα-脱氢酶复合物 (KGDHC) 的猪心源为例。此方法允许通过消除其他潜在的 ROS 和抗氧化剂系统的来源, 精确测量本机 H2O2的发布速率。此外, 该方法还可以直接比较 H2O2释放与酶活性之间的关系, 以及筛选活性抑制剂对 ROS 生产的有效性和选择性。总的来说, 这种方法可以在进行更复杂的实验时, 对单独的线粒体或透肌纤维进行更精密的试验, 从而对个体酶的原生氧释放率进行深入评估。

引言

营养代谢的最终目的是使三磷酸腺苷 (ATP)。在哺乳动物细胞中, 这发生在线粒体, 双 membraned 细胞器, 将储存在碳中的能量转化为 ATP。ATP 的产生是在碳被形成两个电子载体、NADH 和黄素腺嘌呤二核苷酸 (FADH2)1的线粒体燃烧时开始的。NADH 和 FADH2分别由多亚基呼吸复合体 I 和 II 氧化, 并且被解放的电子被运到终端电子受体分子氧 (O2) 在复杂 IV1。热力学上有利的 "下坡" 转移电子到O 2 在链子的末端被结合对质子的出口入膜间隙空间由复合体 I, III 和 iv。这创造了质子的跨膜电化学梯度 (质子动力), 一种临时形式的吉布斯自由能, 被复杂的 V 挖掘, 使 ATP2。线粒体中的电子转移反应与 ATP 生产不完全耦合。在克雷布斯周期和呼吸链的不同点, 电子可以过早地与 O2相互作用, 形成 ROS3。线粒体产生的最生物相关的 ROS 为 O2和 H 2O2。尽管 O2通常被认为是由线粒体形成的近端 ROS, 但现在明显的是, 生产地点形成了 O2和 H 2O2的混合物, 这与自由黄素假肢组的激进化学4,5。在高水平, ROS 可能是危险的, 破坏细胞功能所需的生物成分, 导致氧化窘迫6。然而, 在低数量, 线粒体 ROS 实现重要的信号功能。例如, 从线粒体释放的 H2O2被牵连到控制 T 细胞活化、应力信号 (例如、诱导 Nrf2 信号通路)、诱导细胞增殖和分化,胰岛素信号和释放, 和喂养行为7。在了解 ROS 信号功能方面取得了相当大的进展。然而, 对于线粒体中的酶作为最重要的来源和如何控制生产, 仍然存在重要的问题。

ROS 的释放由一个地点生产取决于几个因素: 1) 电子捐赠站点的集中, 2) 电子捐赠站点的氧化还原状态, 3) 获得氧气, 和 4) 氧化基底的浓度和类型3,8,9. 在线粒体中, 其他因素, 如 NADH 的浓度和膜电位强度也影响 ROS 生产8,10。例如, O2/H2O2生产的速率由纯化的 PDHC 或 KGDHC 增加, NADH 可用性5,11。在这种情况下, 电子从 NADH 向后流向 PDHC 或 KGDHC E3亚基中的时尚中心, O2/H2O2生产12的站点。同样, 提供的 NAD+具有相反的效果, 减少了 KGDHC12中的 ROS 释放。因此, 控制来自 ROS 生产场所的电子进入或退出可以改变多少 O2/H2O2的形成。例如, 用 CPI-613 (硫辛酸模拟) 阻止 PDHC 或 KGDHC 的 E2亚基, 在 O2/H2O2生产13中, 结果几乎减少90%。类似的结果可以获得与化学 s-glutathionylation 催化剂, 胍和双硫醒, 几乎废除O2/H2O 2 生产由 PDHC 或 KGDHC 通过共轭谷胱甘肽到 E2亚基14。通过 PDHC 和 KGDHC E2亚基阻断电子流的权衡是 NADH 产量的减少, 这降低了电子传输链 (例如, 复杂 III) 的 ROS 形成。这也可以减少电子传输链的 ATP 输出。总的来说, 阻止电子进入 ROS 生产场所可以是控制 O2/H2o2生产的高效方法。

线粒体最多可包含 12个潜在 O2/H2O2源6。这些站点中的大多数都是黄素的酶, 它们生成了 O2和 H 2O2的混合物。使用不同的基质和抑制剂组合, 可以确定哪些呼吸复合体和线粒体脱氢酶作为高容量 O 2/H 2 O 2 形成站点在不同的组织3。PDHC 和 KGDHC 已被证明为高容量 O2/H2O2在肌肉和肝脏线粒体13,15发射站点。但是, 在检查 O2/H2O2形成线粒体中单个站点的潜力以及不同基质和抑制剂组合对其产生的影响方面仍存在一些困难酶的活性。这是由于存在不需要的副作用 (例如, 形成 O2/H2O2由非兴趣酵素以外的站点), 污染内源营养素 (例如,脂肪酸) 或细胞器(例如,, 过氧化物酶体也形成O2-/H2O2), 使用缺乏选择性的抑制剂和/或使用不完全抑制 ROS 生产的化合物。某些抑制剂还能改变线粒体的生物能学和电子流的方向, 这就改变了 ROS 从其他生产场所释放出来的活性和混淆结果。o2/H2O2 从单个站点释放的绝对速率也难以量化由于 O2-和 H2o2消除基质中的酶和膜间隙空间。因此, 消除可能干扰 o2/H2O2发布测量的任何相互竞争的反应, 在识别高容量 O2/2o2 时, 都很有用。形成站点。

在这里, 我们提出一个简单的方法, 允许同时检查 O2/H2O2生产和 NADH 形成由纯化的黄素依赖脱氢酶。通过使用纯化的酶, 不需要的 ros 形成的副作用和 ros 降解酶可以消除, 允许更准确地测量本地 O2/H2o2生产率为个别 flavoenzymes。此方法可用于直接比较 o2/H2O2的不同纯化脱氢酶的形成能力, 或为 o 2-/h 2 o 筛选潜在的站点特定抑制剂。2版本。最后, 测量 O2/H2O2和 NADH 生产同时可以对酶活性与 ROS 释放能力之间的关系进行实时评估。

研究方案

1. 化学物质和纯化酶

  1. 采购以下材料: 猪心源的 PDHC 和 KGDHC (或另一种纯化的线粒体 flavoenzyme);H2O2 (30% 解决方案), 丙酮酸、αα-、NAD+、NADH、CoASH、磷酸硫胺 (TPP)、甘露醇、HEPES、蔗糖、EGTA、3-甲基2羰基戊酸 (KMV)、超氧化物歧化酶 (SOD)、辣根过氧化物酶 (HRP)、10-乙酰基 37-dihydroxyphenoxazine 试剂 (AUR) 和 CPI-613。

2. 计划化验及试剂制备

  1. 根据96井板中的表 1设置检测。
    注: 每种反应的总容积为200µL. 调整库存浓度, 使20µL 试剂添加到每个井中。这确保了在开始试验之前, 快速添加辅助因子和基底对每个反应良好。
  2. 制备含有220毫米甘露醇、70毫米蔗糖、1毫米 EGTA 和20毫米 HEPES (pH 7.4 与 HCl) 的反应缓冲液。
    注意: 这可能会根据不同的纯化酶的物理特性而改变。
  3. 使用酶活性测定法检查纯化的 KGDHC 或 PDHC 的污染情况14,16,17或应用免疫印迹或考马斯着色5。
  4. 根据表 1中的工作溶液浓度, 准备反应缓冲器中的所有试剂。
  5. 将所有试剂贮存为1毫升整除数在-20 摄氏度。在 100-µL 整除数中储存丙酮酸和αα-, 以防止自氧化和反复冻融导致的自发降解。
  6. 在1毫升亚砜中制备 AUR 试剂, 然后在反应缓冲液中稀释至100µM。存储保护不受光照。
    注: 在这里, 100 µM 工作解决方案是新鲜的每2到3周, 并保护免受光。

3. 建立化验模板

  1. 在具有双测量能力的单色微板块阅读器上设置检测程序。
  2. 通过选择 "协议" 来定义阅读过程。然后单击 "过程"。
  3. 将 "温度" 设置为25°c (图 1A)。
  4. 单击 "启动动能" 以设置读取条件 (图 1A)。设置读取间隔/实验的时间和数量。
  5. 单击 "读取" (图 1B)。
    注: 样品从顶部的位置读取, 增益为50。时间: 5 分钟, 以30秒为间隔读取。通道 1: 试卤灵荧光激发/发射 = 565 nm:600 nm, 波长宽度 13.5 nm。通道 2: NADH 自发荧光-激发/发射 = 376 nm:450 nm, 波长宽度 20 nm。
  6. 在 "读取" 下, 选择要监视的水井 (例如、A1-A4 和 B1-B4)。
  7. 选择 "结束动能"。

4. 标准曲线

  1. 解冻试剂和储存在冰, 直到需要。
  2. NADH 标准曲线 (图 2A)
    1. 在反应缓冲液中, 为 0.5-10 毫米的浓度范围准备 NADH 的工作溶液。
    2. 将每个 NADH 工作溶液浓度的20µL 整除数添加到含有180µL 反应缓冲器的井中。NADH 在每个井中的最终浓度为0.05-1 毫米。
    3. 单击 "读取" 并设置激发/发射 = 376 nm:450 nm, 波长宽度为 20 nm。
      注意: 这是只读端点-不需要动能参数。
  3. AUR 标准曲线 (图 2B)
    1. 在反应缓冲器中制备过氧化氢的工作储存;库存浓度从 200-4, 000 nM 不等。
    2. 将反应缓冲器的120µL 添加到每个井中。
    3. 添加20µL (工作库存浓度 = 30 U/毫升, 最后集中在井 = 3 U/毫升), 20 µL SOD (工作存货集中 = 250 u/毫升, 最后集中在井 = 25 U/毫升) 和20µL AUR (工作存货集中 = 100 µM, 最后集中在井 = 10 µM) 对每个井包含反应缓冲。
    4. 将每个 H2O2工作库存解决方案的20µL 添加到每个包含缓冲区和检测试剂的井中。最终反应量为200µL, 每个井中 H2O2的最终浓度为 20-400 nM。
    5. 在25摄氏度的平板阅读器中孵化出1分钟的板材。
    6. 单击 "读取" 并设置激发/发射 = 565 nm/600 nm, 波长宽度为 13.5 nm。请注意, 这是只读端点-不需要动能参数。

5. 测量 O2/H 2 O2发布和 NADH 生产由 KGDHC 和 PDHC

  1. 有关不同试剂的添加顺序、每个工作解决方案的浓度以及每个井中添加的卷, 请参见表 1 。
  2. 每井加40µL 反应缓冲液。对于使用 KMV 或 CPI-613 的检测, 请在每个井中添加20µL 缓冲区。
  3. 添加20µL 的 PDHC 或 KGDHC (工作库存的 1 U/毫升, 最终浓度每井 = 0.1 U/毫升) 每个井。
  4. 孵育 PDHC 和 KGDHC 在25°c 2 分钟。
  5. 添加20µL 的 KMV (工作库存 = 100 毫米, 最终浓度 = 10 毫米) 或20µL CPI-613 (工作库存浓度 = 1.5 毫米, 最终浓度 = 150 µM) (表 2)。
    注: 如果抑制剂未用于化验, 则可排除此步骤。
  6. 孵育1分钟, 在25摄氏度。
    注: 如果抑制剂未用于化验, 则可排除此步骤。
  7. 添加20µL (工作库存浓度 = 30 单位/毫升, 最终浓度在井 = 3 单位/毫升) 和20µL 的 SOD (工作库存浓度 = 250 单位/毫升, 最终集中在井 = 25 单位/毫升) 对每个井。
  8. 添加20µL 辅酶 A (工作库存浓度 = 1 毫米, 最后集中 = 0.1 毫米), TPP 的20µL (工作存货集中 = 3 毫米, 最后集中 = 0.3 毫米) 和20µL 的 NAD+ (工作存货集中 = 10 毫米, 最后集中 = 1 毫米) 对每个 w告诉.
  9. 将 AUR 试剂从保护性锡纸覆盖物中取出, 并在每个井中加20µL。
  10. 添加20µL 丙酮酸盐 (工作存货浓度从1-100 毫米, 最后浓度为化验 = 0.1-10 毫米) 到含 PDHC 和αα-的水井 (工作库存浓度不等于1-100 毫米, 最终浓度为化验 = 0.1-10 毫米) 到含 KGDHC 的水井。
  11. 单击 "读取" 开始动态测量。

6. 数据分析

  1. 按住键盘上的 "CTRL" 按钮, 然后单击 "水井" 生成一个包含与1通道 (图 3A) 对应的所有动态测量的图表。
  2. 在不同时间点 (图 3B) 测量的相对荧光单元 (RFU) 的原始值, 单击右上角的视图图标中的 "数据"。
  3. 导出分析值 (表 3)。
  4. 单击右上方的 "图表" 下拉菜单 (图 3B) 可访问与荧光通道2关联的 RFU 值。
  5. 对通道2重复步骤6.1 到6.3。

结果

图 3A为在同时测量 H2O2和 NADH 生产过程中收集的 RFU 提供了一个具有代表性的跟踪。图 3B中描述了每个时间间隔的原始 RFU 数据。然后导出原始 RFU 数据以进行分析。通过从图 2中显示的标准曲线推断, 可以确定在 5 min 期间的每个测量间隔内形成的 NADH 和 H2O2的绝对量。在

讨论

该协议是有利的, 因为, 1) 它消除了任何可能干扰 H2O2检测 (如, 抗氧化剂系统或其他 ROS 来源), 2) 的相互竞争的反应, 提供直接评估的本地率ros 释放的黄素线粒体脱氢酶, 3) 允许比较的本地 ros 释放率的两个或更多的纯化黄素脱氢酶, 4) 可以允许直接比较 ros 释放率和酶活性, 和 5)允许筛选活性氧释放的选择性竞争抑制剂。我们的小组和其他人在以前的出版物中使用这种方法来?...

披露声明

没有什么可透露的。

致谢

这项工作由加拿大自然科学和工程研究委员会 (NSERC) 资助。视频制作是与纽芬兰纪念大学教与学创新中心 (CITL) 合作进行的。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Pyruvate dehydrogenase complexSIGMAP7032-10UNpurified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complexSIGMAK1502-20UNpurified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solutionSIGMAHX0640-5reagent, standard curves
NAD+SIGMAN0632-1Greagent, activity/ROS release assay
NADHSIGMAN4505-100MGreagent, standard curves
pyruvateSIGMAP2256-5Greagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarateSIGMA75892-25Greagent, activity/ROS release assay
CoASHSIGMAC3019-25MGreagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphateSIGMAC8754-1Greagent, activity/ROS release assay
mannitolSIGMAM4125-100Gbuffer component
HepesSIGMAH3375-25Gbuffer component
sucroseSIGMAS7903-250Gbuffer component
EGTASIGMAE3889-10Gbuffer component
KMVSIGMA198978-5Greagent, ROS release inhibitor
CPI-613Santa Cruzsc-482709reagent, ROS release inhibitor
SODSIGMAS9697-15KUreagent, ROS release detection
horseradish peroxidaseSIGMAP8375-1KUreagent, ROS release detection
Amplex Ultra RedThermofisherA36006reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate readerBioTek Instrumentsmicroplate reader for assays
Gen5 softwareBioTek Instrumentssoftware, used for collection of raw RFU
Graphpad PrismGraphpad softwaresoftware, data analysis
Microsoft EXCELMicrosoftsoftware, data analysis

参考文献

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