초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

요약

미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)을 생산할 수 있는 여러 종속 플 라빈 효소 포함. 선생님을 모니터링 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 릴리스 원치 않는 측 반응 때문에 도전 이다. 우리 정화 flavoenzymes 고 미 판 fluorometry를 사용 하 여 선생님 자료에 대 한 기본 속도의 직접 평가 대 한 쉽고, 싼 방법 제시.

초록

그것은 알려졌다 미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)의 최대 12 효소 소스 포함 될 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분 플 라빈 종속 된 호흡 단지 등 초과 (₂O^●-), 과산화 수소 (H₂O₂)의 혼합물을 생성 하는 dehydrogenases. 고립 된 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트의 선생님 생산 잠재력의 정확한 정량화의 항 산화 방어 시스템 측면 또한 O₂●/H₂O₂를 형성 하는 존재 인 전하실 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 생체를 중단 시킬 수 있는 일반적인 반응 억제제의 사용 또한 생산의 다른 사이트에서 선생님 자료를 변경 하 여 측정을 손상 수 있습니다. 여기, 우리는 정화 플 라빈에 연결 된 dehydrogenases에 의해 H₂O₂ 릴리스 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH) 생산의 동시 측정을 위한 쉬운 방법 제시. 여기 우리의 목적을 위해 순화 된 pyruvate 효소 복합물 (PDHC)와 α ketoglutarate 효소 복잡 한 (KGDHC) 돼지 심장 근원의 예제로 사용 했습니다. 이 메서드는 네이티브 H₂O₂ 릴리스 요금 생산의 개별 사이트의 정확한 측정을 위해 선생님과 항 산화 시스템의 다른 잠재적인 소스를 제거 하 여 수 있습니다. 또한,이 메서드는 H₂O₂ 출시와 효소 활동, 효과의 심사 및 선생님 생산 억제제의 선택 간의 관계의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다. 전반적으로,이 접근의 네이티브 선생님 릴리스 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 근육 섬유 보다 정교한 실험을 실시 하기 전에 개별 효소의 심층 평가 대 한 수 있습니다.

서문

영양소 대사의 궁극적인 목표는 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 만드는 것입니다. 포유류 세포에서이 미토 콘 드리 아, 탄소에 ATP에 저장 된 에너지를 변환 하는 더블 membraned 세포에서에서 발생 합니다. ATP의 생산에는 탄소는 두 명의 전자 사업자, NADH, 플 라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FADH₂)¹을 형성 하는 미토 콘 드리 아에 의해 combusted 때 시작 됩니다. NADH와 FADH₂ 는 다음 산화 다 소 단위 호흡기 복합물에 의해 I 및 II, 각각, 그리고 자유 전자는 터미널 전자 수락자 분자 산소 (O₂) 복잡 한 4¹에 ferried. 열역학으로 호의 베푸는 "내리막" 전송 전자의 O₂ 는 체인의 끝에는 양성자의 수출에는 intermembrane에 결합 I, III, 및 IV 단지에 의해 공간. 이 양성자 (양성자 동기 힘), 임시 형태의 ATP²를 만들기 위해 복잡 한 V에 의해 도청 깁스 자유 에너지의 막 횡단 전기 그라디언트를 만듭니다. 미토 콘 드리 아에서 전자 이동 반응은 ATP 생산을 완벽 하 게 결합 하지. Krebs 사이클 및 호흡기 체인에 여러 지점에서 전자 중간 형태로 선생님³O₂ 작용할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아에서 생성 된 가장 생물학적으로 관련 선생님은 O₂^●- H₂O₂. O₂^●- 종종 간주 됩니다 미토 콘 드리 아에 의해 형성 된 근 선생님, 비록 그것은 생산의 관련 된 자유 O₂^●- 및 H₂O₂의 혼합물 형성 분명 지금 보 플 라빈의 급진적인 화학 그룹^4,5. 높은 수준에서 선생님 위험할 수 있습니다, 손상 산화 조⁶의 결과로 세포 기능에 필요한 생물 학적 성분. 그러나, 낮은 금액에서 미토 콘 드리 아 선생님 중요 한 신호 전달 기능을 성취 한다. 예를 들어, 미토 콘 드리 아에서 H₂O₂ 릴리스 T-세포 활성화, 스트레스 신호 (예를들면, Nrf2 신호 통로의 유도), 세포 증식 및 분화, 유도 제어에 연루 되어 있다 인슐린 신호 릴리스, 그리고 동작⁷먹이. 상당한 진행 선생님의 신호 전달 기능을 이해 했다. 그러나, 중요 한 질문은 여전히 남아 있다 관계는 미토 콘 드리 아 효소 역할을 가장 중요 한 소스 및 생산 제어 하는 방법은.

선생님 자료 생산의 사이트에 의해 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다: 1)는 전자 기증의 농도 사이트, 2) 전자 기부 사이트, 3)에 대 한 액세스 산소, 4) 고 농도의 산화 상태 그리고 산화 기판^3, 의 종류 ^{8 , 9}. 미토 콘 드리 아에서 다른 같은 NADH 및 막 잠재적인 힘의 농도 또한 선생님 생산^8,10영향 요인. 예를 들어 O₂^●-/ H₂O₂ 생산 순화 PDHC 또는 KGDHC의 속도 증가 증가 NADH 가용성^5,11. 이 시나리오에서 전자는 흐르는 거꾸로 NADH에서 PDHC 또는 KGDHC, O₂^●-/ H₂O₂ 생산¹²에 대 한 사이트의 E₃ 소 단위에 유행 센터. 마찬가지로, 나드⁺ 의 KGDHC¹²에서 선생님 방출 감소 반대의 효과 있다. 따라서, 제어 항목 또는 선생님의 사이트에서 전자의 출구는 얼마나 많은 O₂^●-/ H₂O₂ 를 형성 변경할 수 있습니다. 예를 들어, PDHC 또는 KGDHC CPI-613, 리 포 산, 결과 거의 90%에 감소 O₂^●-/ H₂O₂ 생산¹³아날로그와 E₂ 소 단위를 차단 합니다. 와 화학 S glutathionylation 촉매, diamide disulfiram, O₂^●-/H₂O₂ 에 의해 생산 PDHC 또는 KGDHC E에 glutathione의 활용을 통해 거의 폐지는 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. ₂ 소 단위¹⁴. PDHC 및 KGDHC의 E₂ 소 단위를 통해 전자의 흐름 차단에 대 한 트레이드 오프는 (예를 들어, 복잡 한 III) 전자 수송 사슬에 의해 선생님 형성 감소는 NADH 생산 감소 이다. 이 또한 전자 수송 사슬에 의해 ATP 출력을 줄일 수 있습니다. 전반적으로, 선생님 생산의 사이트에 전자 항목을 차단 하는 것은 O₂^●-/ H₂O₂ 생산을 제어 하는 매우 효과적인 수단 수 있습니다.

미토 콘 드리 아에는 최대 12 잠재적인 O₂^●-/ H₂O₂ 소스⁶포함할 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분은 포함 하는 플 라빈 효소 O₂^●- 및 H₂O₂의 혼합물을 생성 하는. 다른 기판 및 억제제 조합을의 사용의 호흡기 단지 및 미토 콘 드리 아 dehydrogenases 역할 고용량 O₂^●-/ H₂O₂ 에 사이트를 형성 하는 식별에 대 한 허용 다른 조직³. PDHC 및 KGDHC 높은 용량 O₂^●-/ H₂O₂ 근육과 간 미토 콘 드리 아^13,15발광 사이트 역할을 보여왔다. 그러나, 몇 가지 문제가 남아 O₂^●-/ H₂O₂ 다른 기판 및 억제제 조합에 있는 미토 콘 드리 아에 영향 개별 사이트의 잠재적인 형성의 시험에 관한 효소의 활동입니다. 이것은 원치 않는 쪽 반응 (예를 들어, O₂^●-/ H₂O₂ 의 효소 이외의 사이트의 형성)의 존재로 인해 오염 생 영양분 (예를 들어,지방산 산) 또는 세포 (예:, peroxisomes 또한 O₂●/H₂O₂를 형성), 그리고 선택도, 부족 억제제의 사용 및/또는 완전히 선생님 생산을 억제 하지 않는 화합물의 사용. 특정 억제제 또한 미토 콘 드리 아 생체 및 전자 흐름의 방향을 변경할 수 있습니다 그리고이 선생님 자료 생산의 다른 사이트에서 변경 하 고 결과 혼동 한다. 절대 릴리스에 대 한 O₂●/H₂O₂ 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 요금은 또한 O₂^●- 및 H₂O₂ 의 높은 농도 때문에 계량 하기 어려운 행렬 및 intermembrane 공간에서 효소를 제거합니다. 따라서, O₂^●-/ H₂O₂ 릴리스 측정을 방해할 수 있는 모든 경쟁 반응의 제거 때 유용할 수 있습니다 식별 하는 고용량 O₂^●-/H₂O₂ 사이트를 형성.

여기, 우리는 정화 플 라빈 종속 dehydrogenases에 의해 O₂^●-/ H₂O₂ 생산과 NADH 형성의 동시 시험을 허용 하는 간단한 방법 제시. 정제 효소를 사용 하 여 원치 않는 선생님 측 반응 형성 및 효소 저하 선생님 제거할 수 있습니다 네이티브 O₂^●-/ H₂O₂ 생산 속도의 개별 flavoenzymes에 대 한 보다 정확한 측정을 위한 수 있도록. 이 메서드는 O₂^●-/ H₂O₂ O₂^●-/H₂O 화면 잠재적인 사이트별 억제제 또는 다른 정화 dehydrogenases의 능력을 형성을 직접 비교를 사용할 수 있습니다. ₂ 출시입니다. 마지막으로, O₂●/H₂O₂ 와 NADH 생산을 동시에 측정의 효소 활동, 선생님 자료 용량 관계의 실시간 평가 대 한 수 있습니다.

프로토콜

1. 화학 물질 고 정화 효소

1. 다음과 같은 재료를 조달: PDHC 및 KGDHC 돼지 심장 근원 (또는 다른 정화 미토 콘 드 리아 flavoenzyme); H₂O₂ (30% 솔루션), pyruvate, α ketoglutarate 나드⁺, NADH, CoASH, 티 아민 파이 인산 (TPP), 마 니 톨, HEPES, 자당, EGTA, 3-메 틸-2-옥 valeric 산 (KMV), superoxide dismutase (잔디), 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP), 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine 시 약 (AUR), 그리고 CPI-613.

2. 분석 결과 및 시 약 준비 계획

1. 96 잘 접시에 표 1 에 따라 분석 결과를 설정 합니다.
   참고: 각 반응에 대 한 전체 볼륨은 200 µ L. 주식 농도의 시 약 20 µ L 추가 되도록 조정 하는 각 음에. 그러면 공동 인자와 잘 분석 결과 시작 하기 전에 각 반응에 기판의 급속 한 추가.
2. 220 m m 마 니 톨, 70mm 자당, 1mm EGTA, 및 20 mM HEPES (HCl로 pH 7.4)를 포함 하는 반응 버퍼를 준비 합니다.
   참고:이 다른 정제 효소의 물리적 특성에 따라 변경할 수 있습니다.
3. 효소 활동 분석 실험^14,,1617 를 사용 하 여 오염 또는 immunoblot에 의해 순화 KGDHC 또는 PDHC를 검사 또는 Coomassie 얼룩⁵.
4. 표 1에서 작업 솔루션 농도 의하여 반응 버퍼에 모든 시 약을 준비 합니다.
5. 모든 시 약 1 mL-20 ° c.에 aliquots로 저장 자동 산화 및 반복된 동결-해 동 자발적인 저하를 방지 하기 위해 100 µ L aliquots에서 pyruvate 및 α ketoglutarate-80 ° C에서 저장 합니다.
6. DMSO의 1 mL에 마스터 재고 AUR 시 약을 준비 하 고 반응 버퍼에서 100 µ M을 희석. 스토어 빛 으로부터 보호입니다.
   참고: 여기, 100 µ M 작업 솔루션은 2 ~ 3 주마다 신선한 고 빛 으로부터 보호.

3. 분석 결과 서식 파일 설정

1. 듀얼 측정 기능으로 단색 microplate 리더에 분석 결과 절차를 설정 합니다.
2. "프로토콜"을 선택 하 여 읽기 프로시저를 정의 합니다. 그런 다음 "프로시저"를 클릭 합니다.
3. 25 ° c (그림 1A) "온도"를 설정 합니다.
4. (그림 1A) 읽기 조건을 설정할 "운동 시작"을 클릭 합니다. 시간 및 읽기 간격/실험의 수를 설정 합니다.
5. 클릭 "읽기" (그림 1B).
   참고: 샘플 최고의 위치에서 읽는 50의 이득. 시간: 5 분, 간격 30-s 읽기. 채널 1: Resorufin 형광-여기/방출 = 565 nm:600 nm의 파장 폭 13.5 nm. 채널 2: NADH autofluorescence-여기/방출 376 nm:450 nm, 20의 파장 폭 = nm.
6. "읽기", 웰 스 모니터 (예를 들어, a 1-a 4와 B1 B4)을 선택 합니다.
7. "키네틱 끝"을 선택 합니다.

4. 표준 곡선

1. 시 약을 해 동 하 고 필요할 때까지 얼음에 저장 합니다.
2. NADH 표준 곡선 (그림 2A)
   1. 반응 버퍼에 0.5-10 m m의 농도 범위에서 NADH에 대 한 작업 솔루션을 준비 합니다.
   2. 180 µ L 반응 버퍼를 포함 하는 웰 스 솔루션 집중 작업 각 NADH에서 20 µ L aliquots를 추가 합니다. 각 NADH의 최종 농도 잘는 0.05-1 m m.
   3. "읽기"를 클릭 하 고 설정 여기/방출 376 nm:450 nm, 20의 파장 폭 = nm.
      참고:이 읽기 전용 끝점-운동 매개 변수는 필요 하지 않습니다.
3. AUR 표준 곡선 (그림 2B)
   1. 반응 버퍼; 과산화 수소의 작업 주식 준비 사진 농도 범위 200-4000 nM에서.
   2. 각 잘에 반응 버퍼의 120 µ L를 추가 합니다.
   3. HRP의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 30 U/mL, 우물에 최종 농도 = 3 U/mL =) 20, 잔디의 µ L (재고 농도 일 250 U/mL, 우물에 최종 농도 = 25 U/mL =), 그리고 AUR의 20 µ L (재고 농도 작업 = 100 µ M 잘에서 최종 농도 = 10 µ M) 각 잘 포함 반응 버퍼를.
   4. 잘 포함 하는 버퍼 및 분석 실험 시 약 각을 재고 솔루션 작업 각 H₂O₂ 의 20 µ L를 추가 합니다. 최종 반응 볼륨 200 µ L 이며 각 우물에서 H₂O₂ 의 최종 농도 20-400 nM 이다.
   5. 25 ° c.에서 플레이트 리더에서 1 분에 대 한 번호판을 품 어
   6. "읽기"를 클릭 하 고 설정 여기/방출 = 565 nm/600 nm의 파장 폭 13.5 nm. 이 읽기 전용 끝점-운동 매개 변수는 필요 하지 않습니다.

5. O₂ ●/H₂ O₂ 릴리스 및 KGDHC 및 PDHC에 의해 NADH 생산 측정

1. 다른 시 약의 추가의 순서에 대 한 표 1 를 참조 하 여 각 볼륨과 각 작업 솔루션의 농도 추가 잘.
2. 각 잘에 반응 버퍼의 40 µ L를 추가 합니다. 분석 실험 KMV 또는 CPI-613를 사용 하 여, 각 음을 버퍼의 20 µ L를 추가 합니다.
3. PDHC 또는 KGDHC의 20 µ L를 추가 (1 U/mL, 잘 당 최종 농도의 작업 사진 = 0.1 U/mL)을 각 영역.
4. 2 분 동안 25 ° C에서 PDHC 및 KGDHC를 품 어.
5. KMV의 20 µ L을 추가 (작업 사진 = 100 mM, 최종 농도 = 10 m m) 또는 CPI-613의 20 µ L (재고 농도 작업 = 1.5 m m, 최종 농도 = 150 µ M) (표 2).
   참고:이 단계는 억제제는 분석에 사용 하지 않는 경우 제외할 수 있습니다.
6. 25 ° c.에 1 분 동안 품 어
   참고:이 단계는 억제제는 분석에 사용 하지 않는 경우 제외할 수 있습니다.
7. HRP의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 30 단위/mL, 우물에 최종 농도 = = 3 단위/mL) 및 잔디의 20 µ L (재고 농도 일 250 단위/mL, 우물에 최종 농도 = 25 단위/mL =) 각 잘 하.
8. 코엔자임 A의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 = 1mm, 최종 농도 = 0.1 m m), 20 TPP의 µ L (재고 농도 작업 = 3 mM, 최종 농도 = 0.3 m m), 고 나드⁺ 의 20 µ L (재고 농도 작업 = 10 m m, 최종 농도 = 1 m m) 각 w 내 말이 맞지.
9. 보호 은박지 덮 음에서 AUR 시 약을 제거 하 고 추가 20 µ L 각 잘.
10. Pyruvate의 20 µ L 추가 (재고 농도 1-100 m m, 분석 실험에 대 한 최종 농도에서 배열 작업 = 0.1-10 m m) PDHC 및 α ketoglutarate 웰 스 (재고 농도 1-100 m m, 분석 실험에 대 한 최종 농도에서 배열 작업 = 0.1-10 m m)를 KGDHC를 포함 하는 우물.
11. 클릭 "읽기" 운동 측정을 시작 합니다.

6. 데이터 분석

1. 키보드에서 'CTRL' 버튼 누른 1 (그림 3A) 채널에 해당 하는 모든 운동 측정을 포함 한 그래프를 생성 하는 우물을 클릭 합니다.
2. 상대 형광 단위 (RFU) (그림 3B) 다른 시간 지점에서 측정에 대 한 원시 값에 대해 오른쪽 상단에 있는 보기 아이콘에 "데이터"를 클릭 합니다.
3. 분석 (표 3)에 대 한 값을 내보냅니다.
4. "그래프" 드롭 다운 메뉴 오른쪽 상단에 (그림 3B) 형광 채널 2와 관련 된 RFU 값에 액세스 하려면 클릭 합니다.
5. 채널 2 단계 6.1 6.3 반복 합니다.

결과

그림 3A 순화 KGDHC에 의해 H₂O₂ 와 NADH 생산의 동시 측정 하는 동안 수집 된 RFU에 대 한 대표적인 추적을 제공 합니다. 각 시간 간격에 대 한 원시 RFU 데이터는 그림 3B에서 묘사 된다. 원시 RFU 데이터 분석에 대 한 다음 내보내집니다. 그림 2에 제시 하는 표준 곡선에서 추정 하 여 NADH와 H₂

토론

이 프로토콜은 이후 유리, 1) 그것은 어떤 경쟁 반응을 방해할 수 있는 그렇지 않으면 H₂O₂ 감지 (예, 항 산화 시스템 또는 기타 소스 선생님의), 2를 제거)의 기본 속도의 직접 평가 제공 선생님 분리를 포함 하는 플 라빈 미토 콘 드리 아 효소, 3) 원시의 비교를 허용 한다 선생님 릴리스 2의 속도 또는 더 정화 플 라빈 기반 dehydrogenases, 4) 선생님과 효소 활동, 및 5의 속도의 직접?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pyruvate dehydrogenase complex	SIGMA	P7032-10UN	purified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex	SIGMA	K1502-20UN	purified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solution	SIGMA	HX0640-5	reagent, standard curves
NAD+	SIGMA	N0632-1G	reagent, activity/ROS release assay
NADH	SIGMA	N4505-100MG	reagent, standard curves
pyruvate	SIGMA	P2256-5G	reagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarate	SIGMA	75892-25G	reagent, activity/ROS release assay
CoASH	SIGMA	C3019-25MG	reagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphate	SIGMA	C8754-1G	reagent, activity/ROS release assay
mannitol	SIGMA	M4125-100G	buffer component
Hepes	SIGMA	H3375-25G	buffer component
sucrose	SIGMA	S7903-250G	buffer component
EGTA	SIGMA	E3889-10G	buffer component
KMV	SIGMA	198978-5G	reagent, ROS release inhibitor
CPI-613	Santa Cruz	sc-482709	reagent, ROS release inhibitor
SOD	SIGMA	S9697-15KU	reagent, ROS release detection
horseradish peroxidase	SIGMA	P8375-1KU	reagent, ROS release detection
Amplex Ultra Red	Thermofisher	A36006	reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate reader	BioTek Instruments		microplate reader for assays
Gen5 software	BioTek Instruments		software, used for collection of raw RFU
Graphpad Prism	Graphpad software		software, data analysis
Microsoft EXCEL	Microsoft		software, data analysis