Mesure simultanée de superoxyde/eau oxygénée et NADH Production de Flavin-contenant des déshydrogénases mitochondriales

Résumé

Les mitochondries contiennent plusieurs enzymes de flavin-dépendante qui peuvent produire des espèces réactives de l’oxygène (ROS). ROS de surveillance communiqué de sites individuels dans les mitochondries est difficile en raison de réactions secondaires indésirables. Nous présentons une méthode simple et peu coûteuse pour une évaluation directe des tarifs natives pour libération ROS en utilisant flavoenzymes purifiée et microplaque fluorométrie.

Résumé

Il a été signalé que les mitochondries peuvent contenir jusqu'à 12 sources enzymatiques des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Une majorité de ces sites sont complexes respiratoires flavin-dépendante et déshydrogénases qui produisent un mélange de superoxyde (O₂^{● -}) et de peroxyde d’hydrogène (H₂O₂). Une quantification précise du potentiel ROS-produisant des sites individuels dans les mitochondries isolées peut être difficile en raison de la présence de systèmes de défense antioxydants et les réactions secondaires qui forment aussi O₂^●-/ h₂O₂. Utilisation d’inhibiteurs non spécifiques qui peuvent perturber la bioénergétique mitochondriale peut aussi compromettre Mensurations en altérant la libération ROS provenant d’autres sites de production. Nous présentons ici une méthode simple pour la mesure simultanée de la libération de H₂O₂ et de la production de la nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) par purifiée déshydrogénases lié à flavin. Pour nos besoins ici, nous avons utilisé purifiée pyruvate déshydrogénase complexe (CPD) et α-cétoglutarate déshydrogénase complexe (KGDHC) d’origine porcine coeur comme exemples. Cette méthode permet une mesure précise native H₂O₂ taux de lixiviation par différents sites de production en éliminant les autres sources potentielles des systèmes ROS et antioxydant. En outre, cette méthode permet une comparaison directe de la relation entre la libération de H₂O₂ et de l’activité enzymatique et de la projection de l’efficacité et la sélectivité des inhibiteurs de la production de ROS. Dans l’ensemble, cette approche peut permettre l’évaluation approfondie des taux natifs de ROS libération d’enzymes individuelles avant d’effectuer des expériences plus sophistiqués avec des mitochondries isolées ou perméabilisée fibre musculaire.

Introduction

Le but ultime du métabolisme des éléments nutritifs est de faire de l’adénosine triphosphate (ATP). Dans les cellules de mammifères, cela se produit dans les mitochondries, organites membrane double qui convertissent l’énergie stockée en carbone en ATP. La production d’ATP commence lorsque le carbone est brûlé par les mitochondries formant deux transporteurs d’électrons, NADH et la flavine adénine dinucléotide (FADH₂)¹. NADH et FADH₂ sont ensuite oxydé par sous-unité multiples complexes respiratoires I et II, respectivement, et les électrons libérés sont transportés à la terminal d’électron accepteur moléculaire l’oxygène (O₂) au complexe IV¹. Le thermodynamiquement favorable « descente » transfert d’électrons à O₂ à la fin de la chaîne est couplé à l’exportation des protons dans l’intermembranaire espace par les complexes I, III et IV. Cela crée un gradient électrochimique transmembranaire de protons (force proton-motrice), une forme temporaire d’énergie libre de Gibbs qui est exploité par complexe V faire ATP². Réactions de transfert d’électrons dans les mitochondries ne sont pas parfaitement couplées à la production de l’ATP. À divers moments durant le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire, les électrons peuvent interagir prématurément avec O₂ pour former ROS³. Les ROS plus biologiquement pertinentes générées par les mitochondries sont O₂^{● -} et H₂O₂. O₂^{● -} est considéré souvent comme le ROS proximale formées par les mitochondries, il est maintenant évident que les sites de production de forment un mélange de O₂^{● -} et H₂O₂, qui est associé à la libre chimie radicalaire de flavin prothétique regroupe^4,5. Des niveaux élevés, ROS peuvent être dangereux, endommageant des constituants biologiques requis pour la fonction cellulaire résultant en détresse oxydante⁶. Toutefois, à de faibles quantités, ROS mitochondriales remplissent les fonctions vitales de signalisation. Par exemple, H₂O₂ libération des mitochondries a été impliquée en contrôlant l’activation des lymphocytes T, la contrainte de signalisation (par exemple, l’induction des voies de signalisation Nrf2), l’induction de la prolifération cellulaire et la différenciation, signalisation de l’insuline et libération et alimentation comportement⁷. Des progrès considérables accomplis dans la compréhension de la fonction de signalisation de ROS. Cependant, importantes questions demeurent au sujet desquels enzymes dans les mitochondries servent de sources les plus importantes et la façon dont la production est contrôlée.

Communiqué de ROS par un site de production dépend de plusieurs facteurs : 1) la concentration de l’électrodonneur site, 2) l’état d’oxydoréduction du site Don électron, 3) l’accès à l’oxygène et 4) la concentration et le type d’oxydation substrat^{3, 8 , 9}. dans les mitochondries, d’autres facteurs comme la concentration de NADH et membrane force potentielle aussi influer sur la production de ROS^8,10. Par exemple, le taux de O₂^●-/ h₂O₂ production de purifiée CPD ou KGDHC augmente avec l’augmentation NADH disponibilité^5,11. Dans ce scénario, les électrons sont refluer de NADH vers le centre de la FAD dans la sous-unité de₃ E du CPD ou KGDHC, le site d’O₂^●-/ h₂O₂ production¹². De même, la fourniture de NAD⁺ a l’effet inverse, en diminuant la libération ROS du KGDHC¹². Ainsi, contrôle entrée ou sortie des électrons provenant de sites de production de ROS peut altérer combien O₂^●-/ h₂O₂ est formé. Par exemple, blocage de la sous-unité de₂ E de la CPD ou KGDHC avec un acide lipoïque analogique, diminuent des résultats dans un presque 90 % O₂^●-/ h₂O₂ production¹³, CPI-613. Des résultats similaires peuvent être obtenus avec le chimique S-glutathionylation catalyseurs, diamide et disulfiram, qui abolir presque O₂●/h₂O₂ production de CPD ou KGDHC par l’intermédiaire de la conjugaison du glutathion au E ₂ sous-unités¹⁴. Le compromis pour bloquer le flux d’électrons par l’intermédiaire de la sous-unité de₂ E de la CPD et KGDHC y a une diminution dans la production de NADH qui diminue la formation de ROS par la chaîne de transport d’électrons (p. ex., complexe III). Cela peut également diminuer la production d’ATP par la chaîne de transport d’électrons. Dans l’ensemble, le fait de bloquer l’entrée des électrons à des sites de production de ROS peut être un moyen très efficace de contrôle de la O₂^●-/ h₂O₂ production.

Les mitochondries peuvent contenir jusqu'à 12 potentiels O₂^●-/ h₂O₂ sources⁶. La plupart de ces sites sont flavin-contenant des enzymes qui génèrent un mélange d’O₂^{● -} et H₂O₂. Utilisation de différents substrats et carboxypénicillines ont permis l’identification dont complexes respiratoires et déshydrogénases mitochondriales servent de haute capacité O₂^●-/ h₂O₂ formant des sites en ³de différents tissus. CPD et KGDHC ont démontré pour servir de grande capacité O₂^●-/ h₂O₂ sites émettant dans le muscle et les mitochondries du foie^13,15. Cependant, certaines difficultés subsistent en ce qui concerne l’examen de l’O₂^●-/ h₂O₂ formant des potentiels des sites individuels dans les mitochondries et l’impact ayant différents substrats et carboxypénicillines sur les activités des enzymes. Cela est dû à la présence de réactions secondaires indésirables (p. ex., formation de O₂^●-/ h₂O₂ par des sites autres que l’enzyme d’intérêt), contaminant nutriments endogènes (p. ex.,gras les acides) ou organites (p. ex., peroxysomes qui font également O₂^●-/ h₂O₂) et l’utilisation d’inhibiteurs que le manque de sélectivité, ou l’utilisation de composés qui n’inhibent pas complètement la production de ROS. Certains inhibiteurs peuvent également altérer la bioénergétique mitochondriale et la direction du flux d’électrons, et cela modifie ROS communiqué provenant d’autres sites de production et confond les résultats. Les taux absolus de O₂●/h₂O₂ libération de sites individuels dans les mitochondries sont également difficiles à quantifier en raison de la forte concentration d’O₂^{● -} et H₂O₂ éliminer les enzymes dans l’espace intermembranaire et de matrice. Par conséquent, élimination de toute réaction concurrente qui peuvent interférer avec l’O₂^●-/ h₂O₂ communiqué de mesures peut être utile lorsqu’on veut identifier haute capacité O₂^●-/ h₂O₂ formant des sites.

Nous présentons ici une méthode simple qui permet l’examen simultané de O₂^●-/ h₂O₂ production et de la formation de NADH par purifiée déshydrogénases flavin-dépendante. À l’aide d’enzymes purifiées, indésirables ROS formant des réactions secondaires et ROS enzymes dégradant peut être éliminé permettant une mesure plus précise des indigènes O₂^●-/ h₂O₂ taux de production pour chaque flavoenzymes. Cette méthode peut être utilisée pour comparer directement l’O₂^●-/ h₂O₂ formant la capacité des différents déshydrogénases purifiées ou aux inhibiteurs spécifiques au site potentiel écran pour O₂^●-/ h₂O version ₂ . Enfin, mesurant O₂^●-/ h₂O₂ et la production de NADH en même temps permet une évaluation en temps réel de la relation entre l’activité enzymatique et la capacité de sortie ROS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. produits chimiques et des Enzymes purifiées

1. Se procurer les matériaux suivants : CPD et KGDHC d’origine porcine de coeur (ou un autre flavoenzymes mitochondrial purifié) ; H₂O₂ (solution à 30 %), le pyruvate, α-cétoglutarate, NAD⁺, NADH, CoASH, pyrophosphate de thiamine (TPP), saccharose mannitol, HEPES, EGTA, 3-méthyl-2-oxo-valérique (KMV), superoxyde dismutase (SOD), la peroxydase de raifort (HRP), 10-acétyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine réactif (AUR) et CPI-613.

2. planification de l’analyse et préparation du réactif

1. Mettre en place l’analyse selon le tableau 1 dans une plaque à 96 puits.
   Remarque : Le volume total de chaque réaction est 200 µL. concentrations de Stock sont ajustées de façon à 20 µL de réactif est ajouté à chaque puits. Cela garantit l’ajout rapide de cofacteurs et substrats à chaque réaction bien avant de commencer l’essai.
2. Préparer le tampon de réaction contenant 220 mM de mannitol, sucrose de 70 mM, 1 mM EGTA et 20 mM HEPES (pH 7,4 avec HCl).
   Remarque : Cela pourrait changer en fonction des propriétés physiques des différentes enzymes purifiées.
3. Examiner les KGDHC ou les CPD purifiée de la contamination à l’aide d’enzyme dosages d’activité^14,16,17 ou par immunoblot ou tache de bleu de Coomassie⁵.
4. Préparer tous les réactifs dans la mémoire tampon de réaction selon la concentration de solution de travail dans le tableau 1.
5. Conserver tous les réactifs comme aliquotes de 1 mL à-20 ° C. Stocker le pyruvate et le α-cétoglutarate à-80 ° C dans des aliquotes de 100 µL à prévenir la dégradation spontanée due à l’auto-oxydation et de gel-dégel répété.
6. Préparation du réactif AUR maître stock dans 1 mL de DMSO et diluer à 100 µM de tampon de réaction. Boutique abri de la lumière.
   NOTE : Ici, la solution de travail 100 µM est fait frais par 2 ou 3 semaines et l’abri de la lumière.

3. mise en place du modèle d’essai

1. Configurer le mode opératoire sur un lecteur de microplaques monochrome avec des capacités de mesure double.
2. Définissez la procédure de lecture en sélectionnant « Protocole ». Puis cliquez sur « Procédure ».
3. « TEMPÉRATURE » de la valeur à 25 ° C (Figure 1 a).
4. Cliquez sur « Démarrer KINETIC » pour définir les conditions de lecture (Figure 1 a). Régler l’heure et le nombre d’intervalles/expériences de lecture.
5. Cliquez sur « lire » (Figure 1 b).
   Remarque : Les échantillons sont lues à partir en position supérieure avec un gain de 50. Durée : 5 min, lire à intervalles de 30 s. Canal 1 : Fluorescence résorufine - excitation/émission = 565 nm:600 nm, largeur de longueur d’onde de 13,5 nm. Canal 2 : NADH autofluorescence - excitation/émission = 376 nm:450 nm, largeur de longueur d’onde de 20 nm.
6. Sous « Lecture », sélectionnez puits au moniteur (p. ex., A1-A4 et B1-B4).
7. Sélectionnez « END cinétique ».

4. courbes de niveau

1. Décongeler les réactifs et les stocker sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
2. Courbe d’étalonnage (Figure 2 a) de la NADH
   1. Préparer les solutions de travail pour le NADH dans des concentrations allant de 0,5 à 10 mM de tampon de réaction.
   2. Ajouter 20 µL d’extraits de chaque NADH travailler la concentration de la solution aux puits contenant 180 µL de tampon de réaction. La concentration finale de NADH dans chacune est bien 0.05-1 mM.
   3. Cliquez sur « Lire » et définissez excitation/émission = 376 nm:450 nm, largeur de longueur d’onde de 20 nm.
      Remarque : Il s’agit d’un point de terminaison en lecture seule - les paramètres cinétiques ne sont pas nécessaires.
3. Courbe d’étalonnage AUR (Figure 2 b)
   1. Préparer les stocks de travail du peroxyde d’hydrogène dans le tampon de réaction ; concentrations de stock varient de 200-4 000 nM.
   2. Ajouter 120 µL de tampon de la réaction dans chaque puits.
   3. Ajouter 20 µL de HRP (concentration stock de travail = 30 U/mL, la concentration finale dans le puits = 3 U/mL), 20 µL de SOD (travail stock concentration = 250 U/mL, la concentration finale dans le puits = 25 U/mL) et 20 µL d’AUR (travail stock concentration = 100 µM la concentration finale dans le puits = 10 µM) pour chaque tampon bien contenant de la réaction.
   4. Ajouter 20 µL de chaque H₂O₂ solution stock à chaque cupule contenant le tampon et le dosage des réactifs de travail. Le volume réactionnel final est 200 µL et la concentration finale de H₂O₂ dans chaque puits est de 20 à 400 nM.
   5. Incuber les boîtes pendant 1 min dans le lecteur de plaque à 25 ° C.
   6. Cliquez sur « Lire » et définissez excitation/émission = 565 nm/600 nm, largeur de longueur d’onde de 13,5 nm. Notez qu’il s’agit d’un point de terminaison en lecture seule - paramètres cinétiques ne sont pas nécessaires.

5. mesure O^●- / h₂ O₂ version₂et la Production de NADH par KGDHC et CPD

1. Voir le tableau 1 de l’ordre d’ajout des différents réactifs, la concentration de chaque solution de travail et le volume ajouté à chaque puits.
2. Ajouter 40 µL de tampon de réaction dans chaque puits. Pour les tests à l’aide de KMV ou CPI-613, ajouter 20 µL de tampon dans chaque puits.
3. Ajouter 20 µL de CPD ou KGDHC (stock de travail de 1 U/mL, la concentration finale / puits = 0,1 U/mL) dans chaque puits.
4. Incuber les CPD et KGDHC à 25 ° C pendant 2 min.
5. Ajouter 20 µL de KMV (stock de travail = 100 mM, concentration finale = 10 mM) ou 20 µL du CPI-613 (travail de concentration stock = 1,5 mM, concentration finale = 150 µM) (tableau 2).
   Remarque : Cette étape peut être exclue si les inhibiteurs ne sont pas utilisés pour les essais.
6. Incuber pendant 1 min à 25 ° C.
   Remarque : Cette étape peut être exclue si les inhibiteurs ne sont pas utilisés pour les essais.
7. Ajouter 20 µL de HRP (concentration stock de travail = 30 unités/mL, la concentration finale dans le puits = 3 unités/mL) et 20 µL de SOD (travail de concentration stock = 250 unités/mL, la concentration finale dans le puits = 25 unités/mL) dans chaque puits.
8. Ajouter 20 µL du coenzyme A (concentration stock de travail = 1 mM, concentration finale = 0,1 mM), 20 µL de biens meubles corporels (concentration stock de travail = 3 mM, concentration finale = 0,3 mM) et 20 µL de NAD⁺ (travail concentration stock = 10 mM, concentration finale = 1 mM) à chaque w Ell.
9. Retirer le réactif AUR du revêtement de papier d’aluminium protectrice et ajouter 20 µL à chaque puits.
10. Ajouter 20 µL du pyruvate (stock concentration allant de 1 à 100 mM, concentration finale pour des dosages de travail = 0,1 à 10 mM) à puits contenant des CPD et le α-cétoglutarate (stock concentration allant de 1 à 100 mM, concentration finale pour des dosages de travail = 0,1 à 10 mM) à puits contenant des KGDHC.
11. Cliquez sur « Lecture » pour démarrer la mesure cinétique.

6. analyse de données

1. Maintenez enfoncée la touche « CTRL » du clavier et cliquez sur puits pour générer un graphique contenant toutes les mesures cinétiques correspondant à la chaîne 1 (Figure 3 a).
2. Cliquez sur « données » dans l’icône à afficher dans le coin supérieur droit pour les valeurs brutes pour les unités de la fluorescence relative (RFU) mesurées aux points différents temps (Figure 3 b).
3. Exporter les valeurs pour l’analyse (tableau 3).
4. Cliquez sur la « Graph » liste déroulante en haut à gauche (Figure 3 b) pour accéder aux valeurs de la RFU associées au canal de fluorescence 2.
5. Répétez les étapes 6.1 à 6.3 pour canal 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Figure 3 a prévoit une trace représentante la RFU recueillie pendant la mesure simultanée de la production de NADH et de H₂O₂ KGDHC purifiée. Les données brutes de RFU pour chaque intervalle de temps sont représentées dans la Figure 3 b. Les données brutes de la RFU sont ensuite exportées pour analyse. En extrapolant à partir des courbes standard présentés dans la Figure 2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ce protocole est avantageux depuis, 1) il élimine toute réactions concurrentes qui peuvent interférer avec la détection de₂ H₂O (p. ex., systèmes antioxydants ou autres sources de ROS), 2) fournit une évaluation directe de la vitesse native de ROS de sortie par une déshydrogénase mitochondriale flavine, 3) permet la comparaison de l’indigène ROS libérer les taux de deux ou plus purifiée axée sur la flavine déshydrogénases, 4) peut permettre une comparaison directe du taux d?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pyruvate dehydrogenase complex	SIGMA	P7032-10UN	purified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex	SIGMA	K1502-20UN	purified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solution	SIGMA	HX0640-5	reagent, standard curves
NAD+	SIGMA	N0632-1G	reagent, activity/ROS release assay
NADH	SIGMA	N4505-100MG	reagent, standard curves
pyruvate	SIGMA	P2256-5G	reagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarate	SIGMA	75892-25G	reagent, activity/ROS release assay
CoASH	SIGMA	C3019-25MG	reagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphate	SIGMA	C8754-1G	reagent, activity/ROS release assay
mannitol	SIGMA	M4125-100G	buffer component
Hepes	SIGMA	H3375-25G	buffer component
sucrose	SIGMA	S7903-250G	buffer component
EGTA	SIGMA	E3889-10G	buffer component
KMV	SIGMA	198978-5G	reagent, ROS release inhibitor
CPI-613	Santa Cruz	sc-482709	reagent, ROS release inhibitor
SOD	SIGMA	S9697-15KU	reagent, ROS release detection
horseradish peroxidase	SIGMA	P8375-1KU	reagent, ROS release detection
Amplex Ultra Red	Thermofisher	A36006	reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate reader	BioTek Instruments		microplate reader for assays
Gen5 software	BioTek Instruments		software, used for collection of raw RFU
Graphpad Prism	Graphpad software		software, data analysis
Microsoft EXCEL	Microsoft		software, data analysis