Misura simultanea di perossido di idrogeno/del superossido e produzione di NADH di Flavin-contenente deidrogenasi mitocondriale

Riepilogo

I mitocondri contengono parecchi enzimi flavina-dipendenti in grado di produrre le specie reattive dell'ossigeno (ROS). Monitoraggio ROS rilascio dai singoli siti nei mitocondri è difficile a causa di reazioni collaterali indesiderate. Presentiamo un metodo semplice e poco costoso per valutazione diretta delle tariffe native per rilascio ROS mediante flavoenzymes purificata e micropiastre fluorometria.

Abstract

È stato segnalato che i mitocondri possono contenere fino a 12 sorgenti enzimatiche di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Una maggioranza di questi siti sono dipendenti da flavina complessi respiratori e deidrogenasi che producono una miscela di superossido (O₂^{● -}) e perossido di idrogeno (H₂O₂). Quantificazione accurata del potenziale produzione di ROS di singoli siti in mitocondri isolati può essere difficile a causa della presenza di sistemi di difesa antiossidanti e reazioni secondarie che formano anche O₂^●-/ h₂O₂. Uso di inibitori non specifici che possono interferire con bioenergetica mitocondriale può anche compromettere misure alterando rilascio ROS da altri siti di produzione. Qui, presentiamo un metodo semplice per la misura simultanea di nicotinamide adenindinucleotide (NADH) produzione e rilascio di H₂O₂ da purificato legata flavina deidrogenasi. Per i nostri scopi qui, abbiamo usato complesso di purificato piruvato deidrogenasi (PDHC) e α-chetoglutarato deidrogenasi complessa (KGDHC) di origine porcina cuore come esempi. Questo metodo consente una misurazione accurata del nativo H₂O₂ tariffe rilascio di singoli siti di produzione eliminando altri potenziali fonti di sistemi ROS e antiossidante. Inoltre, questo metodo consente un confronto diretto del rapporto tra rilascio di H₂O₂ e l'attività enzimatica e la proiezione dell'efficacia e la selettività degli inibitori per la produzione di ROS. Nel complesso, questo approccio può consentire la valutazione approfondita dei nativi tassi di rilascio ROS per singoli enzimi prima conducendo esperimenti più sofisticati con mitocondri isolati o permeabilized della fibra di muscolo.

Introduzione

L'obiettivo finale del metabolismo dei nutrienti è di rendere l'adenosina trifosfato (ATP). In cellule di mammifero, ciò si verifica nei mitocondri, organelli a membrana doppia che convertono l'energia immagazzinata in carbonio in ATP. Quando il carbone viene bruciato dai mitocondri formando due trasportatori di elettroni, NADH e flavina adenina dinucleotide (FADH₂)¹inizia la produzione di ATP. NADH e FADH₂ sono quindi ossidato da complessi respiratori multi-unità secondaria I e II, rispettivamente, e gli elettroni liberati sono traghettati al terminale dell'elettrone accettore molecolare ossigeno (O₂) al complesso IV¹. Il thermodinamicamente favorevole "in discesa" trasferimento di elettroni a O₂ all'estremità della catena è accoppiato all'esportazione di protoni nel intermembrane spazio dai complessi I, III e IV. Questo crea un gradiente elettrochimico transmembrana di protoni (Forza Protonomotrice), una forma temporanea di energia libera di Gibbs che è sfruttato da V complessa fare ATP². Reazioni di trasferimento di elettroni nei mitocondri non sono perfettamente accoppiate alla produzione di ATP. In vari punti del ciclo di Krebs e catena respiratoria, elettroni prematuramente possono interagire con O₂ al modulo ROS³. Il più biologicamente rilevante ROS generato dai mitocondri è O₂^{● -} e H₂O₂. Anche se O₂^{● -} è spesso considerato il ROS prossimale formato dai mitocondri, è ora evidente che siti di produzione formano una miscela di O₂^{● -} e H₂O₂, che è associato con il libero radicale chimica di flavin protesica dei gruppi^4,5. Ad alti livelli, il ROS può essere pericoloso, danneggiando costituenti biologici necessari per la funzione delle cellule con conseguente stress ossidativo⁶. Tuttavia, a basse quantità, ROS mitocondriale soddisfare funzioni vitali di segnalazione. Per esempio, rilascio di H₂O₂ dai mitocondri è stata implicata nel controllo di attivazione delle cellule T, sforzo segnalazione (ad es., induzione delle vie di segnalazione Nrf2), l'induzione della proliferazione e differenziazione, segnalazione dell'insulina e rilascio e alimentazione comportamento⁷. Notevoli progressi nella comprensione della funzione di segnalazione di ROS. Tuttavia, importanti domande rimangono ancora rispetto alla quale gli enzimi nei mitocondri servono come le fonti più importanti e come produzione è controllata.

Rilascio ROS da un sito di produzione dipende da diversi fattori: 1) la concentrazione di donare l'elettrone del sito, 2) lo stato redox del sito donare elettroni, 3) accesso ad ossigeno e 4) la concentrazione e il tipo di substrato di ossidazione^{3, 8 , 9}. nei mitocondri, altri fattori come la concentrazione di forza potenziale di membrana e NADH inoltre influenzare ROS produzione^8,10. Ad esempio, il tasso di O₂^●-/ h₂O₂ produzione di purificato PDHC o KGDHC aumenta con crescente NADH disponibilità^5,11. In questo scenario, gli elettroni scorrono all'indietro dal NADH al centro FAD nella subunità E₃ di PDHC o KGDHC, il sito per O₂^●-/ h₂O₂ produzione¹². Allo stesso modo, la fornitura di NAD⁺ ha l'effetto opposto, diminuire il rilascio ROS da KGDHC¹². Così, controllo entrata o uscita di elettroni dai siti di produzione di ROS può alterare quanto O₂^●-/ h₂O₂ è formata. Per esempio, bloccando la subunità di₂ E di PDHC o KGDHC con CPI-613, un analogico, risulta in un quasi il 90% diminuzione O₂^●-/ h₂O₂ produzione¹³l'acido lipoico. Risultati simili possono essere ottenuti con la chimica S-glutationilazione catalizzatori, diammide e disulfiram, che quasi abolire O₂^●-/ h₂O₂ produzione di PDHC o KGDHC tramite la coniugazione del glutatione e ₂ subunità¹⁴. Il trade-off per bloccare il flusso di elettroni attraverso la subunità di₂ E di PDHC e KGDHC è una diminuzione nella produzione di NADH che diminuisce la formazione di ROS dalla catena di trasporto dell'elettrone (per esempio, complesso III). Questo può anche diminuire ATP uscita dalla catena di trasporto degli elettroni. Nel complesso, bloccando l'entrata di elettroni ai siti di produzione di ROS può essere un mezzo molto efficace di controllare O₂^●-/ h₂O₂ produzione.

I mitocondri possono contenere fino a 12 potenziali O₂^●-/ h₂O₂ fonti⁶. Flavin-contenente la maggior parte di questi siti sono enzimi che generano una miscela di O₂^{● -} e H₂O₂. Uso di qualsiasi tipologia di substrato e combinazioni di inibitore hanno permesso l'identificazione di cui complessi respiratori e deidrogenasi mitocondriale servono come ad alta capacità O₂^●-/ h₂O₂ formando siti in diversi tessuti³. PDHC e KGDHC sono stati indicati per servire come ad alta capacità O₂^●-/ h₂O₂ siti che emettono in muscolo e mitocondri del fegato^13,15. Restano tuttavia alcune difficoltà per quanto riguarda l'esame dell'O₂^●-/ h₂O₂ di singoli siti nei mitocondri e l'impatto che qualsiasi tipologia di substrato e combinazioni di inibitore hanno il potenziale di formazione l'attività degli enzimi. Questo è dovuto alla presenza di reazioni collaterali indesiderate (ad es., la formazione di O₂^●-/ h₂O₂ da siti diversi dall'enzima di interesse), contaminando endogene nutrienti (ad es.,grassi acidi) o organelli (ad es., peroxisomes che formano anche O₂^●-/ h₂O₂) e l'uso di inibitori che la mancanza di selettività e all'impiego di composti che completamente non inibiscono la produzione di ROS. Alcuni inibitori possono anche alterare la bioenergetica mitocondriale e la direzione di flusso dell'elettrone, e questo altera il rilascio ROS da altri siti di produzione e confonde i risultati. Tariffe di assoluta per O₂●/h₂O₂ rilascio dai singoli siti in mitocondri sono anche difficili da quantificare dovuta all'alta concentrazione di O₂^{● -} e H₂O₂ eliminando gli enzimi nello spazio matrice e intermembrane. Pertanto, eliminazione di eventuali reazioni concorrenti che possono interferire con O₂^●-/ h₂O₂ rilascio misure può essere utile quando si identificano ad alta capacità O₂^●-/ h₂O₂ formando siti.

Qui, presentiamo un metodo semplice che permette l'esame simultaneo di O₂^●-/ h₂O₂ produzione e formazione di NADH di purificato dipendenti da flavina deidrogenasi. Utilizzando enzimi purificati, ROS formando reazioni collaterali indesiderate e ROS enzimi degradativi può essere eliminato consentendo una misura più accurata della nativa O₂^●-/ h₂O₂ tassi di produzione per singoli flavoenzymes. Questo metodo può essere utilizzato per confrontare direttamente l'O₂^●-/ h₂O₂ formando la capacità di diversi deidrogenasi purificati o per potenziali inibitori site-specific schermo per O₂^●-/ h₂O versione ₂ . Infine, misura O₂^●-/ h₂O₂ e la produzione di NADH contemporaneamente può consentire una valutazione in tempo reale della relazione tra l'attività dell'enzima e la capacità di rilascio ROS.

Protocollo

1. i prodotti chimici ed enzimi purificati

1. Procurarsi i seguenti materiali: PDHC e KGDHC di origine porcina cuore (o un altro flavoenzyme mitocondriale purificato); H₂O₂ (soluzione al 30%), piruvato, α-chetoglutarato, NAD⁺, NADH, CoASH, pirofosfato della tiamina (TPP), saccarosio mannitolo, HEPES, EGTA, acido valerianico 3-metil-2-oxo (KMV), superossido dismutasi (SOD), perossidasi di rafano (HRP), 10-acetile-3,7-dihydroxyphenoxazine reagente (AUR) e CPI-613.

2. pianificazione delle analisi e preparazione dei reagenti

1. Impostare il dosaggio secondo la tabella 1 in una piastra a 96 pozzetti.
   Nota: Il volume totale per ogni reazione è 200 µ l. concentrazioni di Stock sono in modo tale che 20 µ l di reagente viene aggiunto ad ogni pozzetto. Questo assicura la rapida aggiunta di cofattori e substrati per ciascuna reazione ben prima di iniziare il dosaggio.
2. Preparare il tampone di reazione contenente mannitolo 220mm, saccarosio 70 mM, 1 mM EGTA e 20 mM HEPES (pH 7.4 con HCl).
   Nota: Questo potrebbe cambiare a seconda delle proprietà fisiche di diversi enzimi purificati.
3. Esaminare il purificato KGDHC o PDHC per contaminazione utilizzando enzima attività saggi^14,16,17 , o da immunoblot o Coomassie macchia⁵.
4. Preparare tutti i reattivi nel buffer di reazione secondo le concentrazioni della soluzione di lavoro nella tabella 1.
5. Conservare tutti i reagenti come aliquote di 1 mL a-20 ° C. Archivio piruvato e α-chetoglutarato a-80 ° C in aliquote di 100-µ l per evitare la degradazione spontanea a causa di auto-ossidazione e ripetuti di congelamento-scongelamento.
6. Preparare il reagente AUR master stock in 1 mL di DMSO e diluire a 100 µM in tampone di reazione. Conservare al riparo dalla luce.
   Nota: Qui, la soluzione di lavoro 100 µM è fatta fresca ogni 2-3 settimane e al riparo dalla luce.

3. impostazione del modello di analisi

1. Impostare la routine di analisi su un lettore di micropiastre monocromatico con capacità doppia di misurazione.
2. Definire la procedura di lettura selezionando "Protocollo". Fare clic su "PROCEDURE".
3. Impostare "Temperatura" a 25 ° C (Figura 1A).
4. Fare clic su "START KINETIC" per impostare condizioni di lettura (Figura 1A). Impostare l'ora e il numero di intervalli/esperimenti di lettura.
5. Fare clic su "Leggi" (Figura 1B).
   Nota: I campioni vengono lette dalla posizione superiore con un guadagno di 50. Tempo: 5 min, leggere a intervalli di 30 s. Canale 1: Fluorescenza Resorufina - eccitazione/emissione = 565 nm nm:600, larghezza di lunghezza d'onda di 13,5 nm. Canale 2: NADH autofluorescence - eccitazione/emissione = 376 nm:450 nm, larghezza di lunghezza d'onda di 20 nm.
6. Selezionare "READ", pozzi per monitor (ad esempio, A1-A4 e B1-B4).
7. Selezionare "Fine cinetica".

4. standard curve

1. Scongelare i reagenti e conservare il ghiaccio fino a quando necessario.
2. Curva standard di NADH (Figura 2A)
   1. Preparare le soluzioni di lavoro per NADH nella gamma di concentrazione di 0,5-10 mM di tampone di reazione.
   2. Aggiungere 20 aliquote µ l da ogni NADH lavorando la concentrazione della soluzione di pozzetti contenenti 180 µ l di tampone di reazione. La concentrazione finale del NADH in ogni bene è 0.05-1 mM.
   3. Fare clic su "Leggi" e impostare eccitazione/emissione = 376 nm:450 nm, larghezza di lunghezza d'onda di 20 nm.
      Nota: Si tratta di un endpoint di sola lettura - i parametri cinetici non sono necessari.
3. Curva standard di AUR (Figura 2B)
   1. Preparare le scorte di lavoro di perossido di idrogeno in tampone di reazione; gamma di concentrazioni stock da 200-4.000 nM.
   2. Aggiungere 120 µ l di tampone di reazione ad ogni pozzetto.
   3. Aggiungere 20 µ l di HRP (concentrazione stock di lavoro = 30 U/mL, concentrazione finale nel pozzo = 3 U/mL), 20 µ l di SOD (concentrazione stock di lavoro = 250 U/mL, concentrazione finale nel pozzo = 25 U/mL) e 20 µ l di AUR (stock concentrazione di lavoro = 100 µM concentrazione finale nel pozzo = 10 µM) per ciascun bene contenente tampone di reazione.
   4. Aggiungere 20 µ l di ogni H₂O₂ soluzione di riserva a ciascuno contenente ben buffer e dosaggio reagenti di lavoro. Il volume di reazione finale è di 200 µ l e la concentrazione finale di H₂O₂ in ciascun pozzetto è 20-400 nM.
   5. Incubare le piastre per 1 min nel lettore della piastra a 25 ° C.
   6. Fare clic su "Leggi" e impostare eccitazione/emissione = 565 nm/600 nm, larghezza di lunghezza d'onda di 13,5 nm. Si noti che si tratta di un endpoint di sola lettura - i parametri cinetici non sono necessari.

5. misurazione O₂^●- / h₂ O₂ Release e produzione di NADH di KGDHC e PDHC

1. Vedere la tabella 1 per l'ordine di aggiunta dei reagenti differenti, la concentrazione di ogni soluzione di lavoro e il volume aggiunto a ciascun pozzetto.
2. Aggiungere 40 µ l di tampone di reazione ad ogni pozzetto. Per le analisi usando KMV o CPI-613, aggiungere 20 µ l di tampone in ciascun pozzetto.
3. Aggiungere 20 µ l di PDHC o KGDHC (lavoro stock di 1 U/mL, concentrazione finale per pozzetto = 0,1 U/mL) ad ogni pozzetto.
4. Incubare PDHC e KGDHC a 25 ° C per 2 min.
5. Aggiungere 20 µ l di KMV (stock di lavoro = 100 mM, concentrazione finale = 10 mM) o 20 µ l di CPI-613 (concentrazione stock di lavoro = 1,5 mM, concentrazione finale = 150 µM) (tabella 2).
   Nota: Questo passaggio può essere escluso se inibitori non vengono utilizzati per le analisi.
6. Incubare per 1 min a 25 ° C.
   Nota: Questo passaggio può essere escluso se inibitori non vengono utilizzati per le analisi.
7. Aggiungere 20 µ l di HRP (concentrazione stock di lavoro = 30 unità/mL, concentrazione finale nel pozzo = 3 unità/mL) e 20 µ l di SOD (concentrazione stock di lavoro = 250 unità/mL, concentrazione finale nel pozzo = 25 unità/mL) ad ogni pozzetto.
8. Aggiungere 20 µ l del coenzima A (concentrazione stock di lavoro = 1 mM, concentrazione finale = 0,1 mM), 20 µ l di TPP (stock concentrazione di lavoro = 3 mM, concentrazione finale = 0,3 mM) e 20 µ l di NAD⁺ (concentrazione stock di lavoro = 10 mM, concentrazione finale = 1 mM) per ogni w ell.
9. Rimuovere il reagente AUR dal rivestimento di carta stagnola protettiva e aggiungere 20 µ l a ciascun pozzetto.
10. Aggiungere 20 µ l di piruvato (concentrazione d'archivio che vanno da 1 a 100 mM, concentrazione finale per saggi di lavoro = 0,1-10 mM) per pozzetti contenenti PDHC e α-chetoglutarato (concentrazione d'archivio che vanno da 1 a 100 mM, concentrazione finale per saggi di lavoro = 0,1-10 mM) per pozzetti contenenti KGDHC.
11. Clicca su "Leggi" per avviare la misurazione della cinetica.

6. analisi dei dati

1. Tenere premuto il tasto 'CTRL' sulla tastiera e fare clic su pozzi per generare un grafico contenente tutte le misure cinetiche corrispondente al canale 1 (Figura 3A).
2. Fare clic su "dati" nell'icona Visualizza in alto a destra per valori non elaborati per unità relativa fluorescenza (RFU) misurata a intervalli di tempo differenti (Figura 3B).
3. Esportare i valori per l'analisi (tabella 3).
4. Fare clic sul menu in alto a destra (Figura 3B) a discesa "Grafico" per accedere ai valori RFU associati al canale di fluorescenza 2.
5. Ripetere i passaggi da 6.1 a 6.3 per il canale 2.

Risultati

Figura 3A fornisce una traccia rappresentativa per la RFU raccolta durante la misurazione simultanea di H₂O₂ e la produzione di NADH di KGDHC purificato. I dati grezzi RFU per ogni intervallo di tempo sono raffigurati nella Figura 3B. I dati grezzi RFU sono poi esportati per analisi. Estrapolando da curve standard presentate nella Figura 2, può essere determinato l'importo asso...

Discussione

Questo protocollo è vantaggioso poiché, 1) Elimina eventuali reazioni concorrenti che altrimenti potrebbero interferire con il rilevamento di H₂O₂ (ad esempio, i sistemi antiossidanti o altre fonti di ROS), 2) fornisce una valutazione diretta del tasso nativo di ROS di rilascio di una deidrogenasi mitocondriale di flavin-contenente, 3) permette il confronto del nativo ROS rilasciare tariffe di due o più purificato basati su flavina deidrogenasi, 4) può consentire un confronto diretto de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pyruvate dehydrogenase complex	SIGMA	P7032-10UN	purified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex	SIGMA	K1502-20UN	purified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solution	SIGMA	HX0640-5	reagent, standard curves
NAD+	SIGMA	N0632-1G	reagent, activity/ROS release assay
NADH	SIGMA	N4505-100MG	reagent, standard curves
pyruvate	SIGMA	P2256-5G	reagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarate	SIGMA	75892-25G	reagent, activity/ROS release assay
CoASH	SIGMA	C3019-25MG	reagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphate	SIGMA	C8754-1G	reagent, activity/ROS release assay
mannitol	SIGMA	M4125-100G	buffer component
Hepes	SIGMA	H3375-25G	buffer component
sucrose	SIGMA	S7903-250G	buffer component
EGTA	SIGMA	E3889-10G	buffer component
KMV	SIGMA	198978-5G	reagent, ROS release inhibitor
CPI-613	Santa Cruz	sc-482709	reagent, ROS release inhibitor
SOD	SIGMA	S9697-15KU	reagent, ROS release detection
horseradish peroxidase	SIGMA	P8375-1KU	reagent, ROS release detection
Amplex Ultra Red	Thermofisher	A36006	reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate reader	BioTek Instruments		microplate reader for assays
Gen5 software	BioTek Instruments		software, used for collection of raw RFU
Graphpad Prism	Graphpad software		software, data analysis
Microsoft EXCEL	Microsoft		software, data analysis