JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Митохондрии содержат несколько Флавин зависимых ферментов, которые могут производить реактивнооксигенных видов (ров). Мониторинг ROS освобождение от отдельных участков в митохондриях является сложной задачей вследствие нежелательных побочных реакций. Мы представляем простой, недорогой метод для прямой оценки родной ставок для выпуска ROS, используя чистые flavoenzymes и микроплиты флюометрия.

Аннотация

Сообщается, что митохондрий может содержать до 12 ферментативные источники реактивнооксигенных видов (ров). Большинство из этих сайтов включают Флавин зависимых дыхательных комплексов и дегидрогеназ, которые производят смесь супероксида (O2● -) и пероксида водорода (H2O2). Точная количественная оценка производства рос потенциал отдельных участков в изолированных митохондриях может быть сложным из-за присутствия антиоксидантных систем обороны и побочных реакций, которые также образуют O2●-/ h2O2. Использование неспецифические ингибиторы, которые могут нарушить митохондриальной биоэнергетики также может скомпрометировать измерений, изменяя ROS релиз от других мест производства. Здесь мы представляем простой метод для одновременного измерения H2O2 выпуска и Никотинамидадениндинуклеотид (NADH) производства, очищенный дегидрогеназ, Флавин связаны. Для наших целей здесь мы использовали очищенный пируват дегидрогеназа комплекс (PDHC) и альфа-кетоглутарата дегидрогеназа комплекс (KGDHC), свинину сердце происхождения в качестве примеров. Этот метод позволяет точное измерение родной H2O2 релиз ставок на отдельных участках производства путем устранения других потенциальных источников рос и антиоксидантной систем. Кроме того этот метод позволяет для прямого сравнения отношений между H2O2 выпуска и ферментативной активности и проверки эффективности и избирательности ингибиторов для производства рос. В целом такой подход может позволить для углубленной оценки родной темпы рос выпуска для отдельных ферментов до более сложных экспериментов с изолированных митохондриях или permeabilized мышечные волокна.

Введение

Конечная цель обмена питательных веществ, чтобы аденозинтрифосфатом (АТФ). В mammalian клетках это происходит в митохондриях, двойной membraned органеллы, которые преобразуют энергию, запасенную в углерода в СПС. Начинается производство АТФ когда углерода сжигается в митохондриях, образуя два электрона перевозчиков, NADH и флавин аденин динуклеотид (ГВС2)1. NADH и ГВС2 затем окисляются, мульти Субблок дыхательных комплексов I и II, соответственно, и освобожденных электроны пролетах до терминала электрон акцептора молекулярного кислорода (2O) в комплекс IV1. Термодинамически благоприятные «спуск» передачи электронов2 O в конце цепи соединен к экспорту протонов в intermembrane пространство комплексы I, III и IV. Это создает градиент трансмембранных электрохимических протонов (Протон движущей силой), временная форма свободная энергия Гиббса, что постучал в комплекс V чтобы СПС2. Реакции переноса электрона в митохондриях не соединены идеально для производства АТФ. На различных этапах цикла Кребса и дыхательной цепи электроны могут преждевременно взаимодействовать с O2 к форме рос3. O2● - и H2O2наиболее биологически соответствующих ROS, порожденных митохондрий. Хотя O2● - часто считается проксимальной ROS, образованный митохондрий, очевидно теперь сайты производства образуют смесь O2● - и H2O2, который связан с бесплатно радикальные химии Флавин протезов группы4,5. На высоком уровне рос может быть опасным, повреждения биологических компонентов, необходимых для функции клеток, что приводит к окислительным дистресс6. Однако в низкой суммы, митохондриальных ROS выполнять жизненно важные функции сигнализации. Например H2O2 выхода из митохондрий было вовлечено в управление активации Т-клеток, стресс сигнализации (например, индукции Nrf2 сигнальных путей), индукции пролиферации и дифференцировки, Инсулин сигнализации и релиз и кормление поведение7. Значительный прогресс был достигнут в понимании сигнальные функции рос. Однако важные вопросы все еще остаются в отношении которой ферментов митохондрий служат наиболее важными источниками и как контролируется производства.

ROS релиза на веб-сайте производства зависит от нескольких факторов: 1) концентрация жертвуя электрон, 2 редокс состояние электрона пожертвования сайта, 3) доступ кислорода, и 4 концентрации и тип окислением субстрата3, сайта 8 , 9. в митохондриях, другие факторы, как концентрация NADH и мембранный потенциал силы также влияют ROS производства8,10. Например уровень O2●-/ h2O2 производства очищенной PDHC или KGDHC увеличивается с растущей NADH доступности5,11. В этом случае электроны текут назад от НАДН в Причуды центр E3 субъединица PDHC или KGDHC, на сайте O2●-/ h2O2 производства12. Аналогично предоставление NAD+ имеет противоположный эффект, уменьшение ROS освобождение от KGDHC12. Таким образом контроль входа или выхода электронов от мест его производства Рос может изменить, сколько O2●-/ h2O2 образуется. Например блокирование субъединица2 E PDHC или KGDHC с ИПЦ-613, липоевая кислота, аналоговый, результаты в почти 90% снижение O2●-/ h2O2 производство13. Аналогичные результаты могут быть получены с химической S-glutathionylation катализаторов, diamide и Дисульфирам, которые почти упразднить O2●-/ h2O2 производства PDHC или KGDHC через глагольных форм глутатиона на E 2 субъединицы14. Компромисс для блокирования потока электронов через субъединица2 E PDHC и KGDHC – это снижение производства NADH, которая уменьшает образование рос по электрон-транспортной цепи (например, комплекс III). Это также может снизить выход АТФ, электрон-транспортной цепи. В целом блокирование электрона вход к местам производства Рос может быть весьма эффективным средством контроля над O2●-/ h2O2 производства.

Митохондрии может содержать до 12 потенциальных O2●-/ h2O2 источники6. Большинство из этих сайтов, Флавин содержащие ферменты, которые генерируют смесь O2● - и H2O2. Использование различных субстрата и комбинации ингибитора позволили для идентификации которых дыхательных комплексов и митохондриальной дегидрогеназ служить высокой емкости O2●-/ h2O2 формирования участков в 3различных тканей. Было показано, что PDHC и KGDHC служить высокой емкости O2●-/ h2O2 излучающих сайтов в мышцах и печени митохондрий13,15. Однако остаются некоторые трудности в отношении рассмотрения O2●-/ h2O2 образующих потенциал отдельных участков в митохондриях и влияния, которые различные субстрата и комбинации ингибитора на деятельность ферментов. Это связано с наличием нежелательных побочных реакций (например, формирование O2●-/ h2O2 сайтов помимо фермента интерес), загрязняя эндогенного питательных веществ (например,жирные кислоты) или органеллы (например, пероксисомы, которые также образуют O2●-/ h2O2) и использование ингибиторов, которые отсутствие избирательности, и/или использование соединений, которые не полностью тормозят производство рос. Некоторые ингибиторы могут также изменить митохондриальной биоэнергетики и направление потока электронов, и это изменяет ROS релиз от других мест производства и смешивает результаты. Абсолютная тарифы заO2●-/ h2O2 релиз от отдельных участков в митохондриях также трудно определить из-за высокой концентрации O2● - и H2O2 ликвидация ферментов в матрицу и intermembrane пространстве. Таким образом ликвидация любых конкурирующих реакций, которые могут мешать O2●-/ h2O2 релиз измерений могут быть полезны при определении высокой емкости O2●-/ h2O2 формирование сайтов.

Здесь мы представляем простой метод, который позволяет одновременное рассмотрение O2●-/ h2O2 производство и формирование NADH, очищенный дегидрогеназ Флавин зависимых. С помощью очищенные ферменты, нежелательные ROS, образуя побочных реакций и рос, унижающего достоинство ферменты могут быть устранены позволяет для более точного измерения родной O2●-/ h2O2 производства ставок для отдельных flavoenzymes. Этот метод может использоваться непосредственно сравнивать O2●-/ h2O2 формирования потенциала различных очищенный дегидрогеназ или потенциальным участкам ингибиторы экрана O2●-/ h2O выпуск 2 . Наконец измерения O2●-/ h2O2 и НАДН производства одновременно может позволить для реального времени оценки взаимосвязи между ферментативной активности и способности релиз рос.

протокол

1. химические вещества и очищенные ферменты

  1. Приобрести следующие материалы: PDHC и KGDHC свинину сердце происхождения (или другой очищенный митохондриальной flavoenzyme); H2O2 (30% раствора), пируват, альфа-кетоглутарата, NAD+, NADH, CoASH, тиамин пирофосфат (ТЭС), маннитол, HEPES, сахароза, EGTA, 3-метил-2-оксо Валериановая кислота (КМВ), супероксиддисмутаза (SOD), пероксидаза (ПХ), 10-ацетил-3,7-dihydroxyphenoxazine реагента (AUR) и ИПЦ-613.

2. Планирование пробирного и подготовка реагента

  1. Настройка пробирного согласно таблице 1 в 96-луночных пластине.
    Примечание: Общий объем для каждой реакции составляет 200 мкл. фондовая концентрации корректируются таким образом, что добавляется 20 мкл реагента для каждой скважины. Это гарантирует быстрое добавление кофакторами и субстраты для каждой реакции хорошо до начала анализа.
  2. Подготовьте реакции буфер, содержащий маннитол 220 мм, 70 мм сахарозы, 1 EGTA и 20 мм HEPES (рН 7,4 с HCl).
    Примечание: Это может измениться в зависимости от физических свойств различных очищенные ферменты.
  3. Изучить очищенный KGDHC или PDHC для загрязнения с помощью фермента деятельность анализов14,,1617 или immunoblot или Кумасси пятно5.
  4. Подготовьте все реагенты в буфере реакции согласно рабочей концентрации раствора в таблице 1.
  5. Хранить все реагенты в 1 мл аликвоты при-20 ° C. Хранить пируват и альфа-кетоглутарата-80 ° c в 100 мкл аликвоты для предотвращения спонтанного деградации вследствие auto окисления и повторного замораживания оттаивания.
  6. Подготовка реагента AUR главного склада в 1 мл ДМСО и затем разбавляют до 100 мкм в буфере реакции. Магазин, защищенном от света.
    Примечание: Рабочий раствор 100 мкм здесь, сделал свежий каждые 2-3 недели и защищены от света.

3. Настройка шаблона Assay

  1. Настройка процедуры пробирного на монохромные Гонав читателя с двойной измерительных возможностей.
  2. Определите процедуру чтения, выбрав «Протокол». Нажмите кнопку «Процедура».
  3. Набор «Температура» до 25 ° C (рис. 1A).
  4. Нажмите кнопку «Начать кинетический», чтобы задать читать условия (Рисунок 1A). Задайте время и количество чтения интервалы/экспериментов.
  5. Нажмите кнопку «прочитать» (рис. 1B).
    Примечание: Образцы считываются из верхней позиции с коэффициентом усиления 50. Время: 5 мин, читайте интервалом 30-х годов. Канал 1: Resorufin флуоресценции - возбуждения/выбросов = 565 nm:600 Нм, длина волны ширина 13,5 Нм. Канал 2: NADH аутофлюоресценция - возбуждения/выбросов = 376 nm:450 Нм, длина волны ширина 20 Нм.
  6. В разделе «READ» выберите скважин для монитора (например, А1-А4 и В1-В4).
  7. Выберите «Конец КИНЕТИЧЕСКОЙ».

4. стандартные кривые

  1. Оттепель реагентов и хранить на льду, пока он не понадобится.
  2. НАДН калибровочной кривой (рисунок 2A)
    1. Подготовьте рабочие решения для НАДН в диапазоне концентрации 0,5-10 мм в буфере реакции.
    2. Добавьте 20 мкл аликвоты каждого NADH рабочей концентрации раствора для скважин, содержащий 180 мкл буфера реакции. Конечная концентрация НАДН в каждом хорошо это 0,05-1 мм.
    3. Нажмите кнопку «Прочитать» и установить возбуждения/выбросов = 376 nm:450 Нм, длина волны ширина 20 Нм.
      Примечание: Это является конечной точки только для чтения - кинетические параметры не требуются.
  3. AUR калибровочной кривой (рис. 2B)
    1. Подготовить рабочие запасы перекиси водорода в буфер реакции; складе концентраций в диапазоне от 200-4000 Нм.
    2. Мкл 120 реакции буфера для каждой скважины.
    3. 20 мкл HRP (Рабочая концентрация запасов = 30 ед/мл, конечная концентрация в хорошо = 3 ед/мл), 20 мкл SOD (Рабочая концентрация запасов = 250 ед/мл, конечная концентрация в хорошо = 25 ед/мл) и 20 мкл AUR (Рабочая концентрация запасов = 100 мкм конечная концентрация в хорошо = 10 мкм) каждый хорошо содержащие буфер реакции.
    4. 20 мкл каждого H2O2 работает Стоковый раствор каждому хорошо содержащие буфер и пробирного реагентов. Окончательный реакции объем 200 мкл и конечная концентрация H2O2 в каждой скважине является 20-400 Нм.
    5. Инкубировать пластины для 1 мин в пластине читателя при 25 ° C.
    6. Нажмите кнопку «Прочитать» и установить возбуждения/выбросов = 565 Нм/600 Нм, длина волны ширина 13,5 Нм. Обратите внимание, что это является конечной точки только для чтения - кинетические параметры не требуются.

5. Измерение NADH производства KGDHC и PDHC и O2●- / h2 O2 выпуск

  1. Приведены в таблице 1 для порядок добавления различных реагентов, концентрация каждого рабочего раствора и объем добавил к каждой скважины.
  2. 40 мкл буфера реакции, для каждой скважины. Для анализов с использованием KMV или ИПЦ-613 добавьте 20 мкл буфера в каждой скважине.
  3. 20 мкл PDHC или KGDHC (рабочий запас 1 ед/мл, конечная концентрация на хорошо = 0,1 ед/мл) для каждой скважины.
  4. Инкубируйте PDHC и KGDHC при 25 ° C на 2 мин.
  5. 20 мкл KMV (рабочие запасов = 100 мм, конечная концентрация = 10 мм) или 20 мкл ИПЦ-613 (Рабочая концентрация запасов = 1.5 мм, конечная концентрация = 150 мкм) (Таблица 2).
    Примечание: Этот шаг может быть исключена, если не используются ингибиторы для анализов.
  6. Инкубировать в течение 1 мин при 25 ° C.
    Примечание: Этот шаг может быть исключена, если не используются ингибиторы для анализов.
  7. 20 мкл HRP (Рабочая концентрация запасов = 30 единиц/мл, конечная концентрация в хорошо = 3 единиц/мл) и 20 мкл SOD (Рабочая концентрация запасов = 250 единиц/мл, конечная концентрация в хорошо = 25 единиц/мл) для каждой скважины.
  8. 20 мкл коэнзима A (Рабочая концентрация запасов = 1 мм, конечная концентрация = 0,1 мм), 20 мкл ТЭС (Рабочая концентрация запасов = 3 мм, конечная концентрация = 0,3 мм) и 20 мкл NAD+ (Рабочая концентрация запасов = 10 мм, конечная концентрация = 1 мм) для каждого w ELL.
  9. Снять покрытие защитной фольги AUR реагента и 20 мкл метки для каждой скважины.
  10. 20 мкл пирувата (работает фондовый концентрации, начиная от 1-100 мм, конечная концентрация для анализов = 0,1-10 мм) для скважин, содержащих PDHC и альфа-кетоглютарата (работает фондовый концентрации, начиная от 1-100 мм, конечная концентрация для анализов = 0,1-10 мм) для Уэллс, содержащие KGDHC.
  11. Нажмите кнопку «READ», чтобы начать Кинетические измерения.

6. анализ данных

  1. Удерживая кнопку «CTRL» на клавиатуре и нажмите скважин для создания одного граф, содержащий все Кинетические измерения, соответствующий канал 1 (рис. 3A).
  2. Нажмите кнопку «данные» в представлении значка в правом верхнем углу для необработанных значений относительной флуоресценции единиц (РФС) измеряется в разное время точках (рисунок 3B).
  3. Экспортируйте значения для анализа (Таблица 3).
  4. Нажмите кнопку «График» выпадающего меню вверху справа (рис. 3B) для доступа к значениям РФС, связанный с флуоресцентным каналом 2.
  5. Повторите шаги 6.1 до 6,3 для канала 2.

Результаты

На рисунке 3A обеспечивает представитель трассировки для РФС, собранных во время одновременного измерения H2O2 и НАДН производства очищенной KGDHC. Необработанные данные РФС для каждого интервала времени изображен на рисунке 3B....

Обсуждение

Этот протокол является выгодным с, 1) он устраняет любую конкурирующих реакций, которые могут иным образом вмешиваться H2O2 обнаружения (например, антиоксидантных систем или других источников ROS), 2) обеспечивает прямую оценку родной скорости ROS освободить флавинсодержащи...

Раскрытие информации

Существует ничего не разглашать.

Благодарности

Эта работа финансировалась естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ). Видео производства была проведена в сотрудничестве с центром для инноваций в области преподавания и обучения (НРЖОС) в Мемориальном университете Ньюфаундленда.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Pyruvate dehydrogenase complexSIGMAP7032-10UNpurified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complexSIGMAK1502-20UNpurified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solutionSIGMAHX0640-5reagent, standard curves
NAD+SIGMAN0632-1Greagent, activity/ROS release assay
NADHSIGMAN4505-100MGreagent, standard curves
pyruvateSIGMAP2256-5Greagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarateSIGMA75892-25Greagent, activity/ROS release assay
CoASHSIGMAC3019-25MGreagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphateSIGMAC8754-1Greagent, activity/ROS release assay
mannitolSIGMAM4125-100Gbuffer component
HepesSIGMAH3375-25Gbuffer component
sucroseSIGMAS7903-250Gbuffer component
EGTASIGMAE3889-10Gbuffer component
KMVSIGMA198978-5Greagent, ROS release inhibitor
CPI-613Santa Cruzsc-482709reagent, ROS release inhibitor
SODSIGMAS9697-15KUreagent, ROS release detection
horseradish peroxidaseSIGMAP8375-1KUreagent, ROS release detection
Amplex Ultra RedThermofisherA36006reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate readerBioTek Instrumentsmicroplate reader for assays
Gen5 softwareBioTek Instrumentssoftware, used for collection of raw RFU
Graphpad PrismGraphpad softwaresoftware, data analysis
Microsoft EXCELMicrosoftsoftware, data analysis

Ссылки

  1. Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
  2. Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
  3. Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
  4. Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
  5. Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
  6. Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
  7. Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
  8. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
  9. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
  10. Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
  11. Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
  12. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
  13. Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
  14. O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
  15. Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
  16. Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
  17. Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
  18. Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
  19. Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
  20. Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
  21. Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
  22. Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
  23. Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

132NADH

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены