JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mitokondri Reaktif oksijen türleri (ROS) üretebilir birkaç flavin bağımlı enzim içerir. ROS izleme mitokondri içinde tek tek siteleri istenmeyen yan tepkiler nedeniyle zorlu sürümüdür. Biz saf flavoenzymes ve Mikroplaka fluorometry kullanarak ROS yayımı için yerel oranları doğrudan değerlendirilmesi için bir kolay, ucuz yöntemi mevcut.

Özet

Mitokondri Reaktif oksijen türleri (ROS) 12 enzimatik kaynakları içerebilir bildirilmiştir. Bu sitelerin çoğunluğu flavin bağlı solunum kompleksleri ve süperoksit (O2● -) ve hidrojen peroksit (H2O2) karışımı üretmek dehydrogenases içerir. ROS üreten potansiyel izole mitokondri içinde bireysel siteleri doğru miktar antioksidan savunma sistemleri ve ayrıca O2●-/ h2O2formu yan reaksiyonlar varlığı nedeniyle zor olabilir. Mitokondriyal bioenergetics bozabilir nonspesifik inhibitörleri kullanımı da ROS yayın üretim diğer sitelerden değiştirerek ölçümleri olumsuz etkileyebilir. Burada, saflaştırılmış flavin bağlı dehydrogenases tarafından eş zamanlı ölçüm H2O2 serbest bırakmak ve Nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) üretim için kolay bir yöntem mevcut. Burada kastedilen, örnek olarak saflaştırılmış pyruvate dehidrogenaz kompleksi (PDHC) ve α-ketoglutarate dehidrogenaz kompleksi (KGDHC) domuz kalp kökenli kullandık. Bu yöntemi doğru bir ölçü oranlarının yerli H2O2 yayın üretim bireysel siteleri tarafından ROS ve antioksidan sistemleri diğer potansiyel kaynakları ortadan kaldırarak olanak sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem H2O2 serbest bırakmak ve enzim aktivitesi ve etkinliği testi ile taranması ve inhibitörleri ROS üretim için selectivity ilişkisi doğrudan karşılaştırması için izin verir. Genel olarak, bu yaklaşım ROS yayın izole mitokondri veya permeabilized kas fiber ile daha sofistike deneyler önce bireysel enzimler için yerel oranları derinlemesine değerlendirilmesi için izin verebilirsiniz.

Giriş

Besin metabolizma, nihai hedefi adenozin trifosfat (ATP) yapmaktır. Memeli hücrelerinde mitokondri, ATP karbon depolanan enerji dönüştürme çift membraned organelleri içinde oluşur. Karbon iki elektron taşıyıcıları, NADH ve flavin adenin dinükleotit (FADH2)1şekillendirme mitokondri tarafından yakılarak olduğunda ATP üretimi başladı. NADH ve FADH2 o zaman okside çoklu alt birim solunum kompleksleri tarafından ı ve II, sırasıyla ve elektron alıcısı moleküler oksijen (O2) karmaşık IV1için serbest elektron Guam'dan sürekli. Thermodynamically olumlu "yokuş aşağı" transferi elektron zinciri sonundaki O2 proton verileceği intermembrane birleştirilmiştir uzay kompleksleri tarafından ı, III ve IV. Bu bir transmembran elektrokimyasal gradyan proton (proton-sebep kuvvet), ATP2yapmak için karmaşık V tarafından dinleniyor Gibbs serbest enerjisi geçici bir form oluşturur. Elektron transferi reaksiyonlar mitokondri içinde mükemmel ATP üretimi için birleştiğinde değil. Krebs döngüsü ve solunum zinciri çeşitli noktalarda, elektron zamanından önce O2 forma ROS3ile etkileşim kurabilir. Mitokondri tarafından oluşturulan en biyolojik ilgili ROS O2● - ve H2O2' dir. Şimdi ne kadar O2● - kez mitokondri tarafından kurulan proksimal ROS olarak, üretim siteleri ücretsiz ile ilişkili olduğu O2● - ve H2O2, karışımı oluşturmak belirgin flavin protez radikal kimya4,5gruplandırır. Yüksek düzeylerde ROS oksidatif stres6' kaynaklanan hücre işlevi için gerekli biyolojik bileşenlerinin zarar tehlikeli olabilir. Ancak, düşük tutarları, mitokondrial ROS hayati sinyal işlevleri yerine getirmek. Örneğin, H2O2 sürümü mitokondri T hücre aktivasyonu, stres sinyal (örneğin, indüksiyon Nrf2 sinyal yollar), hücre çoğalması ve farklılaşma indüksiyon kontrolünde karıştığı olmuştur, insülin sinyal ve serbest bırakmak ve davranış7besleme. Önemli ROS sinyal gönderme işlevini anlama konusunda ilerlemeler kaydedilmiştir. Ancak, önemli soru hala cevap bekliyor hangi açısından enzimler mitokondri içinde en önemli kaynakları ve nasıl üretim kontrol olarak hizmet vermektedir.

ROS yayın üretim sitesi tarafından birkaç faktöre bağlıdır: 1) konsantrasyonu elektron bağış site, 2) elektron bağış sitesi, oksijen ve 4) konsantrasyon 3) erişim Redoks durumunu ve oksidasyon substrat3, türü 8 , 9. NADH ve membran potansiyel gücü konsantrasyonu da etkiler gibi ROS üretim8,10mitokondri içinde diğer faktörler. Örneğin, O2●-/ h2O2 tarafından üretimin saf PDHC veya KGDHC hızı artan NADH durumu5,11ile artar. Bu senaryoda, elektron geriye doğru PDHC ya da KGDHC,O2● // h2O2 üretim12sitesi E3 alt birim FAD Merkezi NADH akıyor. Benzer şekilde, NAD+ hükmü ROS yayın KGDHC12azalan ters etkiye sahiptir. Böylece, kontrol giriş veya çıkış elektron ROS üretim sitelerden ne kadar O2●-/ h2O2 oluşan değiştirebilirsiniz. Örneğin, PDHC veya CPI-613, analog, sonuçları bir neredeyse % 90 O2● -içinde/h2O2 üretim13azaltmak lipoic asit ile KGDHC E2 alt birim engelliyor. Kimyasal S-glutathionylation Katalizörler, diamide ve Ampisilin, hangi neredeyse O2●-/ h2O2 üretim PDHC veya KGDHC tarafından glutatyon e konjugasyon üzerinden kaldırılması ile benzer sonuçlar elde 2 alt birim14. E2 alt birim PDHC ve KGDHC ile elektron akışını engelleme için ticaret-off ROS oluşumuna elektron taşıma zinciri tarafından (örneğin, karmaşık III) azalır NADH üretim bir azalmadır. Bu da elektron taşıma zinciri tarafından ATP çıkış düşürebilir. Genel olarak, ROS üretim siteleri için elektron giriş kütük parçası O2●-/ h2O2 üretim kontrol son derece etkili bir anlamı olabilir.

Mitokondri 12'ye kadar potansiyel O2●-/ h2O2 kaynakları6içerebilir. Bu sitelerin çoğu flavin içeren O2● - ve H2O2karışımı oluşturan enzimler. Farklı yüzey ve önleyici bileşimleri kullanımı hangisitelerde oluşturan yüksek kapasiteli O2●-/ h2O2 solunum kompleksleri ve mitokondriyal dehydrogenases hizmet tanımlaması için izin verilen farklı dokuların3. PDHC ve KGDHC yüksek kapasiteli O2●-/ h2O2 kas ve karaciğer mitokondri13,15yayan siteleri hizmet gösterilmiştir. Ancak, mitokondri ve etkisi farklı substrat ve önleyici bileşimleri olan bireysel sitelerin potansiyel oluşturan O2●-/ h2O2 incelenmesi açısından bazı zorluklar kalır enzimler faaliyetleri. Bu istenmeyen yan reaksiyonlar (örneğin, O2●-/ h2O2 siteleri dışındaki faiz enzim tarafından oluşumu) varlığı nedeniyle, endojen besin (örneğin,yağ kirletici asitler) veya organelleri (örneğin, aynı zamanda O2●-/ h2O2şeklinde tanımladıkları) ve seçicilik eksikliği inhibitörleri kullanımı ve/veya tamamen ROS üretim inhibe değil bileşikler kullanımı. Belirli inhibitörleri Ayrıca mitokondriyal bioenergetics ve elektron akışı yönünü değiştirebilir ve bu üretimin diğer sitelerden ROS sürüm değiştirir ve sonuçları zihnimi karıştıran. O2●-/ h2O2 serbest bırakılması için bireysel sitelerinden mitokondri yapılan mutlak oranları da O2● - ve H2O2 yüksek konsantrasyonu nedeniyle ölçmek zordur matris ve intermembrane alanı içinde enzimler ortadan kaldırarak. Bu nedenle, O2●-/ h2O2 yayın ölçümleri ile engelleyebilir herhangi bir rakip tepkiler ortadan kaldırılması yüksek kapasiteli O2●-/ h2O2 belirlerken yararlı olabilir siteleri şekillendirme.

Burada, O2●-/ h2O2 üretim ve NADH oluşumu eşzamanlı incelenmesi için saflaştırılmış flavin bağımlı dehydrogenases tarafından sağlar basit bir yöntem mevcut. Arıtılmış enzimler kullanarak, istenmeyen yan reaksiyonlar oluşturan ROS ve enzimler aşağılayıcı ROS bırakmak daha doğru bir ölçü birimi yerel O2●-/ h2O2 üretim oranları için bireysel flavoenzymes için ortadan kaldırılabilir. Bu yöntem doğrudan O2●-/ h2O için kapasite farklı arıtılmış dehydrogenases veya ekran potansiyel siteye özgü inhibitörleri oluşturan O2●-/ h2O2 karşılaştırmak için kullanılabilir 2 serbest bırakmak. Son olarak, O2●-/ h2O2 ve NADH üretim aynı anda ölçme enzim aktivitesi ve ROS yayın kapasitesi arasındaki ilişkinin gerçek zamanlı bir değerlendirmesi için izin verebilirsiniz.

Protokol

1. kimyasal maddeler ve arıtılmış enzimler

  1. Aşağıdaki belgeleri temin etmek: PDHC ve KGDHC domuz kalp kökenli (veya başka bir saf mitokondriyal flavoenzyme); H2O2 (% 30 çözüm), pyruvate, α-ketoglutarate, NAD+, NADH, CoASH, tiamin pirofosfat (DYP), mannitol, HEPES, sukroz, EGTA, 3-metil-2-oxo valeric asit (KMV), süperoksit dismutaz (SOD), horseradish peroksidaz (HRP), 10-asetil-3,7-dihydroxyphenoxazine reaktifi (AUR) ve CPI-613.

2. planlama tahlil ve reaktif hazırlık

  1. Tablo 1 göre tahlil bir 96-şey plaka ayarlayın.
    Not: Toplam her reaksiyon için 200 µL. hisse senedi konsantrasyonları böyle reaktif 20 µL eklenir ayarlanır birimdir her şey için. Bu kofaktör ve yüzeylerde de tahlil başlamadan önce her tepki için hızlı ek sağlar.
  2. 220 mM mannitol, 70 mM sukroz, 1 mM EGTA ve 20 mM HEPES (pH 7.4 HCl ile) içeren tepki arabellek hazırlayın.
    Not: Bu farklı arıtılmış enzimler fiziksel özellikleri bağlı olarak değişebilir.
  3. Saf KGDHC veya PDHC enzim aktivitesi deneyleri14,16,17 kullanarak kirlenme veya immunoblot incelemek veya Coomassie leke5.
  4. Tablo 1çalışma çözüm konsantrasyonlarda göre tepki arabellekteki tüm reaktifler hazırlayın.
  5. 1 mL aliquots-20 ° C'de olarak tüm reaktifler saklamak Auto-oksidasyon ve tekrarlanan donma-çözülme nedeniyle kendiliğinden yıkımı önlemek için 100 µL aliquots pyruvate ve α-ketoglutarate-80 ° C'de depolayın.
  6. AUR reaktif DMSO 1 mL ana stok hazırlamak ve 100 µM tepki arabelleği için oranında seyreltin. Işıktan korunan mağaza.
    Not: Burada, 100 µM çalışma çözüm taze her 2-3 hafta yaptı ve ışıktan korunan.

3. Assay şablon ayarlama

  1. Bir tek renkli Mikroplaka okuyucu Çift ölçüm yetenekleri ile tahlil ameliyat ayarlayın.
  2. Okuma yordamı "Protokol" seçerek belirleyin. O zaman "Yordamı"'ı tıklatın.
  3. "Sıcaklık" 25 ° C (şekil 1A) ayarlayın.
  4. "Başlamak okuma koşulları (şekil 1A) ayarlamak için kinetik"'ı tıklatın. Okuma aralıkları/deneyler sayısı ve zamanı ayarlayın.
  5. Tıklayın "oku" (şekil 1B).
    Not: Üst konumda örnekleri okunduğu bir kazancı 50. Süresi: okuma 5 dk, 30-s aralıklarla. Kanal 1: Resorufin floresan - uyarma/emisyon 565 nm:600 nm, 13,5 dalga boyu genişliği = nm. Kanal 2: NADH autofluorescence - uyarma/emisyon 376 nm:450 nm dalga boyu genişliği 20 = nm.
  6. Altında "okuma", wells (örneğin, A1-A4 ve B1-B4) monitör için seçin.
  7. "Son kinetik" seçin.

4. standart eğrileri

  1. Reaktifleri çözülme ve ihtiyaç kadar buza saklayın.
  2. NADH standart eğri (şekil 2A)
    1. Çalışma çözümleri 0,5-10 mM tepki arabelleği konsantrasyon aralığında NADH için hazırlayın.
    2. 20 µL aliquots çözüm konsantrasyonu 180 µL tepki arabellek içeren wells için çalışma her NADH ekleyin. NADH son konsantrasyonu her şey 0,05-1 mM.
    3. "Oku"'ni tıklatın ve uyarma/emisyon 376 nm:450 nm dalga boyu genişliği 20 = nm.
      Not: Bu salt okunur bir son nokta - Kinetik parametrelerin gerekli değildir.
  3. AUR standart eğri (şekil 2B)
    1. Hidrojen peroksit tepki arabelleği çalışma stokları hazırlamak; hisse senedi konsantrasyonları 200-4.000 nM arasındadır.
    2. 120 µL tepki arabelleği her şey için ekleyin.
    3. HRP 20 µL eklemek (hisse senedi toplama çalışma 30 U/mL, iyi son konsantrasyonu = 3 U/mL =), 20 µL SOD (hisse senedi toplama çalışma 250 U/mL, iyi son konsantrasyonu = 25 U/mL =) ve AUR 20 µL (hisse senedi toplama çalışma 100 µM = iyi son konsantrasyonu 10 µM =) de içeren her reaksiyon arabellek için.
    4. Her tampon ve tahlil reaktifler de içeren stok çözüm çalışma her H2O2 20 µL ekleyin. Son tepki birim 200 µL ve her iyi H2O2 son konsantrasyonu 20-400 nM.
    5. 1 dk içinde 25 ° C'de plaka okuyucu için tabak kuluçkaya
    6. "Oku"'ni tıklatın ve uyarma/emisyon 565 nm/600 nm, 13,5 dalga boyu genişliği = nm. Bu salt okunur bir son nokta olduğunu unutmayın - Kinetik parametrelerin gerekli değildir.

5. O2●- / h2 O2 yayın ve KGDHC ve PDHC tarafından NADH üretim ölçme

  1. Bkz. Tablo 1 farklı reaktifleri ilavesi sipariş için her çalışma çözüm ve birimin her için eklendi iyi.
  2. 40 µL tepki arabelleği her şey için ekleyin. KMV veya CPI-613 kullanarak deneyleri için 20 µL arabelleği her şey için ekleyin.
  3. PDHC veya KGDHC 20 µL ekleyin (çalışma stok 1 U/ml, son konsantrasyonu iyi başına 0.1 U/mL =) her şey için.
  4. PDHC ve KGDHC için 2 dk 25 ° C'de kuluçkaya.
  5. KMV 20 µL ekleyin (çalışma stok = 100 mM, son konsantrasyonu = 10 mM) veya CPI-613 20 µL (hisse senedi toplama çalışma 1.5 mM, son konsantrasyonu = 150 µM =) (Tablo 2).
    Not: Eğer inhibitörleri deneyleri için kullanılmayan bu adımı dışlanabilir.
  6. 25 ° C'de 1 dk. için kuluçkaya
    Not: Eğer inhibitörleri deneyleri için kullanılmayan bu adımı dışlanabilir.
  7. HRP 20 µL ekleyin (hisse senedi toplama çalışma 30 adet/mL, iyi son konsantrasyonu = 3 adet/mL =) ve SOD 20 µL (hisse senedi toplama çalışma 250 adet/mL, iyi son konsantrasyonu = 25 adet/mL =) her şey için.
  8. Koenzim a 20 µL eklemek (hisse senedi toplama çalışma = 1 mM, son konsantrasyonu = 0,1 mM), 20 µL DYP (hisse senedi toplama çalışma = 3 mM, son konsantrasyonu 0.3 mM =) ve NAD+ 20 µL (hisse senedi toplama çalışma = 10 mM, son konsantrasyonu = 1 mM) her w söyle.
  9. AUR reaktif koruyucu folyo kaplama kaldırın ve her şey için 20 µL ekleyin.
  10. Pyruvate 20 µL ekleyin (hisse senedi toplama 1-100 mM, deneyleri için son konsantrasyonu arasında değişen çalışma = 0,1-10 mM) PDHC ve α-ketoglutarate içeren wells için (hisse senedi toplama 1-100 mM, deneyleri için son konsantrasyonu arasında değişen çalışma = 0,1-10 mM) için KGDHC içeren wells.
  11. "Oku" Kinetik ölçüm başlatmak için tıklatın.

6. veri analizi

  1. Klavye 'CTRL' düğmesini basılı tutun ve kuyu Kanal 1 (şekil 3A) karşılık gelen tüm Kinetik ölçüleri içeren bir grafik oluşturmak için tıklatın.
  2. Farklı zaman noktalarda (3B rakam) ölçülen göreli Floresans birimleri (RFU) için "veri" görünümü simgesi ham değerleri için sağ üst köşedeki tıklatın.
  3. Analizi (Tablo 3) değerleri verin.
  4. "Grafik" damla aşağı yemek listesi (şekil 3B) sağ üst üzerinde Floresans Kanal 2 ile ilişkili RFU değerlerini erişmek için tıklatın.
  5. 6.1-6.3 Kanal 2 için yineleyin.

Sonuçlar

Şekil 3A tarafından arıtılmış KGDHC H2O2 ve NADH üretim eş zamanlı ölçüm sırasında toplanan RFU için bir temsilci izleme sağlar. Ham RFU veri her zaman aralığı için şekil 3B' tasvir edilir. Ham RFU veri daha sonra analiz için verilir. Şekil 2' de sunulan standart eğriler üzerinden extrapolating tarafından her ölçüm Aralık 5 dk süre içinde oluşan ...

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı beri avantajlıdır, 1) bu aksi takdirde H2O2 algılama (örneğin, antioksidan sistemleri veya diğer kaynakları ROS), ile 2 engel olabilecek herhangi bir rakip tepkiler ortadan kaldırır) yerel oranı doğrudan bir değerlendirmesini sağlar ROS serbest bir flavin içeren mitokondrial dehidrogenaz tarafından 3) yerli karşılaştırmasını sağlar ROS yayın oranları iki veya daha fazla saf flavin tabanlı dehydrogenases, 4) oranı ROS yayın ve enzim aktivitesi ...

Açıklamalar

İfşa etmek bir şey yoktur.

Teşekkürler

Bu eser Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) tarafından finanse edildi. Video üretim merkezi için yenilik öğretim ve öğrenme (CITL), Newfoundland Memorial Üniversitesi ile işbirliği içinde gerçekleştirilmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Pyruvate dehydrogenase complexSIGMAP7032-10UNpurified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complexSIGMAK1502-20UNpurified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solutionSIGMAHX0640-5reagent, standard curves
NAD+SIGMAN0632-1Greagent, activity/ROS release assay
NADHSIGMAN4505-100MGreagent, standard curves
pyruvateSIGMAP2256-5Greagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarateSIGMA75892-25Greagent, activity/ROS release assay
CoASHSIGMAC3019-25MGreagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphateSIGMAC8754-1Greagent, activity/ROS release assay
mannitolSIGMAM4125-100Gbuffer component
HepesSIGMAH3375-25Gbuffer component
sucroseSIGMAS7903-250Gbuffer component
EGTASIGMAE3889-10Gbuffer component
KMVSIGMA198978-5Greagent, ROS release inhibitor
CPI-613Santa Cruzsc-482709reagent, ROS release inhibitor
SODSIGMAS9697-15KUreagent, ROS release detection
horseradish peroxidaseSIGMAP8375-1KUreagent, ROS release detection
Amplex Ultra RedThermofisherA36006reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate readerBioTek Instrumentsmicroplate reader for assays
Gen5 softwareBioTek Instrumentssoftware, used for collection of raw RFU
Graphpad PrismGraphpad softwaresoftware, data analysis
Microsoft EXCELMicrosoftsoftware, data analysis

Referanslar

  1. Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
  2. Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
  3. Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
  4. Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
  5. Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
  6. Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
  7. Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
  8. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
  9. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
  10. Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
  11. Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
  12. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
  13. Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
  14. O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
  15. Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
  16. Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
  17. Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
  18. Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
  19. Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
  20. Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
  21. Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
  22. Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
  23. Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasay 132Reaktif oksijen t rlerihidrojen peroksitNADHflavin ba ml dehydrogenasesAlfa ketoglutarate dehidrogenaz kompleksipyruvate dehidrogenaz kompleksiMikroplaka fluorometryenzim aktivitesimitokondri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır