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要約

ミトコンドリアは、活性酸素種 (ROS) を生成することができますいくつかのフラビン依存型酵素を含まれています。ROS を監視ミトコンドリアの個々 のサイトからのリリースは不要な副反応のために挑戦です。簡単、安価な精製フラビン酵素とマイクロ プレート蛍光分析を使用して、ROS リリース ネイティブ料金を直接評価法を提案します。

要約

それは、ミトコンドリアが活性酸素種 (ROS) の最大 12 酵素源を含めることができます報告されています。これらのサイトの大半には、フラビン依存型呼吸鎖複合体と脱水素酵素活性酸素 (O2● -) と過酸化水素 (H2O2) の混合物を生成するがあります。ミトコンの個々 のサイトの ROS 産生能の定量の正確さは抗酸化防衛システムとO2● -/H2O2を形成するも副反応の存在のために困難なことができます。ミトコンドリアの生体エネルギーを乱すことができる非特異的阻害剤の使用は、生産の他のサイトから ROS のリリースを変更することにより測定を脅かされる可能性も。精製フラビン結合脱水素酵素によって H2O2リリースとニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NADH) 生産の同時測定のための簡単な方法を紹介します。我々 の目的はここで、例として精製されたピルビン酸脱水素酵素複合体 (PDHC) と α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体 (KGDHC) のブタ心臓起源を使いました。このメソッドはネイティブによって生産の個々 のサイトの H2O2解放率の正確な測定のため活性酸素と抗酸化システムの他の潜在的な原因を排除することによってできます。さらに、このメソッドは、H2O2リリースと酵素活性と有効性のスクリーニングと活性酸素産生の阻害の選択性の関係の直接比較のためことができます。全体的に、このアプローチを分離ミトコンドリアやグリセリン筋線維でのより高度な実験を行う前に個々 の酵素の ROS リリースのネイティブ速度の詳細な評価を許可できます。

概要

栄養代謝の究極の目標は、アデノシン三リン酸 (ATP) をすることです。哺乳類セルのこれはカーボンで ATP に蓄えられたエネルギーを変換する二重の機能を担った細胞小器官ミトコンドリアで発生します。ATP の生産が始まる炭素がミトコンドリア NADH およびフラビンアデニンジヌクレオチド (FADH2)1の 2 つの電子キャリアを形成によって燃焼させる。NADH および FADH2によって酸化されて複数のサブユニット呼吸鎖複合体 I および II、それぞれ、および解放された電子が複雑な IV1ターミナル電子アクセプター分子酸素 (O2) へフェリーで行きます。熱力学的に有利な「下り坂」電子の移動 O2チェーンの終わりには、intermembrane に陽子の輸出に結合複合体 I、III、および IV スペースします。これは、陽子 (プロトン動機力)、2ATP を作る複雑な V によってタップされてギブス自由エネルギーの一時的な形式の貫通型電気化学的勾配を作成します。ミトコンドリアの電子伝達反応は、ATP の生産に完全には結合されていません。クレブスと呼吸鎖の様々 なポイント、電子途中で O2 ROS3形態にやり取りできます。ミトコンドリアによって生成される最も生物学的に関連する活性酸素は O2● -と H2O2。O2● -ミトコンドリアによって形成された近位の ROS と考えは多くの場合、生産のサイトに対して、自由に関連付けられている O2● -と H2O2の混合物を形成することは明白であります。人工フラビンの根本的な化学グループ4,5です。高いレベルで ROS、危険、酸化遭難6細胞機能に必要な生体成分の損傷です。ただし、低額でミトコンドリア ROS は重要なシグナリングの機能を果たします。例えば、ミトコンドリアから放出される H2O2を制御する T 細胞の活性化、ストレス シグナル (例えば、Nrf2 シグナル伝達経路の誘導)、細胞増殖や分化の誘導に関与しています。インスリン シグナルしリリース、および動作7を供給します。活性酸素のシグナル伝達機能を理解する上でかなりの進歩をしました。ただし、重要な質問はまだ残っているに関してミトコンドリアの酵素として最も重要な源および生産を制御する方法。

いくつかの要因に依存する生産のサイトによって ROS リリース: 1) 濃度の電子の寄付サイト、2) 3) 酸素、および 4) 濃度へのアクセス、電子寄付サイトの酸化還元状態と酸化基板3,の種類8,9. NADH および膜の潜在的な強度の濃度も ROS 生産8,10に影響を与えるようなミトコンドリアの他の要因。たとえば、O2● -/H2O2生産精製 PDHC または KGDHC の率は増加 NADH 可用性5,11に増加します。このシナリオでは、PDHC または KGDHC、O2● -/H2O2生産12サイトの E3サブユニットの流行中心に NADH から電子が逆流です。同様に、NAD+の規定は KGDHC12から ROS リリースを減少、反対の効果を持ちます。したがって、活性酸素産生のサイトからの電子制御の出入りを変更できますどのくらい O2● -/H2O2が形成されます。例えば、PDHC の消費者物価指数-613、アナログ、ほぼ 90% 減少 O2● -/H2O2生産13リポ酸と KGDHC E2サブユニットをブロックします。化学 S glutathionylation 触媒、著者、ジスルフィラム、O2● -/H2O2 PDHC または KGDHC を介して生産の E にグルタチオン抱合をほぼ廃止で同様の結果が得られます2サブユニット14。PDHC の KGDHC E2サブユニットを介して電子の流れをブロックするためのトレードオフ (例えば、複合体 III) の電子輸送鎖によって ROS の生成を減少する NADH の生産の減少であります。これはまた電子輸送鎖によって ATP の出力を減らすことができます。全体的に、活性酸素産生のサイトに電子エントリをブロック O2● -/H2O2生産を制御する非常に効果的な手段をすることができます。

ミトコンドリアは、最大 12 潜在的な O2● -/H2O2ソース6を含めることができます。これらのサイトのほとんどは、フラビン含有 O2● -と H2O2の混合物を生成する酵素。呼吸鎖複合体とミトコンドリアの脱水素酵素機能大容量 O2● -/H2O2のサイトを形成する識別に対して異なる基質と阻害剤の組み合わせの使用を許可しました。異なったティッシュ3。PDHC と KGDHC は、筋肉と肝臓のミトコンドリア13,15発光サイト大容量O2● -/H2O2として示されています。ただし、いくつかの困難のまま O2● -/H2O2異なる基質と阻害剤の組み合わせは、ミトコンドリアと影響の個々 のサイトの潜在的な形成の検討に関して酵素の活動。これは、望ましくない副反応 (例えばO2● -/H2O2興味の酵素以外のサイトでの形成) の存在のために汚染内因性栄養素 (例えば、脂肪酸酸) または細胞内小器官 (例えば、ペルオキシソームO2● -/H2O2を形作る)、選択性を欠いている阻害剤の使用や活性酸素産生を完全に抑制しない化合物の使用。特定の阻害剤ミトコンドリアバイオエナジェティックスと電子流れの方向を変更することも、これは生産の他のサイトから ROS リリースを変更し、結果を混同します。O2●/H2O2リリース ミトコンドリアの個々 のサイトからのための絶対速度 O2● -と H2O2の高濃度のため定量化することは困難です。行列と intermembrane スペースで酵素を除去します。したがって、O2● -/H2O2リリース測定を妨害することができます任意の競合反応の除去することができます大容量 O2● -/H2O2 を識別します。サイトを形成します。

脱水素酵素フラビン依存型精製によって O2● -/H2O2生産と NADH 形成の同時受験可能にする簡単な方法を紹介します。精製された酵素を使用してに、原産 O2● -/H2O2生産率である個々 のフラビン酵素のためのより正確な測定を可能にすると、不要な ROS 形成側の反応と活性酸素分解酵素を除去ことができます。このメソッドを使用して直接比較、O2● -/H2O2 O2● -/H2O の異なる精製脱水素酵素または画面潜在的な部位特異的阻害剤の容量を形成できます。2リリース。最後に、O2● -/H2O2と NADH 生産を同時に測定、酵素と活性酸素放出能の関係のリアルタイム評価できます。

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プロトコル

1. 化学薬品および精製された酵素

  1. 下記材料を調達: PDHC とブタ心臓起源 (または別の精製されたミトコンドリア フラビン); KGDHCH2O2 (30% 溶液)、ピルビン酸、α-ケトグルタル酸は、+NAD、NADH、CoASH、チアミンピロリン酸 (TPP)、マンニトール、HEPES、ショ糖、グリコールエーテルジアミン四酢酸、3-メチル-2-オキソ吉草酸 (KMV)、スーパーオキシドジスムターゼ (SOD)、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)10-アセチル-3, 7-dihydroxyphenoxazine 試薬 (AUR) と消費者物価指数-613。

2. アッセイ試薬等の計画

  1. 96 ウェル プレートに表 1に従って分析を設定します。
    注: 各反応の総体積は 200 μ L ストック濃度が調整試薬の 20 μ L を追加できるような各ウェルに。これにより、補因子と基板も分析を開始する前にそれぞれの反応を迅速に追加。
  2. 220 mM マンニトール、70 mM ショ糖、グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM と 20 mM HEPES (塩酸で pH 7.4) を含む反応バッファーを準備します。
    注: これは異なる精製酵素の物性に応じて変更できます。
  3. Coomassie 染色5または酵素活性アッセイ14,16,17に用いた汚染またはイムノブロットによって浄化された KGDHC または PDHC を確認します。
  4. すべて試薬作業液濃度が表1 に従って反応バッファーを準備します。
  5. -20 ° C で 1 mL 因数としてすべての試薬を格納します。ストア ピルビン酸、α-ケトグルタル酸自動酸化と繰り返し凍結融解による自然劣化を防ぐために 100 μ L の因数で-80 ° c。
  6. AUR 試薬 1 ml の DMSO のマスターの在庫を準備し、反応バッファー 100 μ M に希釈しています。光から保護されたストア。
    注: ここでは、100 μ M の作業ソリューションは、すべて 2 〜 3 週間で作った新鮮な光から保護します。

3. 分析テンプレートを設定します。

  1. デュアル測定機能単色マイクロ プレート リーダーの試金プロシージャを設定します。
  2. 読み取り手順を定義するには、「プロトコル」を選択します。「プロシージャ」をクリックします。
  3. 25 の ° C (図 1 a) に「温度」を設定。
  4. (図 1 a) 読み取り条件を設定する「運動を開始」をクリックします。時間と読み取り間隔/実験の数を設定します。
  5. クリックして「読み取り」(図 1 b)。
    注: サンプルは、トップの位置からリード 50 のゲインを持つ。時間: 5 分 30 の間隔で読みます。チャネル 1: ら蛍光の励起/蛍光 = 565 nm:600 nm、波長幅 13.5 nm。チャネル 2: NADH 蛍光の励起/蛍光 = 376 nm:450 nm、波長幅 20 nm。
  6. 「読み取り」、[モニター (例えば、A1 A4、B1 B4) に井戸を選択します。
  7. 「キネティック ・ エンド」を選択します。

4. 標準曲線

  1. 試薬を解凍し、必要になるまで氷の上を格納します。
  2. NADH 標準曲線 (図 2 a)
    1. NADH の反応バッファーに 0.5 ~ 10 mM の濃度範囲で作業ソリューションを準備します。
    2. 井戸 180 μ L 反応バッファーを含む溶液濃度を作業ごとの NADH から 20 μ 因数を追加します。それぞれ NADH の最終濃度じゃ 0.05 1 mM。
    3. 「読む」をクリックし、、励起/蛍光を設定 = 376 nm:450 nm、波長幅 20 nm。
      注: これは読み取り専用エンドポイント - 速度論的パラメーターは必要ではありません。
  3. AUR 標準曲線 (図 2 b)
    1. 反応バッファーにおける過酸化水素の株式を働いているを準備します。ストック濃度 200 4,000 nM の範囲です。
    2. 120 μ L の反応液を各ウェルに追加します。
    3. HRP の 20 μ L を追加 (ストック濃度を作業 = 30 U/mL、井戸に最終濃度 = 3 U/mL) 20、SOD の μ L (ストック濃度を作業 = 250 U/mL、井戸に最終濃度 = 25 U/mL) と AUR の 20 μ L (ストック濃度を作業 = 100 μ M、井戸に最終濃度 = 10 μ M) も含む各反応バッファーにします。
    4. 作業もバッファーとアッセイ試薬を含む各在庫ソリューション各 H2O2の 20 μ L を追加します。最終反応量が 200 μ L と H2O2各ウェル内の最終濃度は 20-400 nM。
    5. 25 ° C でプレート リーダーで 1 分版を孵化させなさい
    6. 「読む」をクリックし、、励起/蛍光を設定 = 565 nm/600 nm、波長幅 13.5 nm。これはエンドポイントは読み取り専用であることに注意してください - 速度論的パラメーターは必要ではありません。

5. O2● - /H2 O2リリースと KGDHC と PDHC NADH 生産の測定

  1. それぞれに追加して各作業ソリューションとボリュームの濃度別の試薬の付加の順序表 1を参照してくださいも。
  2. 各ウェルに 40 μ L の反応バッファーを追加します。KMV または CPI 613 を使用して試金、各ウェルにバッファーの 20 μ L を追加します。
  3. PDHC または KGDHC の 20 μ L を追加 (1 U/mL、ウェルあたり最終濃度の在庫 = 0.1 U/mL) 各ウェルに。
  4. 2 分の 25 ° C で PDHC と KGDHC を孵化させなさい。
  5. KMV の 20 μ L を追加 (在庫 = 100 mM、最終濃度 = 10 mM) または 20 μ L の消費者物価指数-613 (ストック濃度を作業 = 1.5 mM、最終濃度 150 μ M を =) (表 2)。
    注: 試金のための阻害剤が使用されていない場合は、このステップを除外できます。
  6. 25 ° C で 1 分間インキュベートします。
    注: 試金のための阻害剤が使用されていない場合は、このステップを除外できます。
  7. HRP の 20 μ L を追加 (ストック濃度を作業 = 30 台/mL、井戸に最終濃度 = 3 ユニット/mL) と SOD の 20 μ L (ストック濃度を作業 = 250 単位/mL、井戸に最終濃度 = 25 単位/mL) 各ウェルに。
  8. コエンザイム A の 20 μ L を追加 (ストック濃度を作業 = 最終濃度 1 mM = 0.1 mM)、20 TPP の μ L (ストック濃度を作業 = 3 mM、最終濃度 = 0.3 mM)、および NAD+の 20 μ L (ストック濃度を作業 = 10 mM、最終濃度 = 1 mM) 各 wエル。
  9. AUR 試薬を保護のアルミ箔カバーから外し、各ウェルに 20 μ L を追加します。
  10. ピルビン酸の 20 μ L を追加 (ストック濃度 1 〜 100 ミリメートル、試金のための最終的な集中に至る作業 = 0.1 ~ 10 mM) PDHC と α-ケトグルタル酸を含む井戸 (ストック濃度 1 〜 100 ミリメートル、試金のための最終的な集中に至る作業 = 0.1 ~ 10 mM) に井戸は、KGDHC を含みます。
  11. 「読む」運動の測定を開始するをクリックします。

6. データの分析

  1. キーボードの「CTRL」ボタンを押し、チャンネル 1 (図 3 a) に対応するすべての速度論的測定値を含む 1 つグラフを生成する井戸をクリックします。
  2. (図 3 b) 異なる時点で測定される相対的な蛍光ユニット (RFU) の生の値の右上隅で表示アイコンに「データ」をクリックします。
  3. 分析 (表 3) の値をエクスポートします。
  4. 2 蛍光チャネルに関連付けられた RFU の値にアクセスする「グラフ」ドロップ ダウン メニューの右上 (図 3 b) をクリックします。
  5. チャネル 2 の 6.1 に 6.3 の手順を繰り返します。

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結果

図 3 aは、H2O2と NADH 生産の同時測定の間に精製された KGDHC によって収集された RFU の代表的なトレースを提供します。RFU のデータ各時間間隔は、図 3Bで描かれています。RFU の生データは、分析のため、エクスポートされます。図 2に示した標準曲線から外挿により 5 分間測定間隔ごと...

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ディスカッション

このプロトコルは有利なので、1) 2 H2O2検出など、抗酸化システム (ROS の他の情報源)、妨げる可能性がありますそうでなければ任意の競合反応を排除) のネイティブ速度の直接評価ROS をフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素、3 によって解放) ネイティブを比較できます ROS リリース 2 つの率またはより精製脱フラビン ベース、4) ROS のリリースと酵素の活性や 5 の率の...

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開示事項

開示するものがあります。

謝辞

この作品は、自然な科学および工学研究審議会のカナダ (レベル) によって賄われていた。ビデオ制作は、教育と学習 (CITL) ニューファウンドランドの記念大学のイノベーション センターと共同で実施されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Pyruvate dehydrogenase complexSIGMAP7032-10UNpurified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complexSIGMAK1502-20UNpurified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solutionSIGMAHX0640-5reagent, standard curves
NAD+SIGMAN0632-1Greagent, activity/ROS release assay
NADHSIGMAN4505-100MGreagent, standard curves
pyruvateSIGMAP2256-5Greagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarateSIGMA75892-25Greagent, activity/ROS release assay
CoASHSIGMAC3019-25MGreagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphateSIGMAC8754-1Greagent, activity/ROS release assay
mannitolSIGMAM4125-100Gbuffer component
HepesSIGMAH3375-25Gbuffer component
sucroseSIGMAS7903-250Gbuffer component
EGTASIGMAE3889-10Gbuffer component
KMVSIGMA198978-5Greagent, ROS release inhibitor
CPI-613Santa Cruzsc-482709reagent, ROS release inhibitor
SODSIGMAS9697-15KUreagent, ROS release detection
horseradish peroxidaseSIGMAP8375-1KUreagent, ROS release detection
Amplex Ultra RedThermofisherA36006reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate readerBioTek Instrumentsmicroplate reader for assays
Gen5 softwareBioTek Instrumentssoftware, used for collection of raw RFU
Graphpad PrismGraphpad softwaresoftware, data analysis
Microsoft EXCELMicrosoftsoftware, data analysis

参考文献

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