JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המיטוכונדריה מכילה מספר אנזימים תלויי-פלווין שיכול לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS). ניטור ROS שחרור שאתרים בתוך המיטוכונדריה הוא מאתגר עקב תגובות לוואי לא רצויות. אנו מציגים שיטה קלה, זולה עבור הערכה ישירה של המחירים יליד לשחרור ROS באמצעות מטוהרים flavoenzymes ו- microplate fluorometry.

Abstract

בעבר דווח כי המיטוכונדריה יכול להכיל עד 12 מקורות אנזימטי של מינים חמצן תגובתי (ROS). רוב האתרים הללו כוללים מתחמי הנשימה פלווין תלוית dehydrogenases המייצרים תערובת של סופראוקסיד (O2● -) מי חמצן (H2O2). כימות מדויק של הפוטנציאל לייצור ROS אתרים בודדים המיטוכונדריה מבודד יכול להיות מאתגר בשל נוכחותם של מערכות הגנה נוגדת החמצון ותגובות בצד כי גם טופס O2●/H2O2. השימוש מעכבי ספציפי יכול לשבש ביואנרגיה מיטוכונדריאלי גם להתפשר מדידות על ידי שינוי ROS שחרור מאתרים אחרים של ייצור כאן, אנו מציגים שיטה קלה לשקילת סימולטני H2O2 שחרור וייצור nicotinamide אדנין dinucleotide (NADH) על ידי dehydrogenases מקושר פלווין מטוהרים. לענייננו כאן, השתמשנו מטוהרים פירובט דהידרוגנאז קומפלקס (PDHC) וα-ketoglutarate דהידרוגנאז מורכבים (KGDHC) ממוצא הלב חזירי כדוגמאות. שיטה זו מאפשר מדד מדויק של יליד H2O2 שחרור המחירים על ידי אתרים בודדים של הייצור על ידי ביטול מקורות פוטנציאליים אחרים של ROS ומערכות נוגד חמצון. בנוסף, שיטה זו מאפשרת השוואה ישירה של היחסים בין H2O2 שחרור, פעילות אנזים, ההקרנה של יעילות, סלקטיביות של מעכבי לייצור ROS. באופן כללי, גישה זו תוכל לאפשר להערכה מעמיק של שיעורי מקורית של ROS שחרור עבור אנזימים בודדים לפני ביצוע ניסויים מתוחכמים יותר עם המיטוכונדריה מבודד או סיבי השריר permeabilized.

Introduction

המטרה הסופית של חילוף החומרים התזונתיים היא להפוך אדנוזין טריפוספט (ATP). בתרבית של תאים, הדבר מתרחש בתוך המיטוכונדריה, organelles כפול-membraned להמיר את האנרגיה המאוחסן הפחמן לתוך ATP. הייצור של ATP מתחילה כאשר פחמן התלקחות על ידי המיטוכונדריה ויוצרים שתי נושאות אלקטרון, NADH ו פלווין אדנין dinucleotide (FADH2)1. NADH ו FADH2 הם ואז תחמוצת על-ידי יחידת משנה רב מתחמי הנשימה I ו- II, בהתאמה, האלקטרונים המשוחרר הם שנהגים של אלקטרון מסוף מקבל חמצן מולקולרי (O2)-IV מורכבים1. למה חיובית ". בירידה" העברת אלקטרונים O2 בסוף השרשרת הוא מצמידים הייצוא של הפרוטונים לתוך intermembrane החלל על ידי קומפלקסים, השלישי, הרביעי. זה יוצר הדרגתי אלקטרוכימי transmembrane של פרוטונים (הכוח המניע-פרוטון), צורה זמני של אנרגיה חופשית של גיבס כי הוא טפח מאת V מורכבים להרוויח ATP2. תגובות העברת אלקטרונים המיטוכונדריה הם לא לגמרי ביחד לייצור ATP. בנקודות שונות של מעגל קרבס, שרשרת הנשימה, האלקטרונים יכולים בטרם עת לקיים אינטראקציה עם O2 לטופס ROS3. האבחון הרלוונטיים ביותר מבחינה ביולוגית שנוצר על ידי המיטוכונדריה הם2O● - ו H2O2. למרות2O● - נחשב לעתים קרובות את האבחון proximal הנוצרת על-ידי המיטוכונדריה, זה עכשיו ברור כי אתרי ייצור טופס תערובת של2O● - ו H2O2, אשר מזוהה עם חופשי כימיה הרדיקלית של תותבת פלווין מקבץ4,5. ברמה גבוהה, ROS יכול להיות מסוכן, גרימת נזק ביולוגי המרכיבים הדרושים לתפקוד התא וכתוצאה מכך מצוקה חמצוני6. אולם, ב כמויות נמוכות, ROS מיטוכונדריאלי למלא תפקידים חיוניים איתות. למשל, H2O2 שחרור המיטוכונדריה היה מעורב השליטה הפעלה T-cell, מתח איתות (למשל, אינדוקציה של Nrf2 איתות המסלולים), את תנאי הגיוס של התפשטות תא ובידול, אינסולין איתות שחרור ו האכלה התנהגות7. התקדמות ניכרת נעשתה בהבנת הפונקציה איתות של ROS. עם זאת, חשוב שאלות נותרו עדיין לגבי אשר אנזימים בתוך המיטוכונדריה לשמש המקורות החשובים ביותר ונשלט איך הייצור.

ROS שחרורו על ידי אתר הייצור תלוי במספר גורמים: 1) את הריכוז של אלקטרון תרומת באתר, 2) מצב חמצון-חיזור של אתר תורם אלקטרון, 3) גישה חמצן, ו 4) ריכוז וסוג של חמצון המצע3, 8 , 9. בתוך המיטוכונדריה, גורמים אחרים כמו הריכוז של NADH וכוח פוטנציאל ממברנה משפיע גם ROS הייצור8,10. לדוגמה, הקצב של O2●/H2O2 ייצור מטוהרים PDHC או KGDHC עולה עם הגדלת NADH זמינות5,11. בתרחיש זה, האלקטרונים זורמים לאחור מ- NADH אל מרכז אופנה יחידת משנה3 E של PDHC או KGDHC, דרך האתר O2● /H2O2 הפקה-12. באופן דומה, הפרשה של NAD+ יש השפעה הפוכה, הפחתת שחרור ROS KGDHC12. לפיכך, השליטה כניסה או יציאה של אלקטרונים מאתרי הייצור ROS יכול לשנות כמה O2●/H2O2 נוצר. למשל, חוסם את E2 יחידת משנה של PDHC או KGDHC עם מדד המחירים לצרכן-613, חומצה ליפואית אנלוגי, תוצאות כמעט 90% הדירי O2●/H2O-2 -הייצור-13. ניתן להשיג תוצאות דומות עם הכימי S-glutathionylation זרזים, diamide disulfiram, אשר כמעט לבטל את O2●/H2O2 ייצור PDHC או KGDHC דרך הבניין של גלוטתיון אל ה-E 2 יחידה משנית14. החלופה לחסימת זרימת אלקטרונים דרך יחידת משנה2 E של PDHC, KGDHC היא ירידה בייצור NADH אשר פוחתת היווצרות ROS ולחוליגנים תחבורה אלקטרון (למשל, השלישי מורכב). זה יכול גם להקטין פלט ATP על ידי שרשרת האלקטרונים תחבורה. בסך הכל, החוסם את האלקטרונים הכניסה לאתרים של ROS הייצור יכול להיות אמצעי יעיל שליטה O2●/H2O2 ייצור.

המיטוכונדריה יכול להכיל עד 12 פוטנציאליים O2● /H2O2 מקורות-6. רוב האתרים הללו נמצאים פלווין המכילים אנזימים אשר יוצרים תערובת של2O● - ו H2O2. השימוש סובסטרט שונים ושילובים מעכב אפשרו לצורך זיהוי אשר מכלולי מערכת הנשימה, dehydrogenases מיטוכונדריאלי לשמש קיבולת גבוהה O2●/H2O2 הקמת אתרים ברקמות שונות3. PDHC, KGDHC הוכחו לשמש קיבולת גבוהה O2●/H2O2 אתרים פולטות שריר, כבד המיטוכונדריה13,15. עם זאת, קשיים מסוימים יישארו לגבי הבדיקה של O2● -/H2O2 ויוצרים פוטנציאל של אתרים בודדים בתוך המיטוכונדריה ואת ההשפעה שיש סובסטרט שונים ושילובים מעכב על הפעילות של האנזימים. זאת בשל נוכחותם של תופעות לוואי בלתי רצויות (למשל, היווצרות O2●/H2O2 אתרים מלבד האנזים עניין), מזהם מזינים אנדוגני (למשל,שומן חומצות) או organelles (למשל, peroxisomes אשר גם טופס O2●/H2O2), השימוש מעכבי חסרי סלקטיביות, ו/או השימוש של תרכובות המעכבות לא לחלוטין ייצור ROS. מעכבי מסוימים עשויה גם לשנות את ביואנרגיה מיטוכונדריאלי והכיוון של זרימת אלקטרונים, זה משתנה ROS שחרור מאתרים אחרים של ייצור, מבלבל תוצאות. המחירים מוחלטת עבור O2●/H2O2 שחרור מאתרי בודדים בתוך המיטוכונדריה הם גם קשה לכמת בשל הריכוז הגבוה של2O● - ו H2O2 ביטול אנזימים בחלל מטריקס ו- intermembrane. לכן, חיסול של כל תגובות מתחרים יכולים להפריע O2● -/H2O2 שחרור מדידות יכולה להיות שימושית בעת זיהוי קיבולת גבוהה O2●/H2O2 יוצרי האתרים.

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה המאפשרת לבחינת סימולטני O2●/H2O2 ייצור ויצירת NADH מאת dehydrogenases תלויי-פלווין מטוהרים. באמצעות אנזימים מטוהרים, ROS להרכיב את ריאקציות צדדיות ולא ROS משפילים אנזימים רצוי ניתן לסלק המאפשר מדד מדויק יותר של יליד O2● -/H2O2 קצב ייצור עבור flavoenzymes בודדים. בשיטה זו ניתן להשוות ישירות את O2●/H2O2 ויוצרים קיבולת שונה dehydrogenases מטוהרים או מעכבי בייעודי לאתר פוטנציאל מסך עבור O2●/H2O שחרור 2 . לבסוף, מדידת O2●/H2O2 וייצור NADH בו זמנית יכול לאפשר הערכה בזמן אמת של הקשר בין פעילות אנזים ROS שחרור קיבולת.

Protocol

1. כימיקלים ואנזימים מטוהרים

  1. להשיג את החומרים הבאים: PDHC ו- KGDHC של הלב חזירי מקור (או עוד flavoenzyme מיטוכונדריאלי מטוהרים); H2O2 (30% פתרון), פירובט, α-ketoglutarate, NAD+, NADH, CoASH, תיאמין רב-תכליתי (TPP), מניטול, HEPES, סוכרוז, EGTA, 3-מתיל-2-אוקסו valeric חומצה (KMV), סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), חזרת peroxidase (HRP), מגיב 10-אצטיל-3,7-dihydroxyphenoxazine (AUR), מדד המחירים לצרכן-613.

2. תכנון Assay והכנות ריאגנט

  1. להגדיר את הבדיקה על פי טבלה 1 בצלחת 96-ובכן.
    הערה: הנפח הכולל עבור כל תגובה היא 200 מניות ריכוזי µL. מותאמים כך µL 20 של ריאגנט מתווסף ל מכל קידוח. פעולה זו מבטיחה תוספת מהירה של cofactors ותערובות גידול על כל תגובה טוב לפני הפעלת וזמינותו.
  2. להכין את התגובה מאגר המכיל 220 מ מ מניטול, 70 מ"מ סוכרוז, 1 מ"מ EGTA, 20 מ מ HEPES (pH 7.4 עם HCl).
    הערה: זה יכול להשתנות בהתאם המאפיינים הפיזיים של אנזימים שונים מטוהרים.
  3. לבחון את KGDHC מטוהרים או PDHC עבור זיהום באמצעות אנזים פעילות מבחני14,16,17 או immunoblot או Coomassie כתם5.
  4. להכין את כל ריאגנטים במאגר התגובה לפי ריכוז פתרון עבודה בטבלה1.
  5. לאחסן כל ריאגנטים כמו aliquots 1 מ"ל ב-20 ° C. לאחסן פירובט וα-ketoglutarate ב-80 מעלות צלזיוס aliquots 100-µL כדי למנוע השפלה ספונטני עקב אוטומטי-חמצון, הקפאת חוזרות ונשנות-הפשרה.
  6. להכין הכימית AUR בסיס מניות של 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד, ואז לדלל 100 מיקרומטר במאגר התגובה. חנות מוגן מפני אור.
    הערה: כאן, הפתרון עובד 100 מיקרומטר הוא כל 2-3 שבועות וחוף מוגן מפני אור.

3. הגדרת התבנית Assay

  1. להגדיר את ההליך assay על קורא microplate השחור-לבן עם יכולות מדידה כפול.
  2. הגדר את שגרת הקריאה על-ידי בחירה "פרוטוקול". לאחר מכן לחצו "נוהל".
  3. הגדר "טמפרטורה" 25 ° C (איור 1 א').
  4. לחץ על "התחל קינטי" כדי להגדיר תנאים קריאה (איור 1 א'). הגדר את הזמן ואת המספר של מרווחי זמן קריאה/ניסויים.
  5. לחץ על "קרא" (איור 1B).
    הערה: דגימות הנקראות המיקום העליון עם רווח של 50. זמן: 5 דקות, קרא במרווחי זמן 30-s. ערוץ 1: Resorufin זריחה - עירור/פליטה = 565 nm:600 ננומטר, אורך גל רוחב 13.5 ננומטר. ערוץ 2: NADH autofluorescence - עירור/פליטה = 376 nm:450 ננומטר, אורך גל ברוחב של 20 ננומטר.
  6. תחת "קריאה", בחר ולס לצג (למשל, A1-A4 ו- B1-B4).
  7. בחר "סיום קינטי".

4. תקן ' עקומות '

  1. להפשיר את ריאגנטים ולאחסן על הקרח עד שהוא נדרש.
  2. NADH עיקול רגיל (איור 2 א)
    1. להכין את פתרונות העבודה NADH בטווח ריכוז של 0.5-10 מ"מ במאגר התגובה.
    2. הוסף 20 µL aliquots כל NADH עובד ריכוז פתרון בארות המכיל מאגר 180 של תגובה µL. הריכוז הסופי של NADH בכל אחד מהם הוא 0.05-1 מ מ.
    3. לחץ על "קרא" והגדר עירור/פליטה = 376 nm:450 ננומטר, אורך גל ברוחב של 20 ננומטר.
      הערה: זהו נקודת קצה לקריאה בלבד - קינטי פרמטרים אינם נדרשים.
  3. עיקול רגיל AUR (איור 2B)
    1. להכין את המניות עבודה של מימן על-חמצני במאגר התגובה; טווח הריכוזים מניות מ-4,000 200 ננומטר.
    2. להוסיף 120 µL של המאגר התגובה כל טוב.
    3. להוסיף 20 µL של HRP (עובד ריכוז מניות = 30 U/mL, הריכוז הסופי בבאר = 3 U/mL), 20 µL של SOD (עובד ריכוז מניות = 250 U/mL, הריכוז הסופי בבאר = 25 U/mL), ו- µL 20 של AUR (עובד ריכוז מניות = 100 מיקרומטר הריכוז הסופי בבאר = 10 מיקרומטר) למאגר טוב המכיל כל תגובה.
    4. הוסף 20 µL של כל2O H2 עובד פתרון מלאי כל טוב המכיל נוגדנים מאגר ואת וזמינותו. 200 µL שאמצעי האחסון התגובה האחרונה והוא הריכוז הסופי של H2O2 היטב כל 20-400 nM.
    5. דגירה הלוחות עבור 1 דקות בקורא צלחת ב 25 º C.
    6. לחץ על "קרא" והגדר עירור/פליטה = 565 nm/600 ננומטר, אורך גל רוחב 13.5 ננומטר. שימו לב כי זוהי נקודת קצה לקריאה בלבד - קינטי פרמטרים אינם נדרשים.

5. מדידת O2● /H2 O2 שחרור וייצור NADH KGDHC, PDHC

  1. ראה טבלה 1 עבור הסדר של תוספת של נוגדנים שונים, הריכוז של כל הפתרון עובד, ונפח הוסיף לכל טוב.
  2. להוסיף 40 µL התגובה מאגר כל טוב. עבור מבחני באמצעות KMV או מדד המחירים לצרכן-613, להוסיף 20 µL מאגר כל טוב.
  3. הוסף 20 µL של PDHC או KGDHC (מלאי עבודה של 1 U/mL, הריכוז הסופי לכל טוב = 0.1 U/mL) כדי מכל קידוח.
  4. דגירה PDHC ו- KGDHC ב- 25 ° C למשך 2 דקות.
  5. להוסיף 20 µL של KMV (מלאי עבודה = 100 מ מ, ריכוז סופי = 10 מ מ) או 20 µL של מדד המחירים לצרכן-613 (עובד ריכוז מניות = 1.5 מ מ, ריכוז סופי = 150 מיקרומטר) (טבלה 2).
    הערה: שלב זה יכול להיות לא נכלל אם מעכבי שאינם בשימוש עבור מבחני.
  6. תקופת דגירה של 1 דקות ב- 25 ° C.
    הערה: שלב זה יכול להיות לא נכלל אם מעכבי שאינם בשימוש עבור מבחני.
  7. להוסיף 20 µL של HRP (עובד ריכוז מניות = 30 יחידות/mL, הריכוז הסופי בבאר = 3 יחידות/mL) ו- µL 20 מקומות (עובד ריכוז מניות = 250 יחידות/mL, הריכוז הסופי בבאר = 25 יחידות/mL) כדי מכל קידוח.
  8. להוסיף 20 µL של קואנזים A (עובד ריכוז מניות = 1 מ"מ, הריכוז הסופי = 0.1 מ מ), 20 µL של TPP (עובד ריכוז מניות = 3 מ מ, הריכוז הסופי = 0.3 מ מ), ו- µL 20 של NAD+ (עובד ריכוז מניות = 10 מ"מ, הריכוז הסופי = 1 מ מ) על כל w פר.
  9. הסר הכימית AUR כיסוי מגן אלומיניום ולהוסיף 20 µL כל טוב.
  10. להוסיף 20 µL של פירובט (עובד ריכוז מניות הנע בין 1 ל- 100 מ מ, הריכוז הסופי עבור מבחני = 0.1-10 מ מ) כדי בארות המכיל PDHC וα-ketoglutarate (עובד ריכוז מניות הנע בין 1 ל- 100 מ מ, הריכוז הסופי עבור מבחני = 0.1-10 מ מ) כדי וולס המכיל KGDHC.
  11. לחץ על "קרא" כדי להתחיל את המדידה קינטי.

6. ניתוח נתונים

  1. החזק את לחצן CTRL' בלוח המקשים ' ולחץ על ' בארות כדי ליצור גרף אחד המכיל את כל המדידות קינטי המתאים ערוץ 1 (איור 3 א) '.
  2. לחץ על "נתונים" בסמל תצוגה בפינה הימנית העליונה עבור ערכים גולמיים עבור יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי (RFU) נמדד בנקודות זמן שונות (איור 3B).
  3. לייצא את הערכים עבור ניתוח (טבלה 3).
  4. לחץ על התפריט על הימנית העליונה (איור 3B) הנפתח "גרף" כדי לגשת RFU ערכים המשויכים פלורסצנטיות ערוץ 2.
  5. חזור על שלבים 6.1-6.3 בערוץ 2.

תוצאות

איור 3A מספק מעקב נציג RFU שנאספו במהלך המדידה בו זמנית של2O H2 ו- NADH הייצור על ידי מטוהרים KGDHC. הנתונים הגולמיים RFU עבור כל מרווח זמן מצטיירת דמות 3B. הנתונים הגולמיים RFU מיוצאים ואז לניתוח. מאת והגדלתי רגיל עקומות המוצג בא?...

Discussion

פרוטוקול זה יש יתרון מאז, 1) היא מבטלת כל התגובות מתחרות שעשויים אחרת להפריע H2O2 זיהוי (למשל, מערכות נוגדי חמצון או מקורות אחרים של ROS), 2) מספק הערכה ישירה של קצב מקורי ROS לשחרר על-ידי המכילות פלווין מיטוכונדריאלי דהידרוגנאז, 3) מאפשר את ההשוואה של הילידים ROS לשחרר את המחירים של ?...

Disclosures

. אין מה לגלות.

Acknowledgements

עבודה זו מומן על ידי מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC). הפקת וידאו בוצע בשיתוף פעולה עם המרכז לחדשנות למידה (CITL)-אנדרטת והגבלות והוראה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Pyruvate dehydrogenase complexSIGMAP7032-10UNpurified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complexSIGMAK1502-20UNpurified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solutionSIGMAHX0640-5reagent, standard curves
NAD+SIGMAN0632-1Greagent, activity/ROS release assay
NADHSIGMAN4505-100MGreagent, standard curves
pyruvateSIGMAP2256-5Greagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarateSIGMA75892-25Greagent, activity/ROS release assay
CoASHSIGMAC3019-25MGreagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphateSIGMAC8754-1Greagent, activity/ROS release assay
mannitolSIGMAM4125-100Gbuffer component
HepesSIGMAH3375-25Gbuffer component
sucroseSIGMAS7903-250Gbuffer component
EGTASIGMAE3889-10Gbuffer component
KMVSIGMA198978-5Greagent, ROS release inhibitor
CPI-613Santa Cruzsc-482709reagent, ROS release inhibitor
SODSIGMAS9697-15KUreagent, ROS release detection
horseradish peroxidaseSIGMAP8375-1KUreagent, ROS release detection
Amplex Ultra RedThermofisherA36006reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate readerBioTek Instrumentsmicroplate reader for assays
Gen5 softwareBioTek Instrumentssoftware, used for collection of raw RFU
Graphpad PrismGraphpad softwaresoftware, data analysis
Microsoft EXCELMicrosoftsoftware, data analysis

References

  1. Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
  2. Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
  3. Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
  4. Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
  5. Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
  6. Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
  7. Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
  8. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
  9. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
  10. Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
  11. Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
  12. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
  13. Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
  14. O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
  15. Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
  16. Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
  17. Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
  18. Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
  19. Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
  20. Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
  21. Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
  22. Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
  23. Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132NADHdehydrogenasesketoglutaratemicroplate fluorometry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved