美国锥虫从男性和女性到天真的命运的性传播

摘要

恰加斯病的锥虫瘤壳体产生长期的无症状感染, 突然发展成为临床公认的病理。下面的研究协议描述了一项以家庭为基础的短期流行病学研究, 以揭示从父母到后代性传播的t. cruzi感染。

摘要

美国锥虫病是通过摄入受污染的食物、输血或在医院和研究实验室意外传播给人类的。此外, 克鲁兹锥虫病感染是由长崎母亲自然传播给后代的, 但男性伴侣在子宫污染方面的贡献尚不清楚。在卵巢的细胞、性腺和精原管腔内发现的阿玛菌和色母细胞的巢穴和团块表明, t .克鲁兹感染是性传播的。本文的研究方案介绍了一个家庭研究群体的结果, 该群体在人体二倍体血单个核细胞和单倍体配子中显示了寄生虫核 dna。因此, 时隔一年收集的三个独立生物样本证实, t. cruzi感染是通过性传播到后代的。有趣的是, 大多数对寄生虫抗原具有免疫耐受能力的家族后代中都存在特异性 t. cruzi 抗体。在胚胎生长的第一周后, 鸡的难熔对t. cruzi 的免疫耐受性得到了证实, 而从鞭毛接种的卵中孵化出来的小鸡则不能产生特定的抗体。此外, 人精液射精射精射精腹腔内或阴道中的天真小鼠产生 t. cruzi amastigotes 在附属物, 精原体小管, 输精管和子宫管没有炎症 反应在免疫特权器官再生产。受 t. cruzi感染的雄性和雌性老鼠与天真的配偶的繁殖导致了感染的获取, 这些感染后来被传播到后代身上。因此, 有民众和社会组织参与的强有力的教育、信息和通信方案被认为是预防查加斯病的必要条件。

引言

原生动物寄生虫三叶草属植物在哺乳动物寄主中经历了锥虫和三甲草的生命周期阶段, 并作为异位体存在于昆虫媒介的肠道和无菌培养。近几十年来, 几项研究表明, 在被认为三胺素无菌的四大洲国家, 有查加斯病的存在, 有 1^{、2、3、4、5} ,^{6,7.,8,9,10,11,12,13};美国锥虫体的分散最初归因于拉丁美洲移民到北半球, 但有些是本土的恰加斯病的可能性不能再被否认 3^{,4,5,6,7.,8,9,10,11,12,13,14}. 唯一可识别的内源 t. cruzi传播的原因是, 在大约10% 的怀孕中, 长崎母亲将寄生虫转移到后代身上,¹⁵男性伴侣对精液射精在子宫内感染的贡献仍未得到承认。

一个多世纪前, 研究人员^在卵巢的卵细胞和急性恰加斯病患者睾丸的生殖细胞中观察到细胞内的 t . cruzi。在致命急性恰加斯病病例的卵巢癌细胞、性腺和精原管腔 (图 1) 中, t. cruzi 色样体和阿玛菌的巢穴和团块在卵巢的器官中产生免疫特权。繁殖在没有炎症渗透 18^,19。近几十年来, 一些实验研究表明, 在急性感染 ^{小鼠的精子管、附属物、输便于和子宫、管和卵巢细胞中, 出现了圆形的 "1,20,21,22}。此外, 在记录父母查加斯患者原生动物线粒体 dna 转移到后代的家庭研究过程中, t. cruzi核 dna (ndna) 在人类单倍体生殖细胞²³中得到了验证,在马达加斯加小鼠24的射精中观察到寄生虫的生命周期阶段.这些发现与关于受 t . cruzi-感染的宿主在没有特定抗体^1、25、26的情况下获得免疫耐受的报告一致。此外, 表明恰加斯病流行向其他大陆蔓延的流行病^{报告3、4、5、}6^{、7、8 9、10、11、12、13现在得到}实验研究的支持, 这些实验研究表明, 恰加斯病可以通过^{性行为传播}.本研究提出了一个流行病学的家庭研究程序 , 并表明t . cruzi感染是通过传播的。

研究方案

巴西利亚大学医学院人类和动物研究委员会分别在 2011年2500.167567 和 1041111/研究议定书中批准了与人体和实验动物有关的所有程序。公共基金会医院 gaspar vianna (2009年和 conep 1116ne2009 号议定书) 的道德委员会批准了实地研究的自由同意书, 并扩大到卫生部国家人类研究委员会 (conep 2585/04)。对该程序进行了调整, 以评估二倍体血液单个核细胞和精液单倍体配子中的t. cruzi dna 。实验动物得到了人道的照顾;老鼠, 在牺牲前接受心脏穿刺, 在麻醉下。

1. 招募人的参与者

1. 确保研究小组参与卫生系统查加斯疾病计划, 为查加斯患者提供保健服务。
2. 从参加该计划的家庭招募人参与者, 显示至少有一例发烧、不适、头痛、心动过速和水肿, 是急性恰加斯病的主要临床症状^14.
3. 为研究家庭的人提供为期五年的医疗服务。
4. 每隔一年从研究参与者处三次获得15毫升的静脉血液, 将样本分成三个5毫升的等价物, 并将其存放在4°c 的冰箱中。
5. 收集2毫升的精液从成人志愿者家庭成员射精, 并按照步骤3.3 中所述进行。

2. 寄生虫的生长

1. 使用步骤1.4 中的脂肪, 将血液与5个单位的抗凝血肝素钠混合;通过接种家庭参与者的血液进行坡度培养, 诊断急性恰加斯病。
   1. 将未凝血的5毫升注射到50毫升的螺帽管中, 再加上5毫升的肝脏注入色氨酸培养基 (lit), 并在27°c 的振动台中孵育样品3个月。
   2. 每四周将上清液培养基的100μl 放在玻璃幻灯片上, 用滑块覆盖, 并在显微镜下寻找血液t. cruzi上黄体。
   3. 在27°c 时在无菌 lit 培养基上清液中采集上清体;在 pbs ph 7.4 中清洗细胞, 离心机在 1, 000 x克下清洗 10分钟;在5毫升的杜尔贝科改性必需介质 (dmem) 中稀释颗粒中的 episimallgte。
   4. 接种融合的 l6 肌肉细胞培养瓶与 1 x¹⁰ 6 eci1 至 eci21 t. cruzi epastigote 分离株.
   5. 在75毫升培养瓶中, l6 肌肉细胞培养中生长 t . cruzi eci1 至 eci21 和贝伦ice 原型色板。
   6. ph 7.4 下 dmem 15 毫升的饲料细胞补充了5% 的胎牛血清、100种 iuml 青霉素、100μgml 链霉素、250 nm l-谷氨酰胺和 37°c 1 时5% 的 co2.
   7. 如步骤5.2 所述,使用阳性对照 t. cruzi berenice 色眼类动物对从组织培养中分离出的 ei1 至至至至至至 eci21 的表型。
   8. 在 dmem 中增加阴性对照, 仅补充20% 的胎儿牛血清,并以寄生虫促进者为阴性对照。
   9. 在细胞培养的上清液中使用 1 x10-克鲁齐eci1 至 eci21 色原体感染小鼠。 
   10. 在感染的第一周后, 在尾血中寻找t. cruzi 色样体。
   11. 在受感染小鼠的心脏、骨骼肌和生殖器官的血红素染色部分中, 搜索血丝素染色部分的阿玛菌巢穴。

3. dna 提取和 pcr 分析

1. 将血液中的5毫升 (步骤 1.4) 放在无菌 edta 管中, 并在 3, 000 x g处进行45分钟的密度梯度离心。使用移液器从红细胞上方的白色相中采集单个核细胞, 在 pbs 5 毫升中两次清洗白色细胞, ph 7.4, 在不同的15毫升管中离心 10分钟, 1, 500 x克,并使用这些细胞进行 dna 提取。
2. 从 eci-1 提取到 eci-21 t .cruzi, 从阳性对照 berenice t.cruzi, 从阴性对照l. braziliensis (步骤 2.1.8), 以及从109个人类家庭研究对象的血单个核细胞^测试1^,27,28岁
3. 稀释 dmem (1: 4, v2) 中步骤1.5 中获得的精子样本的2毫升;在 5% co 2 和37°c 孵育 45分钟, 在 13, 000 x g 离心5分钟后从上清液中回收精子, 并提取单倍体^{dna 23}.
4. 将1毫升的细胞放入萃取缓冲液中 (10μm 氯化钠、20μm edta、1% sds、0.04% 蛋白酶-k 和1% 二硫醇), 并通过倒置和晃动混合溶液。
   1. 在 13, 000x g和25°c 的温度下将溶液离心 10分钟, 并将粘性上清液转移到自旋柱上。
   2. 以 10, 000 x g的速度离心旋转柱 1分钟, 并丢弃洗脱液;在自旋柱 (材料表) 中加入500μl 结合缓冲液, 以 12, 000 x 克的速度离心 1分钟, 并丢弃洗脱液。
   3. 在旋转柱中加入600μl 洗涤缓冲液, 以 12, 000 x 克的速度离心 1分钟, 并丢弃洗脱液。
   4. 重复此步骤两次, 并将自旋柱转移到无菌 1.5 ml 微型离心管。
   5. 加入 100μl te 缓冲液, 在室温下孵育管 2分钟, 然后在 12, 000 x g处离心管1分钟。微离心管中的缓冲液包含 dna。
   6. 通过在0.8% 琼脂糖凝胶上运行等价物和用分光光度计读取260纳米的吸收率来测量 dna 浓度。将 dna 样本储存在-20°c, 直到在 pcr 分析中使用。
5. 使用t. cruzi Tcz1/2 退火到特定的188-nt 特粒序列探针²⁹ , 并运行 pcr 与 dna 从家庭研究对象的血液和精子, 从 berenice t. cruzi 阳性对照和从l. braziliensis阴性对照。
   1. 用10μn 模板 dna、每一对引物0.4 微米、taq dna 聚合酶 2 u、0.2μm dntp 和 15μm mgcl₂以25μl 最终体积制备 pcr 混合物。
   2. 在94°c 下启动 dna 扩增程序 30秒, 使模板变变性, 并将样品冷却到 55°c 30秒。然后, 在94°c 下孵育样品 90度, 以延长退火引物。将温度恢复到 94°c, 30秒, 启动下一个周期, 并在72°c 下再孵育样品3分钟。在32循环结束时 , 在室温下冷却样品 10分钟, 并在4°c 至^29点将样品存放在冰箱中。
   3. 在两个肢体上将t. cruzi dna 端粒重复序列扩增到 tcz半引物上。
   4. 分析1.3% 琼脂糖凝胶上的扩增产物, 观察紫外线照明器上 188-nt dna 带。

4.南方杂交

注:南方杂交被用来丢弃琼脂糖凝胶中的大多数假阳性 pcr 放大器。

1. 研究 pcr 扩增产物, 从未感染的对照, 从查加斯病例阳性对照, 从109个二倍体 dna 测试样本和单倍体 dna 的21个研究家庭参与者到南方杂交。
2. 采用t. cruzi 188-nt dna 特异性端粒序列探针退火到所显示的 tcz半引物;用 [α-32p] 2'-脱氧腺苷三磷酸酯 (datp) 使用随机引物标记试剂盒标记探针, 并在4°c 过夜时, 在 60 v 时分析1.3% 琼脂糖凝胶上的扩增产物。
3. 使用毛细管法将凝胶转移到带正电荷的尼龙膜过夜。
4. 用放射性标记188nt 探针杂交转移到尼龙膜的 dna 带, 该探针将基因组 dna 的ecor1 消化结合在酶特异性缓冲液的25μl 中, 在可变时期内。
5. 用 2x ssc 和 0.1% sds 在65°c 下清洗膜两次, 时间为15分钟。
6. 将 x 射线胶片暴露在尼龙膜上, 并对膜上的带进行一个星期的签名。
7. 与t. cruzi pcr 扩增产物共同培养从 pcr 和南方杂交中选择的克隆体, 并与特定的放射性标记 dna 探针杂交。
8. 商业测序克隆使用 tcz半引物设置退火 t . cruzi-特定端粒足迹^2,23。

5. 免疫学检测

注: 在6例查加斯明显寄生虫血症患者的血清中, 对间接免疫荧光 (iif) 和酶联免疫吸附法 (elisa) 的敏感性和特异性进行了评估。银行样本。用 ph 7.4 ppbs 中的双血清稀释剂进行的检测显示, iif 在1:100 稀释时和 elisa 光学密度 (od) 在0.150 及以上时, 将阳性与阴性结果分离。

1. 使用5毫升的未凝血物 (步骤 1.4) 保持在室温下 1小时, 并在 1, 500 x克离心 30分钟, 以分离上清液中的血清。
2. 进行 iif 和 elisa 三文三文三文三文多的血清稀释剂, 以检测 t . cruzi 和l. braziliensis抗原, 如前^所述28.
3. Iif
   1. 对109个研究对象的样本进行综合投资框架检测, 每间隔一年三次获得。
   2. 将福尔沙林的5μl 悬浮液, 用1% 处理的t. cruzi epastigotes 或l. braziliensis放在玻璃滑梯上;让寄生虫在室温下在引擎盖里过夜, 并将玻璃滑梯存放在-20°c, 直到使用。
   3. 将患者血清稀释液放入涂覆5μl 的玻璃滑块上, 涂有5μl 的福尔沙林 (10 种寄生虫-μl) t. cruzi epimastigotes 或l. braziliensis prom白皮书。
   4. 在37°c 的潮湿室内用滑块将玻璃滑块孵化 1小时, 并用 pbs 三次清洗。
   5. 在37°c 条件下, 用1:1000 稀释荧光素标记的兔抗体 (材料表) 将风干玻璃滑块体体体体对人体 igg 进行1小时的稀释;清洗和擦干滑梯。
   6. 用盖板滑块安装幻灯片, 并在紫外线显微镜下进行检查。
      注: 考试呈阳性的是照片绿色 t. cruzi epastigote 的剪影, 显示在视频中。
4. Elisa
   1. 运行 elisa 检测涂层微板井上的t. cruzi 和巴西可溶性抗原 (0.1 m 碳酸盐缓冲液中的 1μg/100μl, ph 9.6)。
   2. 在室温下将 1: 100 层涂布井中的血清稀释剂培养2小时。
   3. 干燥前, 用 pbst (含有 0.5% tween-20 的 pbs)、ph 7.4、溶液将板材洗三次。
   4. 在37°c 条件下, 用 1:1-1000 稀释兔抗人 igg 抗体50μl 对板材进行90分钟的研版。
   5. 用 pbst 溶液将板材洗三次, 并使其在室温下干燥。
   6. 在37°c 条件下, 用100μl 的1:1000 稀释碱性磷酸酶共轭山羊抗兔 igg (材料表) 90分钟。
   7. 用 pbst 三次清洗板材, 加入基材对硝基磷酸苯酯, 等待颜色的发展。
   8. 在多模板读取器中读取 630 nm 的 od。
   9. 运行研究人群中检测血清的三分一次稀释, 绘制 od, 以确定特异性 t. cruzi 抗体滴度。

6. 免疫耐受评估

注: 在胚胎发育的第一周后, 采用鸡模型系统对t. cruzi感染进行检测。

1. 用从组织培养基中提取的100微米-l. cruzi 色原体接种鸡的繁殖卵;每μl 培养基用 10 t. cruzi 色形动物接种模拟控制蛋。用胶带封住这个洞。
2. 在37°c 和65% 的湿度下孵育20个受克鲁基感染的鸡蛋和同等数量的模拟控制生育期鸡蛋21天。
3. 将在孵化器中孵化的雏鸡保持 24小时, 然后在32°c 的情况下, 在温度控制下的头套中保持三周。
4. 在24°c 的正气压室中, 在单独的笼子里, 从 t. 壳接种的卵和模拟控制卵中孵化出的小鸡进入成人阶段。
5. 挑战所有的成年小鸡三次在6个月大与 10 7 福尔沙林杀死色样体注射皮下注射, 每周, 根据方案在视频中.
6. 在最后一次免疫接种四周后, 从接种 t.壳的卵和模拟控制中提取鸡的翅膀静脉中的血液, 以获得血清。
7. 如协议第5步所述, 用 iif 和 elisa 检测鸡血清的特异性 t. cruzi 抗体。

7. 查加斯患者精液射精小鼠 t . cruzi 感染

1. 使用成人 pcr + 查加斯病患者 (步骤 1.5) 和成人 pcr-茶长崎无个体的精液射精。
2. 使用两组12个月大的 balb1 天真的小鼠在24°c 的正气压下保持在头套中, 并喂养食物和脂肪.
3. 将人的 chagac 阳性精液精华 (100μl) 注入腹膜, 并将等量输入 a 组小鼠的阴道。
4. 将对照组无切渣精液的精液 (100μl) 注入腹膜, 并将等量的量输入团体 b 小鼠的阴道。
5. 在精液注入并使组织切片用血红素-eosin 染色5周后, 在麻醉下牺牲实验小鼠。
6. 用显微镜观察小鼠组心脏、骨骼肌和生殖器官中的t. cruzi色样体和血清素体。

8 . 通过 传播 t . cruzi感染

1. 在实验中使用10只男性和女性6周大的 balb1 小鼠。
2. 用 1 x 10 5 t. cruzi 色氨酸从组织培养中取出 5只雄性和雌性小鼠腹腔内的菌核。 
3. 培育小鼠至3个月大: 第一组将由5只受 t. cruzi感染的雌性小鼠和5只对照的未感染雄性配偶组成;第二组将由 5名受 t. 克鲁兹感染的雄性和5名对照的未感染雌性配偶组成。第三组将由5名男性和5名女性控制的天真的未感染伴侣组成。
4. 将每对繁殖组合放在一个笼子里, 放在一个保险箱里, 里面有一个5毫米的网格和锁门, 以防止逃跑。
5. 喂老鼠吃东西, 给它浇水。在第二和 i 组中, 总共培养70个断奶后代, 时间至少为6周。
6. 在麻醉下, 用心脏穿刺从亲本 (fo) 和后代 (f1) 小鼠身上抽血, 牺牲小鼠, 并提交心脏、骨骼肌和生殖器官的部分进行病理分析。

9. 免疫特权评估

1. 从t. cruzi感染和天真的对照小鼠 (步骤 8.6) 中获取组织, 并将石蜡嵌入的样品切割成4微米厚的部分。
2. 取出石蜡, 用几块二甲苯的变化将部分脱水到玻璃滑梯上, 并用100% 至70% 乙醇分级清洗, 每次1分钟。
3. 用0.05% 的皂甙对组织切片进行一次培养, 然后在室温下进行三次蒸馏水清洗。
4. 用5% 脱脂奶粉阻断组织切片 45分钟, 用 0.1 m pbst 清洗切片, 用查加斯小鼠抗t. cruzi 血清或与对照组对照的未感染小鼠血清在 1:20 稀释2小时时孵育切片。
5. 用1:1000 稀释碱性磷脂结合兔抗小鼠 igg, 在 pbst 下三次清洗幻灯片, 在室温下干燥。
6. 在 pbst 中冲洗幻灯片, 加入100μl 的 3, 3 ' 二胺苯并在5分钟的孵育中, 然后用 pbst 冲洗 3次, 用哈里斯血红素进行30分钟的反染色。
7. 将幻灯片在蒸馏水中清洗 5分钟, 在70%、80%、90% 和100% 乙醇中脱水 1分钟, 然后将其安装在缓冲甘油中。
8. 使用明亮的光显微镜检查幻灯片, 并使用带有软件和分析仪程序的微型摄像机拍摄照片图像。
9. 记录在生殖器官没有炎症反应的情况下寄生虫的免疫特权。

10. 统计分析

1. 使用生物医学编辑进行序列分析, 使用 blast 进行对齐, 并确定 e 值统计意义 (p < 0.05)。
2. 执行方差单向分析 (anova) 和 tukey 测试, 以比较 od 均值正负标准偏差。

结果

这项根据协议进行的研究, 旨在通过临床和寄生虫学检查检测急性恰加斯病病例。对静脉血液样本进行了直接显微镜检查和体外培养, 以促进寄生虫的生长。21例急性恰加斯病在血液中显示t. 克鲁齐。研究协议确保了 t. cruzi eci1-至 eci21 与急性恰加斯病的分离, dna 样本在其余研究人群中显示出阳性 dna 足迹: dna-pcr 检测产生了典型的端粒重复序列与188nt 乐队存在, ?...

讨论

在此, 我们讨论了一个基于家庭的研究协议, 该协议回答了人类恰加斯病是否源于性传播种内感染的问题。早期的研究无法提供t. cruzi感染的性传播证据, 可能是因为关于查加斯病的现有数据和信息是与个人^{3,4分开获得的, 5,6,7,8, 9,}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCIP and NBT redox system	Sigma-Aldrich	681 451 001
Blood DNA Purification columns	Amersham Biosciences	27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.	Perkin Elmer	BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm	AMRESCO	064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions	GE Healthcare	28-4065-51
Eco RI	Invitrogen	15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated	Southern Biotech	2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated	Biocompare	MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane	GE Healthcare	RPN303B
Hybridization oven	Thomas Scientific	95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software	Olympus, Japan
Molecular probes labeling System	Invitrogen	700-0030
Nsi I	Sigma-Aldrich	R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit	GE Healthcare	28-9042-70
Plate reader	Bio-Tek GmBH	2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated	Sigma-Aldrich	A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated	Sigma-Aldrich	F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated	Sigma Aldrich	A2418
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated	Biorad	MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine	Sigma-Aldrich	G25DNA-RO
Taq DNA Polymerase Recombinant	Invitrogen	11615-010
Thermal cycler system	Biorad, USA	1709703
Vector Systems	Promega	A1380