男性と女性からのナイーブの仲間にアメリカトリパノソーマの性行

要約

シャーガス病のcruziエージェントには、長期的な無症候性感染症臨床的に認められた病理に突然発展するが生成されます。次の研究プロトコルでは、親から子孫に性的送信T. クルーズトリパノソーマ感染症を解明する短期家族ベース疫学的研究について説明します。

要約

アメリカのトリパノソーマ症は、輸血や病院や研究所では誤って汚染された食物の摂取を介してサシガメによって人間に送信されます。加えて、クルーズトリパノソーマ感染は先天性 chagasic 母から彼女の子孫に、男性パートナーの貢献子宮内で汚染が知られています。巣と amastigotes と trypomastigotes、卵巣の卵胞膜細胞、goniablasts と精細管の内腔の塊の示唆されたt. 原因感染症、性感.ここに研究のプロトコルは、二倍体血単核細胞およびヒトの半数体の配偶子に寄生虫核 DNA を示す家族調査の人口の結果を示します。したがって、収集 1 年離れて 3 つの独立した生体試料は、 t. の原因の感染症が子孫に性感を確認しました。特定の興味深いことに、 t. の原因抗体が欠席した寄生虫抗原に対する免疫寛容を退屈させる家族の子孫の大半で。胚の成長の最初の週後鶏t. の原因に難治性の免疫寛容を示したし、鞭毛を接種した卵から孵化した雛は特定の抗体を生産することができませんでした。また、人間の精液の注入射精腹腔内や精巣上体、精細管、精管欠損症の炎症子宮管のt. の原因amastigotes が得られた素朴なマウスの膣に再現の免疫特権臓器の反応。T. の原因の繁殖-子孫に転送された後で感染症の取得で起因した素朴な仲間と感染した男性と女性のマウス。したがって、人口や社会団体を含む堅牢な教育、情報、コミュニケーション プログラムはシャーガス病を防ぐために必要と認められます。

概要

Trypanosomatidae 哺乳類のホストで trypomastigote と amastigote のライフ サイクル段階を経るし、昆虫ベクトルで epimastigotes として存在するファミリーに属する原虫クルーズトリパノソーマ(サシガメ: クロタマゴバチ) 腸の培養。ここ数十年、いくつかの研究は triatomine バグ無料^1,2,3,4,5,を考慮する 4 つの大陸の国でシャーガス病の存在を示しています。^{6,7,8,9,10,11,12,13};アメリカトリパノソーマの分散が、北半球へのラテン アメリカの移民に起因した最初がシャーガス病の土着の場合がある可能性を拒否できなくできる^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14}. t. 原因伝送のみ認識可能な内因性ソースは chagasic 母親の妊娠¹⁵; の約 10% で子孫に伝寄生虫に帰されています男性パートナーの貢献精液射精を子宮内で感染症が埋もれていた。

1 世紀以上前、捜査官^16,17観察細胞内のt. の原因卵巣の卵胞膜細胞および胚の amastigotes ライン シャーガス病の場合は急性の精巣の細胞。巣およびt. の原因trypomastigotes と amastigotes、卵巣の卵胞膜細胞、goniablasts および致命的な急性シャーガス病例の精細管 (図 1) の内腔の群生の臓器の免疫特権を開発します。炎症のない状態で再現、肺浸潤^18,19.最近十年間にいくつかの実験的研究示されているt. の原因のラウンド amastigote 形態の巣、精細管、精巣上体、精管も子宮、チューブおよび卵巣のように鋭く感染マウス^{莢膜細胞1,,2021,22}。さらに、彼らの子孫、 t. の原因核 DNA (nDNA) に親シャーガス患者からミトコンドリア DNA を人間の半数体生殖線細胞²³、検証した原生動物の譲渡を文書化する研究の過程で、寄生虫のライフ サイクルのステージは、chagasic マウス²⁴の射精で観察されました。これらの調査結果は、 t. の原因 -感染抗体^1,25,26の不在でホストの子孫によって達成される免疫寛容に関する報告書と一致しています。また、他の大陸^{3,4,5,6,7,8 固有のシャーガス病の広がりを提案した疫学的報告書 ,9,10、11,12,13 1 シャーガス病が性的に送信することができますを示している実験の研究によってサポートされています}.現在の調査疫学家族研究プロトコルおよびt. クルーズトリパノソーマ感染症が性行為で伝達されることを表します。

プロトコル

人間、ブラジリア大学の医学部の動物研究委員会、それぞれ研究プロトコル 2500.167567 10411/2011 でヒトと実験動物のすべてのプロシージャを承認しました。(プロトコル ナンバー 054/2009 と CONEP 11163/2009) 公共財団病院ガスパール ヴァイアナの倫理委員会は、フィールド研究の拡張子に、省の保健委員会人間研究 (CONEP 2585 年 04 月) のための無料の同意フォームを承認しました。プロトコルは DNA 二倍体血単核細胞および精液射精の半数体の配偶子のt. の原因を評価するために調節されました。実験動物が人道的なケアを受信しました。犠牲、前に心臓穿刺を受けるマウス麻酔下にあった。

1. 人間の参加者の募集

1. 研究チームは、シャーガス患者に医療を提供する医療システム シャーガス病プログラムに参加できることを確認します。
2. 家族プログラムに登録を少なくとも 1 つを伴った発熱、倦怠感、頭痛、頻脈、浮腫、急性シャーガス病¹⁴の主な臨床症状を示すから人間の参加者を募集します。
3. 5 年の期間のため研究家族の人々 に医療を提供します。
4. 3 回 1 年間離れて調査の関係者から静脈血の 15 mL を取得、サンプルを 3 つの 5 mL 因数に分割、4 ° C で冷蔵庫に保管
5. 大人のボランティア家族から精液射精の 2 mL を収集し、3.3 のステップの説明に従います。

2. 寄生虫の成長

1. 血液の抗凝固ナトリウム ヘパリンの 5 単位を混ぜて手順 1.4 から因数を使用すると、血液の接種による急性のシャーガス病の診断と家族参加者から斜面文化を作る。
   1. 50 mL スクリュー キャップ チューブ血液寒天傾斜プラス肝注入 tryptose 培地 (点灯) 5 mL に unclotted 人間の血液 5 mL を接種して 3ヶ月の 27 ° C でシェーカーのサンプルをインキュベートします。
   2. スライド ガラスの上に培養上清中の 100 μ L を配置、4 週間ごと伝票や血液、顕微鏡下でのt. の原因epimastigotes の検索でカバーします。
   3. 27 ° C で無菌の点灯中清 epimastigote 分離株を収穫します。PBS pH 7.4 では、1,000 x gで 10 分間の遠心分離機のセルを洗浄します。ダルベッコ修飾必須培地 (DMEM) 5 mL にペレットの epimastigotes を希釈します。
   4. 合流 L6 筋細胞培養フラスコを接種する 1 x 10 の⁶ ECI1-ECI21 t. の原因epimastigote が分離されました。
   5. ベレニス原型 trypomastigotes L6 筋細胞培養 75 mL 培養フラスコでT. 原因に ECI21 ECI1 を育ててください。
   6. 15 ml DMEM の ph 7.4 250 nM L-グルタミン, と 5% CO₂ 37 ° C¹で 100 μ g/mL ストレプトマイシン、ペニシリン 100 IU/mL 5% ウシ胎児血清を添加した細胞をフィードします。
   7. ステップ 5.2 で説明されている陽性対照表現型t. 原因ベレニス trypomastigotes は組織培養由来 ECI1-ECI21 を使用します。
   8. ネガティブ コントロールリーシュ マニア braziliensis²⁷ 20% 牛胎児血清のみと DMEM を成長し、ネガティブ コントロールとして寄生虫 promastigotes を使用します。
   9. マウスに感染するのに細胞培養から上清に 1 × 10⁶ t. 原因ECI1-ECI21 trypomastigotes を使用します。
   10. 尾血液感染の最初の週後にt. の原因trypomastigotes を検索します。
   11. ヘマトキシリン ・ エオジン染色の心臓、骨格筋、感染マウスの生殖器官のセクション 1 ヶ月後に amastigotes の巣を検索します。

3. DNA の抽出、PCR 解析

1. 5 mL の血液 (手順 1.4) の生殖不能の EDTA 管に分注を配置し、3,000 x gの 45 分の密度勾配遠心法を実行します。ピペットを使用して、赤血球上の白っぽい相から単核細胞を採取、PBS、pH 7.4 では、異なる 15 mL チューブに 1,500 × gで 10 分間の遠心分離によっての 5 mL で 2 回白い細胞を洗浄し、DNA の抽出のためのセルを使用します。
2. ECI 21 t. の原因ベレニスのt. の原因、ネガティブ コントロールl. braziliensis (ステップ 2.1.8) から正のコントロールからに ECI 1 から DNA を抽出し、109 人間家族のテスト血の単核の細胞から研究課題^1,27,28。
3. 手順 1.5 DMEM (1:4 v/v) で得られた精子試料の希釈 2 mL5% CO₂の 45 分と 37 ° C の孵化、13,000 x gで 5 分間遠心分離後の上清から精子を回復および半数体 DNA²³を抽出します。
4. 抽出バッファー内セルの 1 mL を配置 (10 μ M, 20 μ M EDTA, 塩化ナトリウム 1 %sds、プロテイナーゼ K 0.04% と 1% ジチオトレイトール)、インバージョンとその揺れによってソリューションをミックス。
   1. 13,000 x gおよび 25 ° C で 10 分間のソリューションを遠心し、粘性の上澄みをスピン列に転送します。
   2. 遠心 10,000 × gで 1 分間スピン列と溶出液; を破棄スピン列 (テーブルの材料) を 500 μ L 結合バッファーを追加、12,000 × gで 1 分間遠心および溶出液を捨てます。
   3. 600 μ L の洗浄液を回転カラムに追加、12,000 × gで 1 分間遠心、溶出液を捨てます。
   4. 2 回、この手順を繰り返し、スピン列を滅菌 1.5 mL マイクロ遠心チューブに転送します。
   5. TE バッファーの 100 μ L 管、2 分間室温でインキュベート、12,000 × gで 1 分間チューブを遠心分離を追加します。遠心チューブ内のバッファーには、DNA が含まれています。
   6. 0.8% の agarose のゲルの因数を実行することにより、吸光度 260 を読んで DNA 濃度の測定分光光度計の nm。PCR 解析で使用するまで-20 ° C で DNA サンプルを格納します。
5. 特定 188 nt 特定テロメア シーケンスにアニール使用t. の原因Tcz1/2 プライマー プローブ²⁹と家族研究被験者の血液と精子、ベレニスのt. の原因の肯定的な制御およびから DNA を PCR を実行、L. braziliensisネガティブ コントロール。
   1. 10 ng テンプレート DNA、プライマー、2 U の Taq DNA ポリメラーゼ、0.2 μ M dNTPs と 15 μ M MgCl₂ 25 μ L 最終巻の各ペアの 0.4 μ M と PCR の混合物を準備します。
   2. 30 94 ° C で DNA 増幅プログラムを開始テンプレートを変性し、30 の 55 ° C にサンプルを冷却する s s。90 94 ° C でサンプルをインキュベートし、アニールされたプライマーの拡張する s。30 94 ° C まで温度を返す次のサイクルを開始し、サンプルをインキュベート s 72 ° C でさらに 3 分32^ndサイクルの終わりには、室温で 10 分間のサンプルを冷却、4 ° C²⁹で冷蔵庫で保管します。
   3. 両方の下肢に Tcz1/2 プライマーをアニールt. 原因DNA テロメア反復配列を増幅します。
   4. 1.3% の agarose のゲルの拡大の製品を分析し、UV イルミネーターで 188 nt DNA バンドを確認します。

4.南交配

注:南交配は agarose のゲルの偽肯定的な PCR 産物のほとんどを破棄する使用されました。

1. シャーガス ケース ポジティブ コントロール、二倍体 DNA の 109 のテスト サンプルからは南交配する 21 研究家族参加者の半数体の DNA から、感染していないコントロールからの PCR 増幅産物を対象します。
2. T. 原因188 nt DNA 特定テロメア シーケンス プローブが表示 Tcz1/2 プライマーをアニールを採用します。[α-³²P] 2'-デオキシアデノシン三リン酸 (dATP) 任意プライマー分類のキットを使用して、プローブのラベルおよび 60 V 4 ° C で一晩で 1.3% の agarose のゲルの拡大の製品を分析
3. 一晩キャピラリー方式正荷電のナイロン膜にゲルを転送します。
4. 標識の 188 nt のプローブは、可変期間の 25 μ L の酵素特有のバッファーにバインドを genomic DNA のエコR1 ダイジェストとナイロン膜に転送 DNA バンドを交配させます。
5. 2 x SSC と 0.1 %sds の 65 ° C で 15 分間 2 回膜を洗浄します。
6. 1 週間の x 線映画をナイロン膜やオートラジオグラフィー膜のバンドを公開します。
7. 特定の標識 DNA プローブとハイブリダイズするt. 原因PCR 増幅の製品と PCR および南の交配から選択されたクローンを成長します。
8. 商業的、t. の原因 -特定のテロメア フット プリント^2,23に焼なましを設定 Tcz1/2 プライマーを使用してクローンをシーケンスします。

5. 免疫アッセイ

注: 感度と特異度 (IIF) 間接蛍光抗体法と酵素免疫測定法 (ELISA) を評価した明白な寄生症 6 例にシャーガスと 6 シャーガス無料からの血清の血清を提供銀行のサンプル。法は、1: 100 希釈で IIF と ELISA 光学密度 (ODs) 0.150 と上記負の結果から正を分離を明らかにした PBS、pH 7.4 でダブル血清希釈で実施。

1. 1 時間室温で保管 unclotted 血液分注 (手順 1.4) 5 mL を使用して、上清に血清を分離する 30 分間 1,500 × gで遠心分離機します。
2. T. の原因とL. braziliensis抗原²⁸.を前述のように検出する血清希釈液の調製帳票 1: 100 の IIF と ELISA を実行します。
3. IIF 関数
   1. 3 回 1 年間隔に 109 研究被験者の試料の帳票血清希釈液で IIF アッセイを行ってください。
   2. 場所 5 μ L 懸濁液、ホルマリン 1% - t. の原因epimastigotes またはガラス スライド上にL. braziliensis promastigotes 治療常温フードで寄生虫一晩乾燥させて、使用するまで-20 ° C でスライド ガラスを格納します。
   3. スライド ガラスの上に患者の血清希釈の場所 20 μ L コーティング 5 μ L の不活化 (10 寄生虫/μ L) t. の原因epimastigotes またはL. braziliensis promastigotes。
   4. 37 ° C で三度 PBS で洗浄湿室に 1 h のスリップで覆われたガラス スライドを孵化させなさい。
   5. 37 ° C で 1 時間人間の IgG にフルオレセイン標識ウサギ抗体 (材料表) の縮尺希釈で乾ガラス スライドを孵化させなさい洗浄し、スライドを乾燥します。
   6. カバー スリップのスライドをマウントし、紫外光顕微鏡下で調べます。
      注: 肯定的な試験は、アップル グリーンのビデオで示すように、 t. の原因epimastigote シルエット。
4. ELISA
   1. T. の原因およびコーティング マイクロ プレートのウェルにL. braziliensis可溶性抗原 (pH 9.6 0.1 M 炭酸バッファーに 1 μ g/100 μ L) を検出するための elisa 法を実行します。
   2. 室温で 2 時間帳票コーティングされた井戸の 1: 100 血清希釈を孵化させなさい。
   3. 三度 PBST でプレートを洗う (0.5% を含む PBS トゥイーン 20)、pH 7.4、乾燥する前にソリューション。
   4. 縮尺希釈ウサギ抗ひと IgG 抗体の 37 ° C で 90 分の 50 μ L をプレートを孵化させなさい
   5. 三度 PBST ソリューションでプレートを洗浄し、室温で乾燥すること。
   6. 37 ° C で 90 分のアルカリ性ホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギ IgG (材料表) の縮尺希釈液を 100 μ l 添加でプレートを孵化させなさい
   7. PBST で三度プレートを洗浄、基板 p ニトロ フェニルりん酸を追加し、発色を待ちます。
   8. 630 で ODs を読む nm マルチモード プレート リーダー。
   9. 調査の人口からテスト血清の帳票の希薄を実行し、具体的に特定する ODs をプロットt. の原因抗体。

6. 免疫寛容の評価

注: 鶏モデル システムは胚の最初の 1 週間後t. の原因の感染症をテストに使用だった。

1. 組織培養培地; から収穫 100/10 μ t. の原因trypomastigotes とチキン肥沃な卵を接種します。培地 μ L あたり 10 t. の原因trypomastigotes と模擬卵を接種します。テープで穴を塞ぐ。
2. 21 日は 20 t. の原因-感染した卵と数 37 ° C 湿度 65% でモック肥沃な卵を孵化させなさい。
3. 雛そのハッチ 24 h と、その後、32 ° c 温度制御が付いているフードでインキュベーターで 3 週間保ちます。
4. T. の原因 -接種卵および 24 ° c、別の通路に置かれた個々 のケージで肯定的な空気圧個室で大人の段階に模擬卵から孵化した雛を育てます。
5. ビデオのスキームによると、毎週、皮下を注入 10⁷不活化 trypomastigotes で生後 6 か月で 3 回すべての大人の女に挑戦します。
6. T. の原因-接種した卵からはモックのコントロール血清を取得する最後の予防接種後 4 週間を孵化した鶏の翼の静脈から血液を描画します。
7. 鶏血清を使用して、特定の検出 iif 関数とプロトコルの手順 5 で説明した ELISA によるt. の原因抗体。

7. 感染マウスのシャーガス患者の精液射精からのt. の原因

1. 大人の PCR + シャーガス病患者 (ステップ 1.5) と PCR-シャーガス無料大人個人から精液射精を使用します。
2. 12 歳 1 か月 BALB/c 素朴なマウス 24 ° C で肯定的な空気圧の下フードの保管し、供給食品広告自由の 2 つのグループを使用します。
3. 腹膜とグループ A マウスの膣に等しい量に人間シャーガス陽性精液因数 (100 μ L) を植え付けます。
4. 腹膜と膣内に B 群のマウスの同量にコントロール シャーガス無料精液因数 (100 μ L) を植え付けます。
5. 麻酔下で実験的マウスを犠牲に精液注入後 5 週間とヘマトキシリン - エオシン染色組織切片の対象します。
6. Trypomastigotes t. の原因や心臓、骨格筋、マウスのグループでは生殖器に amastigotes を検索する顕微鏡を使用します。

8 、肉体関係によってt. クルーズトリパノソーマ感染症の伝送

1. 実験では 10 の男性と女性 6 週齢 BALB/c マウスを使用します。
2. 男性 5 名、1 x 10 の⁵組織培養からt. の原因trypomastigotes と腹腔内 5 雌マウスに接種します。 
3. 生後 3 カ月までのマウスを繁殖: 私は 5 t. の原因によって形成されるグループ-感染したメスのマウスと 5 制御マダニ、男性の仲間。II 群で形成される 5 t. の原因-感染した男性と 5 はマダニの女性仲間を制御します。III 群は男性 5 名と女性 5 制御感染素朴な仲間によって形成されます。
4. 各家の脱出を防ぐために 5 mm グリッドとロックのドアとセーフティ ボックスの中に配置 1 つのケージのペア繁殖。
5. 食事と水のアドリブは、マウスを供給します。離乳し、少なくとも 6 週間のグループ II と I で 70 の合計を上げます。
6. 親 (FO) と麻酔下での子孫 (F1) マウスから心臓穿刺による採血、マウスを犠牲にし、心臓、骨格筋、病理学的分析のための生殖器官のセクションを送信します。

9. 免疫特権の評価

1. T. の原因から組織を取得-感染と素朴なマウス (手順 8.6) を制御し、4 μ m 厚いセクションにパラフィン包埋試料をカットします。
2. パラフィンを取り外して、キシレンのいくつかの変更とスライド ガラスおよび 1 分の 100% を 70% エタノールで傾斜洗浄にセクションを脱水します。
3. 室温で 3 つの蒸留水洗浄後一度、0.05% サポニンと切片を孵化させなさい。
4. 0.1 m PBST スライド 45 分洗浄 5% 無脂肪粉ミルクの切片をブロックし、セクションとシャーガス マウス抗t. 原因血清または、1:20 で感染コントロール マウス血清を孵化させなさい 2 h のための希薄。
5. PBST とアルカリ性フォスファターゼ共役ウサギ抗マウス IgG の縮尺希釈培養する前に常温乾燥、三度 5 分用のスライドを洗ってください。
6. PBST スライドをリンスに、3, 3' 5 分孵化、PBST と 3 つの洗浄および 30 のハリス ヘマトキシリンと counterstaining に続いてジアミノベンジジンを 100 μ l 添加 s。
7. 5 分間蒸留水でスライドを洗って 70%、80%、90%、および 1 分の 100% エタノールの脱水にバッファーに格納されたグリセリンでそれらをマウントします。
8. 明視野光学顕微鏡でスライドを確認し、ソフトウェアとアナライザー プログラム超小型カメラで写真画像をキャプチャします。
9. 生殖器の炎症性反応の不在で寄生虫の免疫特権を文書化します。

10. 統計解析

1. 医学編集を使用して、配列解析のため、爆発で線形を行い、E 値の統計的有意 (p < 0.05) を特定します。
2. 一方向の分散分析 (ANOVA) を実行し、OD を比較するためのテューキー検定は、プラスまたはマイナスの標準偏差を意味します。

結果

プロトコルに従ってこの調査は臨床および寄生虫の検査によるシャーガス病の急性のケースを検出することを目的しました。直接顕微鏡検査と培養寄生虫の成長のために静脈採血を受けた。シャーガス病 21 急性例は血のt. の原因を示した。研究プロトコル セキュリティで保護されたt. 原因ECI1 の分離-急性シャーガス病から ECI21、DNA サンプル展示調査の?...

ディスカッション

人間シャーガス病が性病種族内のt. の原因に由来かどうかの質問に答えた家族ベースの研究プロトコルについて論じる本、感染症。初期の研究を提供できなかったt. の原因の感染症、性行為感染の証拠おそらくシャーガス病についての情報と利用可能なデータは別途個別^{3,4から得られたので 5,}

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCIP and NBT redox system	Sigma-Aldrich	681 451 001
Blood DNA Purification columns	Amersham Biosciences	27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.	Perkin Elmer	BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm	AMRESCO	064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions	GE Healthcare	28-4065-51
Eco RI	Invitrogen	15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated	Southern Biotech	2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated	Biocompare	MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane	GE Healthcare	RPN303B
Hybridization oven	Thomas Scientific	95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software	Olympus, Japan
Molecular probes labeling System	Invitrogen	700-0030
Nsi I	Sigma-Aldrich	R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit	GE Healthcare	28-9042-70
Plate reader	Bio-Tek GmBH	2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated	Sigma-Aldrich	A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated	Sigma-Aldrich	F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated	Sigma Aldrich	A2418
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated	Biorad	MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine	Sigma-Aldrich	G25DNA-RO
Taq DNA Polymerase Recombinant	Invitrogen	11615-010
Thermal cycler system	Biorad, USA	1709703
Vector Systems	Promega	A1380