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  • Résumé
  • Résumé
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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’agent de la maladie de Chagas de Trypanosoma cruzi produit durable des infections asymptomatiques qui brusquement se développent en pathologie cliniquement reconnue. Le protocole de recherche suivant décrit une étude épidémiologique axée sur la famille de court terme pour démêler l’infection de T. cruzi transmise sexuellement des parents aux descendants.

Résumé

Trypanosomiase américaine est transmise aux humains par punaises triatomes par l’ingestion d’aliments contaminés, par transfusion sanguine ou accidentellement dans les hôpitaux et les laboratoires de recherche. En outre, l’infection par Trypanosoma cruzi est congénitalement transmise d’une mère chagasic à sa progéniture, mais la contribution du partenaire masculin à une contamination in utero est inconnue. Les résultats des nids et des touffes d’amastigotes et des trypomastigotes dans les cellules de la thèque de l’ovaire, dans le goniablasts et dans la lumière des tubules séminifères suggèrent que les infections de T. cruzi sont transmises sexuellement. Le protocole de recherche ci-après présente les résultats d’une étude familiale population montrant parasite ADN nucléaire dans les cellules mononucléaires de sang diploïde et chez les gamètes haploïdes de sujets humains. Ainsi, trois échantillons biologiques indépendants recueillis un an d’intervalle confirment que T. cruzi infections ont été sexuellement transmissibles à la descendance. Fait intéressant, le spécifique anticorps T. cruzi est absent dans la plupart des descendants famille qui portait une tolérance immunitaire à l’antigène de parasite. Tolérance immunitaire a été démontrée dans le poulet réfractaire T. cruzi après la première semaine de croissance embryonnaire et poussins éclos des oeufs inoculés flagellé étaient incapables de produire l’anticorps spécifique. En outre, l’instillation du sperme humain éjacule par voie intrapéritonéale ou dans le vagin de souris naïves a donné T. cruzi amastigotes dans l’épididyme, canal déférent et tube séminifère, tube utérin avec l’absence d’inflammatoire réactions dans les organes immunitaires privilégiés de reproduction. L’élevage de T. cruzi-des souris mâles et femelles infectées avec des camarades de naïf a abouti à l’acquisition des infections, qui ont été ensuite transmis à la descendance. Par conséquent, un solide programme d’éducation, information et communication qui implique la population et les organisations sociales est jugé nécessaire pour empêcher la maladie de Chagas.

Introduction

Le protozoaire parasite Trypanosoma cruzi , appartenant à la famille des Trypanosomatidae subit des trypomastigotes et amastigote étapes du cycle de vie chez les hôtes mammifères et existe sous la forme épimastigotes dans de l’insecte vecteur (Reduve : Triatominae) tube digestif et en culture axénique. Ces dernières décennies, plusieurs études ont montré la présence de la maladie de Chagas dans les pays sur quatre continents, a examiné les triatomes bug gratuit1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; la dispersion des trypanosomes américains a été initialement attribuée à des immigrants latino-américains à l’hémisphère Nord, mais il est possible que certains soient des cas autochtones de la maladie de Chagas peut ne plus nier3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. la source endogène uniquement reconnaissable de transmission de T. cruzi a été attribuée au transfert de la mère chagasic du parasite à la descendance dans environ 10 % des grossesses15; contribution du partenaire masculin aux infections in utero par le biais de sperme éjaculats est restée méconnue.

Il y a plus d’un siècle les enquêteurs16,17 observé intracellulaire T. cruzi amastigotes dans les cellules de la thèque de l’ovaire et dans le germe de la ligne des cellules des testicules des cas aigus de la maladie de Chagas. Les nids et les touffes de T. cruzi trypomastigotes et amastigotes dans les cellules de la thèque de l’ovaire, dans goniablasts et dans la lumière des tubes séminifères (Figure 1) des cas de maladie de Chagas aiguës mortels développent privilège immunitaire dans les organes de reproduction en l’absence d’inflammatoire infiltre18,19. Ces dernières décennies, quelques études expérimentales ont démontré les nids des formes amastigotes rond de T. cruzi dans le tube séminifère, l’épididyme et des canaux déférents ainsi que dans l’utérus, les tubes et les ovaires cellules de la thèque de souris infectées aiguë 1,20,21,22. En outre, dans le cadre des études familiales de documenter le transfert de protozoaire l’ADN mitochondrial de parental Chagas patients à leurs descendants, T. cruzi ADN nucléaire (Adnn) a été vérifiée en ligne de humaine germinale haploïde cellules23, et étapes du cycle de vie parasite ont été observés dans les éjaculats de chagasic souris24. Ces résultats sont en accord avec les rapports sur la tolérance immunitaire atteint par les descendants des hôtes T. cruzi -infectées en l’absence de l’anticorps spécifique1,25,26. En outre, les rapports épidémiologiques qui a suggéré la propagation de la maladie de Chagas endémique aux autres continents3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 sont actuellement supportés par des études expérimentales montrant que la maladie de Chagas peut être transmise sexuellement1 . La présente enquête présente un protocole de l’étude épidémiologique de famille et montre que l’infection par T. cruzi se propage par les rapports sexuels.

Protocole

L’être humain et les comités de recherche animale de la faculté de médecine de l’Université de Brasilia a approuvé toutes les procédures avec des sujets humains et des animaux de laboratoire, respectivement, dans les protocoles de recherche 2500.167567 et 10411/2011. Le Comité d’éthique de l’hôpital Public fondation Gaspar Vianna (protocole nº 054/2009 et CONEP 11163/2009) a approuvé les formulaires de consentement libre pour l’étude de terrain, avec extension à la ministère de la santé National Commission on Human Research (CONEP 2585/04). Le protocole a été ajusté pour évaluer T. cruzi ADN dans les cellules mononucléaires de sang diploïde et dans les gamètes haploïdes de sperme éjaculats. Les animaux de laboratoire a reçu tous les soins ; les souris, soumis à la perforation cardiaque avant le sacrifice, étaient sous anesthésie.

1. le recrutement des participants humains

  1. Veiller à ce que l’équipe de recherche participe à un programme de maladie Chagas de système de santé à fournir des soins de santé aux patients de Chagas.
  2. Recruter des participants humains issus de familles inscrites au programme, montrant au moins un cas de fièvre, malaise, maux de tête, tachycardie et l’oedème, les principaux symptômes cliniques de maladie Chagas aiguë14.
  3. Fournir des soins de santé à la population dans l’étude des familles pour une période de cinq ans.
  4. Obtenir 15 mL de sang veineux par les participants de l’étude à trois reprises un an d’intervalle, diviser l’échantillon en trois parties aliquotes de 5 mL et entreposez-les au réfrigérateur à 4 ° C.
  5. Recueillir des 2 mL des sperme éjaculats de membres bénévoles adultes et procéder comme indiqué au point 3.3.

2. la croissance des parasites

  1. Sur la partie aliquote de l’étape 1.4, mélanger le sang avec 5 unités d’anticoagulants héparine de sodium ; faire une culture de la pente par l’inoculation de sang des participants familiales avec le diagnostic de la maladie de Chagas aiguë.
    1. Ensemencer des 5 mL du sang humain coagulé dans une pente de gélose au sang tube 50 mL bouchon à vis plus 5 mL de milieu de perfusion hépatique-tryptose (allumé) et incuber l’échantillon dans un shaker à 27 ° C pendant 3 mois.
    2. Déposer 100 µL de milieu surnageant au-dessus des lames de verre, couvrir avec glissades et recherche de sang épimastigotes de T. cruzi sous le microscope, toutes les quatre semaines.
    3. Récolter les isolats épimastigotes dans le surnageant du milieu axénique de LIT à 27 ° C ; laver les cellules dans le tampon au phosphate pH 7.4, centrifuger à 1 000 x g pendant 10 min ; diluer les épimastigotes dans le culot dans 5 mL de milieu essentiel modifié de Dulbecco (DMEM).
    4. Ensemencer les flacons de culture de cellule de muscle L6 confluentes avec 1 x 106 ECI1-à-ECI21 T. cruzi épimastigotes isole.
    5. Cultiver la ECI1-à-ECI21 de T. cruzi et les trypomastigotes archétype de Bérénice en cultures de cellules de muscle de L6 en flacons de culture de 75 mL.
    6. Nourrir les cellules avec 15 mL de DMEM à pH 7,4 additionné de sérum de veau fœtal 5 % 100 UI/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, 250 nM L-glutamine et 5 % de CO2 à 37 ° C1.
    7. Utilisez le contrôle positif de T. cruzi Bérénice trypomastigotes au phénotype les isolats ECI1-à-ECI21 de culture de tissus, comme indiqué au point 5.2.
    8. Cultiver le contrôle négatif Leishmania braziliensis27 en DMEM additionné de 20 % sérum de veau fœtal seulement et d’utiliser les promastigotes de parasite comme témoin négatif.
    9. Utiliser 1 x 106 T. cruzi ECI1-à-ECI21 trypomastigotes dans le surnageant de culture cellulaire à infecter des souris.
    10. Recherche de T. cruzi trypomastigotes dans le sang de la queue après la première semaine de l’infection.
    11. Cherchez les nids d’amastigotes à l’hématoxyline-éosine teinté de sections du coeur, le muscle squelettique et les organes reproducteurs des souris infectées, un mois par la suite.

3. extraction d’ADN et analyses PCR

  1. Placer 5 mL de sang (étape 1.4) aliquote dans un tube EDTA stérile et effectuer la centrifugation en gradient de densité pendant 45 min à 3 000 x g. Utiliser une pipette pour récolter les cellules mononucléaires de la phase blanchâtre au-dessus de globules rouges, laver les cellules blanches deux fois dans 5 mL de PBS, pH 7,4, par centrifugation pendant 10 min à 1 500 g dans un tube de différents 15 mL et utilisent les cellules pour l’extraction de l’ADN.
  2. Extraire l’ADN d’ECI-1 ECI-21 T. cruzi, depuis le contrôle positif de Bérénice T. cruzi, à partir du contrôle négatif L. braziliensis (étape 2.1.8) et depuis les cellules mononucléaires du sang test de 109 famille humaine étudier des sujets1 , 27 , 28.
  3. Diluer 2 mL des échantillons de sperme obtenu à l’étape 1.5 en DMEM (1:4, v/v) ; incuber pendant 45 min à 5 % de CO2 et 37 ° C, récupérer des spermatozoïdes du surnageant après centrifugation pendant 5 min à 13 000 x get extraire l' haploïde de l’ADN23.
  4. Placer 1 mL des cellules dans le tampon d’extraction (10 µM NaCl, 20 µM EDTA, 1 % SDS, 0,04 % protéinase-K et le dithiothréitol 1 %) et mélanger les solutions par inversion et secouant.
    1. Centrifuger les solutions pendant 10 min à 13 000 x g et 25 ° C et transférer le surnageant visqueux dans une colonne.
    2. Centrifuger la colonne à centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g et éliminer l’éluat ; ajouter 500 µL de tampon de liaison à la colonne (Table des matières), il centrifuger pendant 1 min à 12 000 x get éliminer l’éluat.
    3. Ajouter 600 µL de tampon de lavage à la colonne de spin, il centrifuger pendant 1 min à 12 000 x get éliminer l’éluat.
    4. Répéter cette étape deux fois et le transfert de la colonne dans un tube à centrifuger micro stérile de 1,5 mL.
    5. Ajouter 100 µL de tampon de TE, incuber les tubes à température ambiante pendant 2 min et centrifuger le tube pendant 1 min à 12 000 x g. La mémoire tampon dans le tube de microcentrifuge contient l’ADN.
    6. Mesurer les concentrations d’ADN en exécutant des aliquotes sur un gel d’agarose 0,8 % et par la lecture de l’absorbance à 260 nm avec un spectrophotomètre. Conserver les échantillons d’ADN à-20 ° C jusqu'à l’utilisation dans l’analyse PCR.
  5. Amorces de T. cruzi Tcz1/2 utilisation recuites à la séquence spécifique 188-nt spécifique télomère probe29 et exécuter le PCR avec l’ADN, de sang et le sperme des sujets de l’étude familiale, depuis le contrôle positif de Bérénice T. cruzi et de la L. braziliensis contrôle négatif.
    1. Préparer le mélange PCR avec 10 modèle ng ADN, 0,4 µM de chaque paire d’amorces, 2 U de Taq DNA polymerase, 0,2 dNTPs µM et 15 µM MgCl2 dans un volume final de 25 µL.
    2. Lancer le programme d’amplification de l’ADN à 94 ° C pendant 30 s à dénaturer le modèle et laisser refroidir les échantillons à 55 ° C pendant 30 s. Puis, incuber les échantillons à 94 ° C pendant 90 s à étendre les amorces de recuit. La température de retour à 94 ° C pendant 30 s pour lancer le prochain cycle et incuber les échantillons une supplémentaire de 3 min à 72 ° C. À la fin du cycle 32nd , refroidir les échantillons pendant 10 min à température ambiante et entreposez-les au réfrigérateur à 4 ° C29.
    3. Amplifier une séquence répétée de T. cruzi ADN télomérique recuite pour les amorces de Tcz1/2 aux deux extrémités.
    4. Analyser les produits d’amplification sur un gel d’agarose de 1,3 % et observer les bandes d’ADN de 188-nt sur un UV-illuminateur.

4. l’hybridation Southern

Remarque : L’hybridation Southern servait à jeter de la plupart des amplicons PCR positifs fausses dans le gel d’agarose.

  1. Soumettre les produits d’amplification PCR des contrôles sains, de cas témoins positifs Chagas, 109 échantillons d’ADN diploïde et haploïde ADN des 21 participants familiale d’hybridations méridionales .
  2. Employer la T. cruzi 188-nt spécifique de l’ADN télomérique séquence sonde recuite pour les amorces de Tcz1/2 illustrés ; Étiquetez la sonde avec [α -32P] 2'-adénosine triphosphate (dATP) utilisant une amorce aléatoire kit d’étiquetage et d’analyser les produits d’amplification sur un gel d’agarose de 1,3 % à 60 V pendant une nuit à 4 ° C.
  3. Transférer le gel sur une membrane de nylon chargé positivement à l’aide de la méthode capillaire du jour au lendemain.
  4. Hybrider les bandes d’ADN transférés à la membrane en nylon avec la sonde radioactive 188-nt, qui lie les condensés de EcoR1 de l’ADN génomique de 25 µL du tampon enzymatique spécifique pendant des périodes variables.
  5. Laver la membrane deux fois pendant 15 min à 65 ° C avec 2 SDS x SSC et 0,1 %.
  6. Exposer les films radiographiques à la membrane de nylon et autoradiogramme les bandes sur la membrane pendant une semaine.
  7. Cultiver les clones sélectionnés de l’hybridation avec les produits d’amplification PCR de T. cruzi , qui sont hybridés avec la sonde spécifique d’ADN radiomarquée PCR et du Sud .
  8. Dans le commerce des séquences des clones en utilisant les amorces Tcz1/2 set recuits au T. cruzi -télomère spécifiques empreinte2,23.

5. tests immunologiques

Remarque : La sensibilité et la spécificité de l’immunofluorescence indirecte (IFI) et de l’immuno enzymatique (ELISA) ont été évaluées dans le sérum de six Chagas patients présentant une parasitémie démontrable et de six Chagas exempt, dépersonnaliser sérum échantillons de la banque. Les essais effectués avec les dilutions doubles de sérum dans du PBS, pH 7,4, a révélé que l’IIF à des dilutions au 1/100 et les densités optiques ELISA (ODs) à 0,150 et plus séparent le positif des résultats négatifs.

  1. Utilisez 5 mL du sang coagulé aliquot (étape 1.4) conservé à température ambiante pendant 1 h et il centrifuger à 1 500 g pendant 30 min séparer le sérum dans le surnageant.
  2. Effectuer l’IIF et ELISA dans les dilutions de sérum au 1/100 en triple pour détecter les antigènes de T. cruzi et L. braziliensis comme décrit plus haut28.
  3. IIF
    1. Effectuer l’essai de l’IIF dans les dilutions du sérum en triple d’échantillons de le 109 étude sujets obtenus à trois reprises un an d’intervalle.
    2. Placer 5 suspensions µL de la formaline 1 % - traités T. cruzi épimastigotes ou L. braziliensis promastigotes sur lames de verre ; laisser sécher jusqu’au lendemain parasites sous une hotte à température ambiante et stocker les lames de verre à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
    3. Place 20 µL de dilutions de sérum du patient sur le dessus de lames de verre recouvert de 5 µL du formol-tués (10 parasites/µL) T. cruzi épimastigotes ou L. braziliensis promastigotes.
    4. Incuber la lame de verre recouverte d’un feuillet pendant 1 h dans une chambre humide à 37 ° C et laver trois fois avec du PBS.
    5. Incuber la lame de verre séché à l’air avec une dilution de 1 : 1 000 d’un anticorps de lapin marqué à la fluorescéine (Table des matières) IgG humaines pendant 1 h à 37 ° C ; Lavez et séchez la diapositive.
    6. Monter la lame avec une lamelle couvre-objet et l’examiner sous un microscope à lumière UV.
      Remarque : Un examen positif est un vert pomme T. cruzi épimastigotes silhouette, montré dans la vidéo.
  4. ELISA
    1. Exécuter une épreuve ELISA pour détecter le T. cruzi et les antigènes solubles L. braziliensis (1 µg/100 µL de tampon carbonate de 0,1 M à pH 9,6) sur microplaque enduite.
    2. Incuber les dilutions de sérum au 1/100 dans une microplaque en triple pendant 2 h à température ambiante.
    3. Laver les plaques trois fois avec PBST (PBS contenant 0,5 % Tween-20), pH 7,4, solution avant le séchage.
    4. Incuber les boîtes avec 50 µL d’une dilution de 1 : 1 000 des anticorps de lapin anti-human IgG pendant 90 min à 37 ° C.
    5. Laver les plaques trois fois avec la solution PBST et laissez-les sécher à température ambiante.
    6. Incuber les boîtes avec 100 µL de dilutions de 1 : 1 000 de chèvre de conjugué à la phosphatase alcaline anti-rabbit IgG (Table des matières) pendant 90 min à 37 ° C.
    7. Laver les plaques trois fois avec PBST, ajouter du phosphate de phényle substrat p-nitro et attendre pour le développement de la couleur.
    8. Lire l’ODs à 630 nm dans un lecteur de plaque multimode.
    9. Exécuter les dilutions en triple de sérum à l’essai de la population étudiée et tracer l’ODs afin d’identifier les particuliers les titres d’anticorps T. cruzi .

6. les évaluations d’une tolérance immunitaire

NOTE : Un système de modèle de poulet a été utilisé pour tester les infections de T. cruzi après la première semaine du développement embryonnaire.

  1. Ensemencer des oeufs fertiles avec 100/10 µL T. cruzi trypomastigotes récoltées sur milieu de culture tissulaire ; inoculer contrôle faux oeufs avec 10 T. cruzi trypomastigotes pour µL de milieu de culture. Sceller le trou avec du ruban adhésif.
  2. Incuber 20 T. cruzi -infectées oeufs et un nombre égal d’oeufs fertiles de simulacre de contrôle à 37 ° C et 65 % d’humidité pendant 21 jours.
  3. Garder les poussins qui éclosent dans l’incubateur pendant 24 h et ensuite à 32 ° C dans des hottes avec contrôle des températures pendant trois semaines.
  4. Cultiver les poussins éclos des oeufs T. cruzi -inoculés et des œufs de simulacre de contrôle au stade adulte dans une chambre de pression d’air positif à 24 ° C, dans des cages individuelles, placés dans les allées séparées.
  5. Défier tous les poussins adultes trois fois à l’âge de six mois avec 107 trypomastigotes tués par formol injectés par voie sous-cutanée, toutes les semaines, selon le schéma dans la vidéo.
  6. Prélever du sang d’une veine de l’aile des poulets éclos des oeufs de T. cruzi -inoculées et des contrôles de simulacres de quatre semaines après la dernière vaccination pour obtenir le sérum.
  7. Utiliser le sérum de poulet pour détecter les propres anticorps de T. cruzi par l’IIF et ELISA tel que décrit à l’étape 5 du protocole.

7. infection des souris par T. cruzi de sperme des patients Chagas éjacule

  1. Utiliser les sperme éjaculats chez un patient de maladie de Chagas PCR + adult (étape 1.5) et chez un individu adulte PCR - Chagas-libre.
  2. Utilisez deux groupes de 12 souris BALB/c un mois naïf détenus dans les hottes sous pression d’air positive à 24 ° C et nourris ad libitumde la nourriture.
  3. Inculquer les aliquotes de sperme Chagas positif humains (100 µL) dans le péritoine et égales dans le vagin de souris du groupe A.
  4. Inculquer les aliquotes de sperme contrôle exempt de Chagas (100 µL) dans le péritoine et un montant égal dans le vagin de souris du groupe-B.
  5. Sacrifier les souris expérimentales sous anesthésie, cinq semaines après les instillations de sperme et les coupes de tissus de la coloration à l’hématoxyline-éosine.
  6. La microscopie permet de rechercher des trypomastigotes T. cruzi et amastigotes dans le coeur, le muscle squelettique et les organes reproducteurs dans des groupes de souris.

8. transmission de l’infection par T. cruzi par rapports sexuels

  1. Utilisez la souris BALB/c six semaines 10 mâles et femelles dans les expériences.
  2. Inoculer 5 mâles et cinq femelles par voie intrapéritonéale avec 1 x 105 T. cruzi trypomastigotes de la culture de tissus.
  3. Reproduire les souris jusqu'à l’âge de trois mois : groupe j’ai sera formée par cinq T. cruzi-souris femelles infectées et cinq contrôle camarades masculins infectés ; groupe II sera formé par cinq T. cruzi -infecté mâle et cinq contrôle infectés femelle s’accouple. Groupe III sera formé de cinq hommes et cinq femmes contrôle naïf non infecté mates.
  4. Maison chaque couple dans une cage placée à l’intérieur d’un coffre avec une porte de grille et de lock-in de 5 mm pour empêcher la fuite de reproducteur.
  5. Nourrir les souris chow et eau ad libitum. Lever un total de 70 descendants dans les groupes II et j’ai le sevrage pendant au moins six semaines.
  6. Prélever du sang par ponction cardiaque de la parentale (FO) et la souris de descendants (F1) sous anesthésie, sacrifier les souris et soumettre des sections du coeur, le muscle squelettique et des organes reproducteurs pour analyse pathologique.

9. évaluation du privilège immunitaire

  1. Obtenir des tissus de T. cruzi-infectés et contrôler la souris (étape 8,6) naïf et couper les échantillons de paraffine en coupes épaisses de 4 µm.
  2. Enlever la paraffine et déshydrater les sections sur les lames de verre avec plusieurs changements de xylène et graduées lavages avec de l’éthanol 100 % à 70 %, de 1 min chacun.
  3. Incuber les coupes de tissus avec 0,05 % de saponine une seule fois, suivie de trois lavages de l’eau distillée à température ambiante.
  4. Bloquer les coupes de tissus avec 5 % de lait en poudre pour 45 min. Lavez les diapositives de 0,1 M PBST et incuber les sections avec le Chagas souris anti-T. cruzi sérum ou avec du sérum de souris de contrôle non infecté à un 01:20 dilution pendant 2 h.
  5. Lavez les diapositives trois fois pendant 5 min dans du PBST et sec à la température ambiante avant l’incubation avec une dilution de 1 : 1 000 de la anti-souris IgG de lapin de conjugué à la phosphatase alcaline.
  6. Rincer les lames dans le PBST et ajouter 100 µL de diaminobenzidine 3,3' pour une incubation de 5 min, suivie de trois lavages avec PBST et contre-coloration à l’hématoxyline Harris pendant 30 s.
  7. Laver les lames dans l’eau distillée pendant 5 min, les déshydrater à 70 %, 80 %, 90 % et 100 % éthanol pendant 1 min et montez-les en glycérine tamponnée.
  8. Examiner les diapositives avec un microscope optique lumineux-zone et capturer des images de photo avec une micro-caméra avec logiciel et un programme d’analyseur.
  9. Le document le privilège immunitaire du parasite en l’absence de réactions inflammatoires dans les organes reproducteurs.

10. statistical analyses

  1. Utilisation biomédicale Edit pour analyse de la séquence, d’exécuter des alignements avec BLAST et déterminer la signification statistique de E-valeur (p < 0,05).
  2. Effectuer une analyse de variance (ANOVA) et le test de Tukey à comparer l’OD signifie plus ou moins les écarts-types.

Résultats

Cette recherche, menée selon le protocole, qui vise à détecter les cas aigus de la maladie de Chagas par des examens cliniques et parasitologiques. Échantillons de sang veineux ont été soumis à l’examen microscopique direct et de la culture in vitro pour la croissance du parasite. Vingt et un cas aigus de la maladie de Chagas a montré de T. cruzi dans le sang. Le protocole de recherche obtenu l’isolement de T. cruzi ECI1-ECI21 de la maladie de Chagas aiguë, ...

Discussion

Ici, nous discutons un protocole de recherche axée sur la famille qui ont répondu à la question de savoir si trypanosomiase humaine découle sexuellement intraspécifique T. cruzi infections. Les premières études ne pouvaient pas fournir la preuve de la transmission sexuelle des infections de T. cruzi , probablement parce que les données disponibles et des informations sur la maladie de Chagas ont été obtenus séparément de l’individuel3,4<...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Nous reconnaissons les installations de laboratoire et les commentaires critiques de Izabela Dourado, Carla Araujo et habile Gomes et l’assistance technique de Bruno Dalago et Rafael Andrade. Nous sommes reconnaissants à la Fondation pour l’avancement des sciences (FAPDF), le Conseil National de recherches, ministère de la Science et de technologie (CNPq/MCT) et l’agence de formation des ressources humaines, ministère de l’éducation (CAPES / ME), Brésil, pour soutenir ces enquêtes.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
BCIP and NBT redox systemSigma-Aldrich681 451 001
Blood DNA Purification columnsAmersham Biosciences27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.  Perkin Elmer  BLU012H
DNA, Solution Salt Fish SpermAMRESCO064-10G
dNTP Set, 100 mM SolutionsGE Healthcare28-4065-51
Eco RIInvitrogen15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugatedSouthern Biotech       2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugatedBiocompareMB5198020
Hybond – N+ nylon membraneGE HealthcareRPN303B
Hybridization ovenThomas Scientific95-0031-02
Micro imaging software cell Sens softwareOlympus, Japan
Molecular probes labeling SystemInvitrogen700-0030
Nsi ISigma-AldrichR5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin KitGE Healthcare28-9042-70
Plate reader Bio-Tek GmBH2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugatedSigma-AldrichA9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugatedSigma-AldrichF8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugatedSigma AldrichA2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugatedBioradMCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fineSigma-AldrichG25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase RecombinantInvitrogen11615-010
Thermal cycler systemBiorad, USA1709703
Vector SystemsPromegaA1380

Références

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 437-446 (2017).
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