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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'agente di Trypanosoma cruzi di malattia di Chagas produce infezioni asintomatiche di lunga durata che improvvisamente trasformarsi in patologia clinicamente riconosciuta. Il seguente protocollo di ricerca descrive uno studio epidemiologico a breve termine basati sulla famiglia per svelare il T. cruzi infezione sessualmente trasmessa dal padre alla progenie.

Abstract

Tripanosomiasi americana è trasmesso agli esseri umani da bug triatomine attraverso l'ingestione di alimenti contaminati, da trasfusioni di sangue o accidentalmente in ospedali e laboratori di ricerca. Inoltre, l'infezione di Trypanosoma cruzi è trasmesso congenitamente da una madre chagasic alla prole, ma il contributo del partner maschile alla contaminazione nell'utero è sconosciuto. I risultati di nidi e ciuffi di amastigoti e tripomastigoti nelle cellule del theca dell'ovaia, nel goniablasts e nel lume del tubulo seminifero suggeriscono che T. cruzi infezioni vengono trasmesse sessualmente. Il protocollo di ricerca questo documento presenta i risultati di una popolazione di studio della famiglia risultati parassita nucleare del DNA in cellule mononucleari del sangue diploide e i gameti aploidi dei soggetti umani. Così, tre indipendenti campioni biologici raccolti un anno parte confermato che T. cruzi infezioni sessualmente sono stati trasmessi alla progenie. Interessante, lo specifico anticorpo di T. cruzi era assente nella maggior parte della famiglia progenie che portava la tolleranza immunitaria all'antigene di parassita. Tolleranza immunologica è stata dimostrata in refrattario alla T. cruzi di pollo dopo la prima settimana di sviluppo embrionale, e pulcini nati da uova inoculate flagellati erano in grado di produrre l'anticorpo specifico. Inoltre, l'instillazione dello sperma umano eiacula intraperitonealmente o nella vagina di topi ingenuo ha reso T. cruzi amastigoti nel epididimo, tubulo seminifero, deferenti e tuba uterina con un'assenza di infiammatoria reazioni negli organi immuni privilegiati della riproduzione. L'allevamento di T. cruzi-infetti topi maschi e femmine con i compagni di ingenuo ha provocato acquisizione delle infezioni, che più successivamente sono stati trasmessi alla progenie. Di conseguenza, un robusto programma di formazione, informazione e comunicazione che coinvolge la popolazione e le organizzazioni sociali è ritenuto necessario per prevenire la malattia di Chagas.

Introduzione

Il protozoo parassita Trypanosoma cruzi appartenente alla famiglia Trypanosomatidae subisce le fasi del ciclo di vita trypomastigote e amastigote in ospiti mammiferi ed esiste come epimastigotes nel vettore di insetto (Reduviid: eziologico) dell'intestino e in coltura. Negli ultimi decenni, diversi studi hanno dimostrato la presenza di malattia di Chagas in paesi su quattro continenti considerato bug triatomine gratis1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; la dispersione dei tripanosomi americane inizialmente è stata attribuita agli immigrati latino-americani all'emisfero nordico, ma la possibilità che alcuni sono casi autoctoni di malattia di Chagas non può essere negata3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. la fonte endogena solo riconoscibile di trasmissione di T. cruzi è stata attribuita al trasferimento della madre chagasic del parassita alla prole in circa il 10% delle gravidanze15; contributo del partner maschile nell'utero infezioni attraverso lo sperma eiacula è rimasto non riconosciuto.

Più di un secolo fa, gli investigatori16,17 osservato intracellulare T. cruzi amastigoti nelle cellule del theca dell'ovaia e nel germe linea cellule dei testicoli dei casi acuti di malattia di Chagas. I nidi e ciuffi di T. cruzi tripomastigoti e amastigoti in cellule del theca dell'ovaia, in goniablasts e nel lume del tubulo seminifero (Figura 1) di casi di malattia di Chagas acuti mortali sviluppano privilegio immune negli organi di riproduzione in assenza dell'infiammatorio si infiltra in18,19. Negli ultimi decenni, alcuni studi sperimentali hanno dimostrato nidi delle forme rotonde amastigote di T. cruzi nel tubulo seminifero, epididimo e dotto deferente anche come in utero, ovaia e tubi di cellule della teca di acutamente infettate topi 1,20,21,22. Inoltre, nel corso di studi della famiglia per documentare il trasferimento di protozoo il DNA mitocondriale parentale Chagas pazienti ai loro discendenti, T. cruzi DNA nucleare (nDNA) è stato verificato in germinale aploide umana linea cellule23, e fasi di ciclo di vita del parassita sono stati osservati nell'eiacula di chagasic topi24. Questi risultati sono in accordo i rapporti sulla tolleranza immunitaria conseguito con la progenie di T. cruzi -infettati padroni di casa in assenza di anticorpo specifico1,25,26. Inoltre, rapporti epidemiologici che ha suggerito la diffusione della malattia di Chagas endemica per gli altri continenti3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 sono ora supportati dagli studi sperimentali mostrano che la malattia di Chagas possa essere trasmessa sessualmente1 . La ricerca attuale presenta un protocollo di studio epidemiologico della famiglia e mostra che T. cruzi infezione si propaga attraverso i rapporti sessuali.

Protocollo

L'essere umano e i comitati di ricerca animale della facoltà di medicina dell'Università di Brasilia ha approvato tutte le procedure con soggetti umani e animali da laboratorio, rispettivamente, nei protocolli di ricerca 2500.167567 e 10411/2011. Il comitato etico di pubblico Ospedale Fondazione Gaspar Vianna (protocollo n º 054/2009 e CONEP 11163/2009) ha approvato i moduli di consenso libero per lo studio sul campo, con estensione al Ministero della salute Commissione nazionale sulla ricerca umana (CONEP 2585/04). Il protocollo è stato adeguato per valutare T. cruzi del DNA nelle cellule mononucleari del sangue diploide e nei gameti aploidi di sperma eiacula. Gli animali di laboratorio hanno ricevuto assistenza umana; i topi, sottoposti a cuore puntura prima del sacrificio, erano sotto anestesia.

1. reclutamento dei partecipanti umani

  1. Garantire che il team di ricerca partecipa in un programma di malattia di Chagas sistema salute per fornire assistenza sanitaria ai pazienti di Chagas.
  2. Reclutare i partecipanti umani da famiglie iscritti al programma, mostrando in almeno un caso con febbre, malessere, mal di testa, tachicardia e l'edema, i principali sintomi clinici del Chagas acuta malattia14.
  3. Fornire assistenza sanitaria al popolo nelle famiglie Studio per un periodo di cinque anni.
  4. Ottenere 15 mL di sangue venoso da partecipanti allo studio in tre occasioni un anno di distanza, dividere il campione in tre aliquote di 5 mL e conservarli in frigorifero a 4 ° C.
  5. Raccogliere 2 mL dello sperma eiacula da familiari volontari adulti e procedere come descritto al punto 3.3.

2. crescita dei parassiti

  1. Utilizzando l'aliquota dal passaggio 1.4, mescolare il sangue con 5 unità di eparina sodica anticlotting; fare una cultura di pendio tramite l'inoculazione di sangue da famiglia partecipanti con la diagnosi della malattia di Chagas acuta.
    1. Inoculare 5 mL di sangue non coagulato in un'inclinazione di agar-sangue di 50 mL tappo a vite tubo plus 5 mL di mezzo di infusione del fegato-Triptosio (LIT) e incubare il campione in uno shaker a 27 ° C per 3 mesi.
    2. Mettere 100 µ l del surnatante mezzo sopra lastre di vetro, coprire con scivolate e ricerca del sangue epimastigotes di T. cruzi sotto il microscopio, ogni quattro settimane.
    3. Raccogliere gli isolati di epimastigote nel surnatante di axeniche LIT medio a 27 ° C; lavare le cellule in PBS pH 7.4, centrifugare a 1.000 x g per 10 min; diluire il epimastigotes nel pellet in 5 mL di mezzo essenziale di Dulbecco modificato (DMEM).
    4. Inoculare i matracci di cultura di L6 muscolo cellule confluenti con 1 x 106 ECI1-a-ECI21 T. cruzi epimastigote isola.
    5. Crescere il T. cruzi ECI1-a-ECI21 e i tripomastigoti archetipo di Berenice in colture di cellule di muscolo L6 in matracci di cultura di 75 mL.
    6. Nutrire le cellule con 15 mL di DMEM a pH 7,4 completati con 5% di siero bovino fetale, 100 UI/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, 250 nM L-Glutammina e 5% CO2 a 37 ° C1.
    7. Utilizzare il controllo positivo T. cruzi Berenice tripomastigoti al fenotipo ECI1-a-ECI21 isolati dalla coltura del tessuto, come descritto al punto 5.2.
    8. Crescere il controllo negativo Leishmania braziliensis27 in DMEM completate con 20% siero bovino fetale solo e utilizzare i promastigotes parassita come controllo negativo.
    9. Utilizzare 1 x 106 T. cruzi ECI1-a-ECI21 tripomastigoti nel surnatante da coltura delle cellule per infettare i topi.
    10. Ricerca di T. cruzi tripomastigoti nel sangue coda dopo la prima settimana dell'infezione.
    11. Cerca i nidi di amastigoti in ematossilina-eosina macchiato sezioni del cuore, muscolo scheletrico e gli organi riproduttivi dei topi infetti, un mese da allora in poi.

3. DNA estrazione e analisi PCR

  1. Posizionare 5 mL di sangue (passo 1.4) aliquota in una sterile provetta EDTA ed effettuare centrifugazione in gradiente di densità per 45 min a 3.000 x g. Utilizzare una pipetta per raccogliere le cellule mononucleari dalla fase biancastra sopra le cellule rosse, lavare i globuli bianchi due volte in 5 mL di PBS, pH 7.4, mediante centrifugazione per 10 min a 1.500 x g in un tubo diverso da 15 mL e utilizzare le cellule per l'estrazione di DNA.
  2. Estrarre il DNA da ECI-1 a ECI-21 T. cruzi, dal controllo positivo Berenice T. cruzi, dal controllo negativo L. braziliensis (passo 2.1.8) e dalle cellule mononucleari di sangue di prova della famiglia umana 109 studiare soggetti1 , 27 , 28.
  3. Diluire 2 mL di sperma campioni ottenuti nel passaggio 1.5 in DMEM (1:4, v/v); Incubare per 45 min a 5% CO2 e 37 ° C, recuperare gli spermatozoi dal surnatante dopo centrifugazione per 5 min a 13.000 x ged estrarre il DNA aploide23.
  4. Posizionare 1 mL delle cellule nel tampone di estrazione (10 µM NaCl, 20 µM EDTA, 1% SDS, 0,04% proteinasi-K e 1% dithiothreitol) e mescolare le soluzioni di inversione e agitazione.
    1. Centrifugare le soluzioni per 10 min a 13.000 x g e a 25 ° C e trasferire il surnatante viscoso a una colonna di spin.
    2. Centrifugare la colonna di spin per 1 min a 10.000 x g e gettare l'eluato; aggiungere 500 µ l di tampone di associazione alla colonna di spin (Tabella materiali), e centrifugare per 1 min a 12.000 x ge scartare l'eluato.
    3. Aggiungere 600 µ l di tampone di lavaggio per la colonna di spin, e centrifugare per 1 min a 12.000 x ge scartare l'eluato.
    4. Ripetere questo passaggio due volte e trasferimento alla colonna di spin in una provetta da centrifuga micro sterili da 1,5 mL.
    5. Aggiungere 100 µ l di buffer di TE, incubare la provetta a temperatura ambiente per 2 min e poi Centrifugare la provetta per 1 min a 12.000 x g. Il tampone nel tubo del microcentrifuge contiene il DNA.
    6. Misurare le concentrazioni di DNA eseguendo le aliquote su gel di agarosio 0.8% e leggendo l'assorbanza a 260 nm con uno spettrofotometro. Conservare i campioni di DNA a-20 ° C fino all'utilizzo nell'analisi PCR.
  5. Uso T. cruzi Tcz1/2 primer ricotto alla sequenza specifico 188-nt specifico del telomero sonda29 ed eseguire la PCR con DNA da sangue e sperma degli oggetti di studio della famiglia, da controllo positivo Berenice T. cruzi e dalla L. braziliensis controllo negativo.
    1. Preparare la miscela PCR con 10 ng di DNA campione, 0,4 µM di ciascuna coppia di primer, 2 U di Taq DNA polimerasi, 0,2 µM dNTP e 15 µM MgCl2 in un volume finale di 25 µ l.
    2. Avviare il programma di amplificazione del DNA a 94 ° C per 30 s per denaturare il modello e raffreddare i campioni a 55 ° C per 30 s. Quindi, incubare i campioni a 94 ° C per 90 s di estendere i primer Ricotti. La temperatura di ritorno a 94 ° C per 30 s per iniziare il ciclo successivo e incubare i campioni altri 3 min a 72 ° C. Alla fine del ciclo 32nd , raffreddare i campioni per 10 min a temperatura ambiente e conservarli in frigorifero a 4 ° C29.
    3. Amplificare una sequenza di ripetizione del telomero T. cruzi DNA temprata al Tcz1/2 primer alle due estremità.
    4. Analizzare i prodotti di amplificazione su gel di agarosio 1,3% e osservare le bande di DNA 188-nt un UV-illuminatore.

4. l'ibridazione del sud

Nota: L'ibridazione del sud era utilizzato per scartare la maggior parte degli ampliconi PCR positivi falsi nel gel dell'agarosi.

  1. Sottoporre i prodotti di amplificazione di PCR da comandi non infetti, da Chagas casi controlli positivi, da 109 campioni di DNA diploide e dal DNA aploide di 21 studio familiare ai partecipanti di ibridazioni del sud .
  2. Impiegare la sonda di sequenza del telomero di DNA specifico di T. cruzi 188-nt ricottura per il Tcz1/2 iniettori indicati; etichettare la sonda con [α -32P] 2'-deossiadenosina trifosfato (dATP) utilizzando un kit di contrassegno dell'iniettore casuale e analizzare i prodotti di amplificazione su gel di agarosio 1,3% a 60 V durante la notte a 4 ° C.
  3. Trasferire il gel ad una membrana di nylon positivamente caricato utilizzando il metodo capillare durante la notte.
  4. Ibridare le bande di DNA trasferite alla membrana di nylon con la sonda radioattiva 188-nt, che lega il digest di EcoR1 del DNA genomic in 25 µ l di buffer di enzima specifico per periodi variabili.
  5. Lavare la membrana due volte per 15 min a 65 ° C con 2 x SSC e 0.1% di SDS.
  6. Esporre le pellicole di raggi x per la membrana di nylon e autoradiograph le bande sulla membrana per una settimana.
  7. Crescere i cloni selezionati da PCR e del sud di ibridazione con i prodotti di amplificazione di PCR di T. cruzi , che sono ibridato con la sonda di DNA radioattiva specifica.
  8. In commercio sequenza i cloni utilizzando i primers Tcz1/2 impostati ricotti a specifici del telomero2,impronta da T. cruzi -23.

5. analisi immunologiche

Nota: La sensibilità e la specificità dell'immunofluorescenza indiretta (IIF) e dell'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) sono stati valutati nel siero da sei pazienti di Chagas con parassitemia dimostrabile e da sei privo di Chagas, compararli siero campioni di banca. Le analisi condotte con le diluizioni doppie del siero in PBS, pH 7.4, ha rivelate che il IIF alle diluizioni 1: 100 ed ELISA densità ottiche (ODs) a 0,150 e sopra separati il positivo dai risultati negativi.

  1. Utilizzare 5 mL di sangue non coagulato aliquota (passo 1.4) conservato a temperatura ambiente per 1 h ed e centrifugare a 1.500 x g per 30 min separare il siero nel surnatante.
  2. Eseguire IIF ed ELISA in triplice copia 1: 100 diluizioni del siero per rilevare gli antigeni T. cruzi e L. braziliensis , come descritto in precedenza28.
  3. IIF
    1. Condurre l'analisi IIF in diluizioni del siero triplici di campioni degli oggetti di 109 studio ottenuti in tre occasioni un anno apart.
    2. Posto 5 sospensioni µ l di formalina 1% - trattati di T. cruzi epimastigotes o L. braziliensis promastigotes su vetrini; Lasciate il pernottamento asciutto di parassiti in una cappa a temperatura ambiente e conservare i vetrini a-20 ° C fino all'utilizzo.
    3. Posto 20 µ l di diluizioni del siero dei pazienti sopra lastre di vetro rivestito con 5 µ l del epimastigotes di T. cruzi formalina-ucciso (10 parassiti / µ l) o L. braziliensis promastigotes.
    4. Incubare il vetrino di vetro coperto con una scivolata per 1h in una camera umida a 37 ° C e lavare tre volte con PBS.
    5. Incubare il vetrino asciugato ad aria con una diluizione di 1:1,000 di un anticorpo di coniglio della fluorescina-etichettati (Tabella materiali) IgG umani per 1h a 37 ° C; lavare e asciugare il vetrino.
    6. Montare il vetrino con un vetrino coprioggetto ed esaminarlo sotto un microscopio a luce UV.
      Nota: Un esame positivo è un verde mela T. cruzi epimastigote sagoma, mostrato nel video.
  4. ELISA
    1. Eseguire un test ELISA per rilevare il T. cruzi e L. braziliensis gli antigeni solubili (1 µ g/100 µ l in tampone carbonato di 0,1 M, pH 9,6) su micropiastra pozzetti.
    2. Incubare le diluizioni del siero di 1: 100 in triplice copia pozzetti per 2 h a temperatura ambiente.
    3. Lavare le piastre tre volte con PBST (PBS contenente 0.5% Tween-20), pH 7,4, soluzione prima dell'essiccazione.
    4. Incubare le piastre con 50 µ l di una diluizione di 1:1,000 di anticorpo di IgG anti-umano di coniglio per 90 min a 37 ° C.
    5. Lavare le piastre tre volte con soluzione PBST e lasciarli asciugare a temperatura ambiente.
    6. Incubare le piastre con 100 µ l di 1:1,000 diluizioni di anti-coniglio capra coniugato di fosfatasi alcalina IgG (Tabella materiali) per 90 min a 37 ° C.
    7. Lavare le piastre tre volte con PBST, aggiungere il fosfato di substrato p-nitro fenil e attendere lo sviluppo del colore.
    8. Leggere l'ODs a 630 nm in un lettore multimodale.
    9. Eseguire la triplice copia diluizioni del siero del test dalla popolazione dello studio e tracciare l'ODs per identificare lo specifico T. cruzi anticorpali.

6. Le valutazioni di tolleranza immune

Nota: Un sistema di modello di pollo è stato utilizzato per testare il T. cruzi infezioni dopo la prima settimana dello sviluppo embrionale.

  1. Inoculare le uova fertili di pollo con 100/10 µ l T. cruzi tripomastigoti raccolte dal terreno di coltura del tessuto; Inoculare il finto controllo uova con 10 T. cruzi tripomastigoti per µ l di terreno di coltura. Sigillare il foro con del nastro adesivo.
  2. Incubare uova di 20 T. cruzi -infettato e un numero uguale di uova fertili di controllo finto a 37 ° C e 65% di umidità per 21 giorni.
  3. Tenere che si schiudono i pulcini nell'incubatrice per 24 h e, successivamente, a 32 ° C in cappe con controllo della temperatura per tre settimane.
  4. Crescere i pulcini nati da uova di T. cruzi -inoculato e da uova di finto controllo alla fase adulta in una camera di pressione aria positiva a 24 ° C, in gabbie individuali collocate nei corridoi separati.
  5. Sfida tutti i pulcini adulti tre volte in sei mesi di età con 107 formalina-ucciso tripomastigoti iniettati per via sottocutanea, settimanale, secondo lo schema nel video.
  6. Prelevare il sangue da una vena di ala di pollo covato dalle uova T. cruzi -inoculato e dai controlli finti quattro settimane dopo l'ultima immunizzazione per ottenere il siero.
  7. Utilizzare il siero di pollo per rilevare lo specifico anticorpo di T. cruzi di IIF ed ELISA come descritto al punto 5 del protocollo.

7. infezione dei topi con T. cruzi da sperma di Chagas patients' eiacula

  1. Utilizzare l'eiacula sperma da un paziente di malattia di Chagas PCR + adulto (passo 1.5) e da un individuo adulto PCR - Chagas-free.
  2. Utilizzare due gruppi di 12 topi BALB/c ingenua di un mese-vecchio tenuto in cappe sotto pressione d'aria positiva a 24 ° C e nutriti cibo ad libitum.
  3. Le aliquote di sperma umane Chagas-positivi (100 µ l) infondere il peritoneo e quantità uguali nella vagina di gruppo-A topi.
  4. Instillare le aliquote di sperma (100 µ l) di controllo privo di Chagas in peritoneo e una pari quantità nella vagina dei topi del gruppo-B.
  5. Sacrificare i topi sperimentali nell'ambito dell'anestesia cinque settimane dopo le instillazioni di sperma e le sezioni di tessuto in base alla colorazione con ematossilina-eosina.
  6. Microscopia di uso per la ricerca di T. cruzi tripomastigoti e amastigoti nel cuore, muscolo scheletrico e gli organi riproduttivi nei gruppi di topi.

8. trasmissione del il T. cruzi infezione da richieste

  1. Utilizzare 10 topi BALB/c sei-settimana-vecchio maschii e femminili negli esperimenti.
  2. Inoculare 5 di sesso maschile e femminili cinque topi intraperitonealmente con 1 x 105 T. cruzi tripomastigoti dalla coltura del tessuto.
  3. Allevare i topi fino a tre mesi di età: gruppo sarà formata da cinque T. cruzi-topi femminili infetti e cinque controllare maschio si accoppia non infette; gruppo II sarà formato da cinque T. cruzi -infettati maschio e cinque controllare compagni femminili non infette. Gruppo III sarà formato da cinque maschi e compagni di controllo femminile cinque ingenuo non infetto.
  4. Casa ogni allevamento coppia in una gabbia posizionata all'interno di una cassetta di sicurezza con una porta di griglia e lock-in 5 mm per impedire la fuga.
  5. Nutrire i topi chow e acqua ad libitum. Raccogliere un totale di 70 svezzamento progenie in gruppi II e io per almeno sei settimane.
  6. Prelievo di sangue dalla puntura di cuore dal parentale (FO) e topi di progenie (F1) nell'ambito dell'anestesia, sacrificare i topi e presentare sezioni del cuore, muscolo scheletrico e gli organi riproduttivi per l'analisi patologica.

9. valutazione di privilegio immune

  1. Ottenere tessuti da T. cruzi-infettati e ingenuo controllare topi (passo 8,6) e tagliare i campioni paraffina-incastonati in 4 sezioni di spessore µm.
  2. Rimuovere la paraffina e disidratare le sezioni su vetrini con diversi cambiamenti di xilene e graduate lavaggi con etanolo 100% al 70%, per 1 min ciascuna.
  3. Incubare le sezioni di tessuto con saponina 0.05% una volta, seguita da tre lavaggi di acqua distillata a temperatura ambiente.
  4. Bloccare le sezioni di tessuto con 5% senza grassi del latte in polvere per 45 min. lavare i vetrini in 0.1 M PBST e incubare le sezioni con il Chagas mouse anti-T. cruzi nel siero o con il siero di controllo non infetto del mouse a un 01:20 diluizione per 2 h.
  5. Lavare i vetrini tre volte per 5 min in PBST e asciutto a temperatura ambiente prima dell'incubazione con una diluizione di 1:1,000 di IgG di anti-topo coniglio coniugato di fosfatasi alcalina.
  6. Sciacquare i vetrini in PBST e aggiungere 100 µ l di 3,3' diaminobenzidina per un'incubazione di 5 min, seguita da tre lavaggi in PBST e colorazione con ematossilina di Harris per 30 s.
  7. Lavare i vetrini in acqua distillata per 5 min, li disidratano in 70%, 80%, 90% ed etanolo al 100% per 1 min e montarli in Glicerina tamponata.
  8. Esaminare i vetrini con un microscopio a campo chiaro e catturare immagini fotografiche con una microcamera con software e un programma analizzatore.
  9. Documentare il privilegio immune del parassita in assenza di reazioni infiammatorie negli organi riproduttivi.

10. statistiche analisi

  1. Utilizzare Edit biomedica per l'analisi di sequenza, eseguire allineamenti con BLAST e determinare la significatività statistica E-value (p < 0,05).
  2. Eseguire un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) e il test di Tukey per confrontare il OD significa più o meno deviazioni standard.

Risultati

La ricerca, condotta secondo il protocollo, mirato a rilevare casi acuti della malattia di Chagas dagli esami clinici e parassitologici. Campioni di sangue venosi sono stati sottoposti a esame microscopico diretto e coltura in vitro per la crescita del parassita. Ventuno casi acuti della malattia di Chagas ha mostrato T. cruzi nel sangue. Il protocollo di ricerca protetto l'isolamento di T. cruzi ECI1-ECI21 da acuta malattia di Chagas, e il DNA campioni esposti orme di D...

Discussione

Qui, discutiamo un protocollo di ricerca basate sulla famiglia che ha risposto alla domanda di se la malattia di Chagas umana deriva dalla sessualmente trasmissibili intraspecie T. cruzi infezioni. Primi studi non potevano fornire la prova della trasmissione sessuale di T. cruzi infezioni, probabilmente perché i dati disponibili e le informazioni sulla malattia di Chagas sono stati ottenuti separatamente dai singoli3,4,

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Riconoscimenti

Riconosciamo le strutture di laboratorio e i commenti critici di Izabela Dourado, Carla Araujo e Gomes intelligente e l'assistenza tecnica di Bruno Dalago e Rafael Andrade. Siamo grati alla Fondazione per l'avanzamento di scienza (FAPDF), il Consiglio nazionale delle ricerche, Ministero della scienza e tecnologia (CNPq/MCT) e l'Agenzia per la formazione delle risorse umane, Ministero della pubblica istruzione (CAPES / ME), Brasile, per il supporto di questi indagini.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
BCIP and NBT redox systemSigma-Aldrich681 451 001
Blood DNA Purification columnsAmersham Biosciences27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.  Perkin Elmer  BLU012H
DNA, Solution Salt Fish SpermAMRESCO064-10G
dNTP Set, 100 mM SolutionsGE Healthcare28-4065-51
Eco RIInvitrogen15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugatedSouthern Biotech       2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugatedBiocompareMB5198020
Hybond – N+ nylon membraneGE HealthcareRPN303B
Hybridization ovenThomas Scientific95-0031-02
Micro imaging software cell Sens softwareOlympus, Japan
Molecular probes labeling SystemInvitrogen700-0030
Nsi ISigma-AldrichR5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin KitGE Healthcare28-9042-70
Plate reader Bio-Tek GmBH2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugatedSigma-AldrichA9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugatedSigma-AldrichF8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugatedSigma AldrichA2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugatedBioradMCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fineSigma-AldrichG25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase RecombinantInvitrogen11615-010
Thermal cycler systemBiorad, USA1709703
Vector SystemsPromegaA1380

Riferimenti

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
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