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Neste Artigo

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Resumo

O Trypanosoma cruzi agente da doença de Chagas produz duradouro infecções assintomáticas que se desenvolvem abruptamente em patologia clinicamente reconhecida. O protocolo de pesquisa a seguir descreve um curto prazo baseada na família epidemiológico estudo para desvendar a T. cruzi infecção transmitida sexualmente da mãe à progênie.

Resumo

Tripanossomíase americana é transmitida aos seres humanos por insetos triatomíneos através da ingestão de alimentos contaminados, por transfusão de sangue ou acidentalmente em hospitais e laboratórios de pesquisa. Além disso, a infecção Trypanosoma cruzi é transmitida congenitamente de uma mãe chagásica, a sua prole, mas contribuição do parceiro masculino de contaminação no útero é desconhecida. Os achados de ninhos e aglomerados de amastigotes e de trypomastigotes nas células do ovário theca, no goniablasts e no lúmen dos túbulos seminíferos sugerem que infecções de T. cruzi são transmitidas sexualmente. O protocolo de pesquisa neste documento apresenta os resultados de uma população de estudo família mostrando parasita DNA nuclear, as células mononucleares do sangue diploide e os gametas haploides de assuntos humanos. Assim, três amostras biológicas independentes coletadas um ano separados confirmaram que T. cruzi infecções sexualmente foram transmitidas à descendência. Curiosamente, o específico do anticorpo de T. cruzi foi ausente na maioria de descendência familiar que gerou tolerância imunológica para o antígeno do parasita. Tolerância imunológica foi demonstrada em frango refratário para T. cruzi após a primeira semana de crescimento embrionário e pintos nascidos de ovos flagellate-inoculados foram incapazes de produzir o anticorpo específico. Além disso, a instilação do sêmen humano ejacula intraperitonealmente ou na vagina de ratos ingênuos rendido amastigotes de T. cruzi no epidídimo, tubo seminífero, ducto deferente e tuba uterina, com ausência de inflamação reações nos órgãos imunes privilegiados de reprodução. A criação do T. cruzi-infectados de ratos masculinos e femininos com companheiros de ingênua resultaram na aquisição das infecções, que mais tarde foram transmitidas aos descendentes. Portanto, um programa robusto de educação, informação e comunicação que envolve a população e organizações sociais é considerado necessário para prevenir a doença de Chagas.

Introdução

O protozoário parasita Trypanosoma cruzi pertencentes à família t sofre trypomastigote e amastigotas estágios do ciclo de vida em hospedeiros mamíferos e existe como avaliação do inseto-vetor (Reduviid: Triatominae) intestino e em cultura axénica. Nas últimas décadas, vários estudos têm demonstrado a presença da doença de Chagas em países em quatro continentes consideradas alóctones bug livre1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. o; a dispersão de tripanosomas americanas foi inicialmente atribuída aos imigrantes latino-americanos para o hemisfério norte, mas a possibilidade de que alguns são casos autóctones da doença de Chagas já não pode ser negada3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. somente reconhecível endógena fonte de T. cruzi transmissão tenha sido atribuída a transferência da mãe chagásica do parasita para a prole em aproximadamente 10% das gestações15; contribuição do parceiro masculino para infecções no útero através de ejacula sêmen manteve-se não reconhecida.

Mais de um século atrás, os investigadores16,17 observadas intracelular de T. cruzi amastigotes nas células do ovário theca e no germe linha células dos testículos de casos agudos da doença de Chagas. Os ninhos e grupos de T. cruzi trypomastigotes e amastigotes em células theca do ovário, no goniablasts e no lúmen dos túbulos seminíferos (Figura 1) de casos de doença de Chagas agudos mortais desenvolvem imune privilégio nos órgãos de reprodução na ausência de inflamatório infiltra18,19. Nas últimas décadas, alguns estudos experimentais demonstraram ninhos das formas amastigotas redondo de T. cruzi no tubo seminífero, epidídimo e ducto deferente , bem como no útero, ovário e tubos células theca de ratos infectados agudamente 1,20,21,22. Além disso, no decurso de estudos familiares para documentar a transferência de DNA mitocondrial de pacientes de Chagas dos pais para seus descendentes, T. cruzi DNA nuclear (nDNA) verificou-se em humano haploide germe de células linha23, de protozoários e estágios de ciclo de vida do parasita foram observados a ejacula de chagásicos ratos24. Esses achados estão de acordo com relatórios sobre a tolerância imunológica alcançado pela progenitura de T. cruzi -infectados hosts na ausência de anticorpos específicos1,25,26. Além disso, relatórios epidemiológicos que sugeriram a propagação endêmica da doença de Chagas para outros continentes,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 são suportados por estudos experimentais, mostrando que a doença de Chagas pode ser transmitida sexualmente1 . A presente investigação apresenta um protocolo de estudo epidemiológico de família e mostra que a infecção do T. cruzi se propaga por relações sexuais.

Protocolo

O ser humano e as comissões de pesquisa Animal da faculdade de medicina da Universidade de Brasília aprovaram todos os procedimentos com seres humanos e animais de laboratório, respectivamente, em protocolos de pesquisa 2500.167567 e 10411/2011. O Comitê de ética do público Fundação Hospital Gaspar Vianna (protocolo n. º 054/2009 e 2009/11163 CONEP) aprovou os formulários de consentimento livre para o estudo de campo, com extensão para o Ministério da saúde Comissão Nacional de investigação humana (CONEP 2585/04). O protocolo foi ajustado para avaliar o T. cruzi DNA em células mononucleares de sangue diploides e em gametas haploides de ejacula sêmen. Os animais de laboratório receberam atendimento humano; os ratos, submetidos a punção do coração antes do sacrifício, estavam sob anestesia.

1. o recrutamento dos participantes humanos

  1. Certifique-se de que a equipe de pesquisa participa de um programa de doença de Chagas sistema de saúde para fornecer cuidados de saúde para pacientes de Chagas.
  2. Recrute participantes humanos de famílias inscritas no programa, mostrando pelo menos um caso com febre, mal-estar, dor de cabeça, taquicardia e edema, os principais sintomas clínicos do de doença de Chagas aguda14.
  3. Dar cuidados de saúde ao povo nas famílias estudo por um período de cinco anos.
  4. Obter 15 mL de sangue venoso de participantes do estudo em três ocasiões um ano separados, dividir a amostra em três alíquotas de 5 mL e armazená-los na geladeira a 4 ° C.
  5. Coletar 2 mL de ejacula o sémen adultos voluntários dos membros da família e prossiga conforme descrito no passo 3.3.

2. crescimento de parasitas

  1. Usando a alíquota da etapa 1.4, misturar o sangue com 5 unidades de anticoagulante heparina de sódio; fazer uma cultura de inclinação, a inoculação do sangue da família participantes com diagnóstico de doença de Chagas aguda.
    1. Inocular 5ml de sangue humano coagulado em uma inclinação de ágar-sangue 50 mL tampa de rosca tubo mais 5 mL de meio de infusão-tryptose fígado (LIT) e incubar a amostra em uma coqueteleira a 27 ° C durante 3 meses.
    2. Coloque 100 µ l do sobrenadante meio em cima de lâminas de vidro, cobrir com deslizamentos e busca de sangue T. cruzi avaliação sob o microscópio, a cada quatro semanas.
    3. Colher os epimastigote isolados no sobrenadante de LIT axênico a 27 ° C; lavar as células em pH de PBS 7.4, centrifugar a 1.000 x g por 10 min; Dilua a avaliação na pelota em 5 mL de meio essencial modificado do Dulbecco (DMEM).
    4. Inocular os confluentes frascos de cultura de células de músculo L6 com 1 x 106 ECI1-para-ECI21 epimastigote de T. cruzi isolados.
    5. Cresce o T. cruzi ECI1-para-ECI21 e o trypomastigotes do arquétipo de Berenice em culturas de células de músculo L6 em frascos de cultura de 75 mL.
    6. Alimente as células com 15 mL de DMEM em pH 7,4, suplementado com 5% de soro fetal bovino, penicilina 100 UI/mL, 100 estreptomicina µ g/mL, 250 nM L-glutamina e 5% CO2 a 37 ° C1.
    7. Use o controle positivo trypomastigotes do T. cruzi Berenice para fenótipo ECI1-para-ECI21 isolados de cultura de tecidos, conforme descrito na etapa 5.2.
    8. Crescer o controle negativo de Leishmania braziliensis27 em DMEM suplementado com 20% soro bovino fetal apenas e usar as promastigotas parasita como controlo negativo.
    9. Use 1 x 106trypomastigotes ECI1-para-ECI21 deT. cruzi no sobrenadante de cultura de pilha para infectar camundongos. 
    10. Pesquisar trypomastigotes do T. cruzi no sangue cauda após a primeira semana da infecção.
    11. Procure os ninhos dos amastigotes em hematoxilina-eosina manchado seções do coração, músculo esquelético e órgãos reprodutivos de ratos infectados, um mês depois disso.

3. análises PCR e extração de DNA

  1. Coloque 5 mL de sangue (etapa 1.4) alíquota em um tubo estéril de EDTA e realizar a centrifugação gradiente de densidade de 45 min a 3.000 x g. Use uma pipeta para colher as células mononucleares da fase esbranquiçada acima os eritrócitos, lavar as células brancas, duas vezes em 5 mL de PBS, pH 7,4, por centrifugação por 10min a 1.500 x g em um tubo de 15ml diferentes e usar as células para a extração de DNA.
  2. Extrair o DNA do CSE-1 a CSE-21 T. cruzi, de controlo positivo Berenice T. cruzi, do controle negativo de L. braziliensis (etapa 2.1.8) e de células mononucleares de sangue o teste da família humana 109 estudar assuntos1 , 27 , 28.
  3. Diluir 2 mL das amostras de esperma obtido na etapa 1.5 em DMEM (1:4, v/v); Incubar durante 45 min a 5% de CO2 e 37 ° C, recuperar espermatozoides do líquido sobrenadante após centrifugação por 5 min a 13.000 x ge extrair o ADN haploide23.
  4. Coloque 1 mL de células no buffer de extração (10 µM 1% de NaCl, 20 µM EDTA, SDS, 0,04% protease-K e 1% ditiotreitol) e misture as soluções por inversão e a tremer.
    1. Centrifugar as soluções durante 10 minutos a 13.000 x g e 25 ° C e transferir o sobrenadante viscoso para uma coluna de rotação.
    2. Centrifugue a coluna de volta por 1 min a 10.000 x g e descartar o eluato; Adicionar tampão de ligação 500 µ l para a coluna de rotação (Tabela de materiais), centrifugá-lo durante 1 min a 12.000 x ge descartar o eluato.
    3. Adicionar o tampão de lavagem 600 µ l para a coluna de rotação, centrifugue-lo por 1 min a 12.000 x ge descartar o eluato.
    4. Repita essa etapa duas vezes e transferir a coluna de rotação para um tubo de centrífuga micro estéril 1,5 mL.
    5. Adicione 100 µ l de tampão TE, incubar o tubo em temperatura ambiente por 2 min e centrifugar o tubo por 1 min a 12.000 x g. O buffer no tubo microcentrifuga contém o DNA.
    6. Medir as concentrações de DNA executando alíquotas em um gel de agarose 0,8% e pela leitura da absorvância a 260 nm com um espectrofotômetro. Armazene as amostras a-20 º C até o uso na análise do PCR.
  5. Primers de T. cruzi Tcz1/2 uso recozidos à sequência específica 188-nt específico telômero sonda29 e executar o PCR com DNA de sangue e esperma dos sujeitos do estudo familiar, de controlo positivo Berenice T. cruzi e do L. braziliensis controlo negativo.
    1. Prepare a mistura PCR com 10 modelo ng DNA, 0,4 µM de cada par de primers, 2 U de Taq DNA polimerase, 0,2 µM dNTPs e 15 µM MgCl2 em um volume de final 25 µ l.
    2. Iniciar o programa de amplificação de DNA a 94 ° C por 30 s para desnaturar o modelo e arrefecer as amostras a 55 ° C por 30 s. Em seguida, incubar as amostras a 94 ° C por 90 s para estender os primers recozidos. Retornar a temperatura de 94 ° C por 30 s para iniciar o próximo ciclo e incubar as amostras um adicional 3 min a 72 ° C. No final do ciclo de 32nd , arrefecer as amostras durante 10 minutos à temperatura ambiente e armazená-los na geladeira a 4 ° C29.
    3. Amplifica uma sequência de repetição de telômero do DNA de T. cruzi recozida para os primers Tcz1/2 em ambas as extremidades.
    4. Analisar os produtos de amplificação em um gel de agarose de 1,3% e observar as bandas de DNA de 188-nt um UV-iluminador.

4. hibridação do Sul

Nota: Hibridação do Sul foi usada para descartar a maioria do falso positivo PCR amplicons no gel do agarose.

  1. Submeta os produtos de amplificação do PCR de controles não infectados, de Chagas casos controlos positivos, de 109 amostras de teste de DNA diploide e haploides DNA de estudo 21 participantes familiar para hibridação do Sul .
  2. Empregar a T. cruzi 188-nt DNA específico telômero sequência sonda recozida para os primers Tcz1/2 mostrados; rotular a sonda com [α -32P] 2'-Desoxiadenosina trifosfato (dATP) usando um primer aleatório rotulagem kit e analisar os produtos de amplificação em um gel de agarose de 1,3% em 60 V durante a noite a 4 ° C.
  3. Transferi o gel para uma membrana de nylon positivamente carregado usando o método capilar durante a noite.
  4. Cruzar as bandas de DNA transferidas para a membrana de nylon com a prova radiolabeled 188-nt, que vincula o digere EcoR1 do DNA genômico em 25 µ l de buffer enzima específica por períodos variáveis.
  5. Lave a membrana duas vezes por 15 min a 65 ° C com 2 x SSC e 0,1% SDS.
  6. Expor as películas de raio x para a membrana de nylon e autoradiograph as bandas na membrana por uma semana.
  7. Crescem os clones selecionados de PCR e Southern hibridização com os produtos de amplificação do PCR do T. cruzi , que são cruzadas com a prova de DNA específica radiolabeled.
  8. Comercialmente Sequencie os clones usando os primers Tcz1/2 conjunto recozidos para o T. cruzi -telômero específico pegada2,23.

5. imunológicos ensaios

Nota: A sensibilidade e especificidade da imunofluorescência indireta (IIF) e o ensaio imunoenzimático (ELISA) foram avaliados no soro de seis pacientes de Chagas, com parasitemia demonstrável e de seis Chagas-livre, deidentified soro banco de samples. Os ensaios realizados com as diluições do soro duplo em PBS, pH 7,4, reveladas que o IIF em diluições de 1: 100 e as ELISA densidades ópticas (ODs) em 0.150 e acima separaram o lado positivo dos resultados negativos.

  1. Usar 5 mL de sangue coagulado alíquota (etapa 1.4) mantido em temperatura ambiente durante 1 h e centrifugue a 1.500 x g durante 30 min separar o soro no sobrenadante.
  2. Executar o IIF e ELISA em diluições de soro de 1: 100 triplicado para detectar os antígenos de T. cruzi e L. braziliensis , conforme descrito anteriormente28.
  3. IIF
    1. Realizar o ensaio IIF em diluições do soro triplicado de amostras dos assuntos 109 estudo obtidas em três ocasiões um ano separados.
    2. Coloque 5 suspensões µ l de formalina a 1% - tratamento avaliação de T. cruzi ou promastigotas de L. braziliensis em lâminas de vidro; Deixe-a parasitas secar durante a noite em uma capa à temperatura ambiente e armazenar as lâminas de vidro a-20 ° C até o uso.
    3. Lugar de 20 µ l de diluições do soro dos pacientes em cima de lâminas de vidro revestido com 5 µ l da avaliação de T. cruzi de formalina-matou (10 parasitas / µ l) ou L. braziliensis promastigotas.
    4. Incube a lâmina de vidro coberta com um deslize por 1h em uma câmara úmida a 37 ° C e lavar três vezes com PBS.
    5. Incubar a lâmina de vidro secas ao ar com uma diluição de 1:1,000 de um anticorpo de coelho rotulado de fluoresceína (Tabela de materiais) para IgG humana durante 1 h a 37 ° C; Lave e seque o slide.
    6. Montar o slide com uma lamínula e examiná-la sob um microscópio de luz UV.
      Nota: Um exame positivo é um verde-maçã silhueta epimastigote de T. cruzi , mostrada no vídeo.
  4. ELISA
    1. Execute um ELISA para detectar o T. cruzi e os antígenos solúveis de L. braziliensis (1 µ g/100 μl de tampão de carbonato de 0,1 M, pH 9,6) em poços da microplaca revestida.
    2. Incube as diluições do soro de 1: 100 em triplicado Poços revestidos por 2h, à temperatura ambiente.
    3. Lavar as placas três vezes com PBST (PBS contendo 0.5% Tween-20), pH 7,4, solução antes da secagem.
    4. Incubar as placas com 50 µ l de uma diluição de 1:1,000 de anticorpos IgG anti-humano de coelho para 90 min a 37 ° C.
    5. Lavar as placas três vezes com solução PBST e deixe-os secar à temperatura ambiente.
    6. Incubar as placas com 100 µ l de 1:1,000 diluições de caprinos conjugados a fosfatase alcalina anti-IgG de coelho (Tabela de materiais) para 90 min a 37 ° C.
    7. Lavar as placas três vezes com PBST, adicionar o fosfato de fenil substrato p-nitro e esperar pelo desenvolvimento de cor.
    8. Leia os ODs em 630 nm em um leitor de placa multimodo.
    9. Executar as triplicado diluições do soro teste da população estudada e plotar os ODs para identificar o específico do T. cruzi anticorpos.

6. as avaliações de tolerância imunológica

Nota: Um modelo de sistema de frango foi usado para testar o T. cruzi infecções após a primeira semana do desenvolvimento embrionário.

  1. Inocular ovos férteis de galinha com 10/100 µ l T. cruzi trypomastigotes colhidos em meio de cultura de tecidos; inocule ovos controle simulado com 10 trypomastigotes do T. cruzi por µ l de meio de cultura. Sele o furo com fita adesiva.
  2. Incube 20 T. cruzi -infectadas ovos e um número igual de ovos férteis de controle simulado a 37 ° C e 65% de umidade durante 21 dias.
  3. Manter os filhotes a escotilha na incubadora durante 24 h e, posteriormente, a 32 ° C, na versão com controle de temperatura por três semanas.
  4. Crescem os pintos nascidos de ovos T. cruzi -inoculadas e de ovos de simulação de controle para a fase adulta em um quarto de pressão de ar positiva a 24 ° C, em gaiolas individuais colocadas nos corredores separados.
  5. Desafio todos os filhotes adultos três vezes em seis meses de idade com 107 formalina-matou trypomastigotes injetadas por via subcutânea, semanalmente, de acordo com o esquema no vídeo.
  6. Tirar sangue de uma veia de asa de galinhas que eclodiram a partir os ovos de T. cruzi -inoculadas e dos controles simulados de quatro semanas após a última imunização para obter o soro.
  7. Usar o soro de frango para detectar o específico do anticorpo de T. cruzi por IIF e ELISA, conforme descrito na etapa 5 do protocolo.

7. infecção de ratos com T. cruzi de sêmen dos pacientes de Chagas ejacula

  1. Use a ejacula sêmen de um paciente de doença de Chagas PCR + adulto (passo 1.5) e de um indivíduo adulto PCR - Chagas-livre.
  2. Use dois grupos de 12 um mês de idade BALB/c ingênuo os ratos mantidos em capas sob pressão de ar positiva a 24 ° C e alimentados com comida ad libitum.
  3. Instile as alíquotas de sêmen humanas do Chagas-positivo (100 µ l) no peritônio e quantidades iguais na vagina de ratos do grupo-A.
  4. Instile as alíquotas de sémen de controle livre de Chagas (100 µ l) em peritônio e uma quantidade igual de ratos do grupo B na vagina.
  5. Sacrificar os ratos experimentais sob anestesia cinco semanas após os instillations de sêmen e sujeita as secções de tecido de coloração com hematoxilina-eosina.
  6. Utilização de microscopia para procurar trypomastigotes do T. cruzi e amastigotes no coração, músculo esquelético e órgãos reprodutivos em grupos de ratos.

8. transmissão do a infecção do T. cruzi por relação sexual

  1. Use 10 ratos BALB/c de seis semanas de masculino e femininos nos experimentos.
  2. Inocule cinco machos e cinco ratos fêmeas intraperitonealmente com 1 x 105 T. cruzi trypomastigotes da cultura do tecido.
  3. Os ratos se reproduzem até três meses de idade: grupo que será formado por cinco T. cruzi-ratos fêmeas infectados e cinco controla companheiros masculinos infectados; Grupo II será formado por cinco T. cruzi -infectados masculino e cinco controlar companheiros femininos infectados. Grupo III será formado por cinco machos e cinco fêmeas controle ingênuo não infectado companheiros.
  4. Casa cada casal em uma gaiola colocada dentro de um cofre com uma porta de grade e bloquear em 5 mm para evitar a fuga de reprodutor.
  5. Alimente os ratos chow e água ad libitum. Levante um total de 70 desmame progênies em grupos II e eu pelo menos seis semanas.
  6. Tirar o sangue por punção do coração do parental (FO) e ratos de descendentes (F1) sob anestesia, sacrificar os ratos e apresentar seções do coração, músculo esquelético e órgãos reprodutivos para análise patológica.

9. avaliação de privilégio imune

  1. Obter tecidos do T. cruzi-infectados e ingênuo controlar ratos (etapa 8,6) e cortar as amostras de parafina 4 µm seções espessas.
  2. Remover a parafina e desidratar as seções sobre lâminas de vidro com várias mudanças de xileno e classificadas lavagens com etanol 100% para 70%, durante 1 min cada.
  3. Incube as seções de tecido com saponina 0,05% uma vez, seguido por três lavagens de água destilada à temperatura ambiente.
  4. Bloquear as seções de tecido com 5% de leite em pó desnatado de 45 min. lavar as lâminas em 0,1 M PBST e incubar as secções com Chagas do mouse antisoro deT. cruzi ou com o soro de rato de controlo não infectado em um 01:20 diluição por 2 h.
  5. Lave as lâminas três vezes por 5 min em PBST e seco à temperatura ambiente antes de incubação com uma diluição de 1:1,000 de anti-rato de coelho conjugados a fosfatase alcalina IgG.
  6. Lavar as lâminas em PBST e adicionar 100 µ l de 3,3' diaminobenzidina para uma incubação de 5 min, seguida de três lavagens com PBST e counterstaining com hematoxilina de Harris por 30 s.
  7. Lavar as lâminas em água destilada por 5 min, desidrata-los em 70%, 80%, 90% e 100% de etanol por 1 min e montá-los em glicerina tamponada.
  8. Examinar as lâminas com um microscópio de campo claro e capturar imagens de foto com um micro com o software e um programa do analisador.
  9. Documente o privilégio imune do parasita na ausência de reações inflamatórias em órgãos reprodutivos.

10. estatísticas análises

  1. Use editar biomédica para análise de sequências, realizar alinhamentos com explosão e determinar a significância estatística E-value (p < 0,05).
  2. Executar um unidirecional análise de variância (ANOVA) e o teste de Tukey para comparar o OD significa mais ou menos desvios-padrão.

Resultados

Esta pesquisa, conduzida de acordo com o protocolo, teve como objetivo detectar casos agudos da doença de Chagas por exames clínicos e parasitológicos. Amostras de sangue venoso foram submetidas a exame microscópico direto e cultura in vitro para o crescimento do parasita. Vinte e um casos agudos da doença de Chagas mostraram T. cruzi no sangue. O protocolo de pesquisa garantiu o isolamento do T. cruzi ECI1-ECI21 da doença de Chagas aguda, e o DNA amostras expostas...

Discussão

Aqui, vamos discutir um protocolo de investigação baseada na família que respondeu à pergunta de se a doença de Chagas humana decorre de doenças sexualmente transmissíveis intraspecies T. cruzi infecções. Estudos iniciais não poderiam fornecer evidências da transmissão sexual das infecções de T. cruzi , provavelmente porque os dados e informações disponíveis sobre a doença de Chagas foram obtidas separadamente o individual3,4

Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Reconhecemos que as instalações de laboratório e os comentários críticos de Izabela Dourado, Carla Araujo e inteligente Gomes e a assistência técnica de Bruno Dalago e Rafael Andrade. Estamos em dívida para com a Fundação para o avanço da ciência (FAPDF), o Conselho de pesquisa nacional, Ministério da ciência e tecnologia (CNPq/MCT) e a Agência para a formação de recursos humanos, Ministério da educação (CAPES / ME), Brasil, para apoiar estas investigações.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
BCIP and NBT redox systemSigma-Aldrich681 451 001
Blood DNA Purification columnsAmersham Biosciences27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.  Perkin Elmer  BLU012H
DNA, Solution Salt Fish SpermAMRESCO064-10G
dNTP Set, 100 mM SolutionsGE Healthcare28-4065-51
Eco RIInvitrogen15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugatedSouthern Biotech       2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugatedBiocompareMB5198020
Hybond – N+ nylon membraneGE HealthcareRPN303B
Hybridization ovenThomas Scientific95-0031-02
Micro imaging software cell Sens softwareOlympus, Japan
Molecular probes labeling SystemInvitrogen700-0030
Nsi ISigma-AldrichR5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin KitGE Healthcare28-9042-70
Plate reader Bio-Tek GmBH2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugatedSigma-AldrichA9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugatedSigma-AldrichF8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugatedSigma AldrichA2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugatedBioradMCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fineSigma-AldrichG25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase RecombinantInvitrogen11615-010
Thermal cycler systemBiorad, USA1709703
Vector SystemsPromegaA1380

Referências

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