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요약

Chagas 질병의 Trypanosoma cruzi 에이전트 오랫동안 무 증상 감염 갑자기 인식된 임상 병리학으로 개발 생산. 다음 연구 프로토콜 설명 짧은 실행 가족 기반 역학 연구를 푸는 T. cruzi 감염 성적으로 부모 로부터 자손에 전달 합니다.

초록

미국의 trypanosomiasis 수혈에 의해 또는 병원과 연구 실험실에 우발적으로 오염 된 식품의 섭취를 통해 triatomine 버그에 의해 인 간에 게 전송 됩니다. 또한, Trypanosoma cruzi 감염 전송 선천적인 chagasic 어머니 로부터 그녀의 자손, 하지만 utero에서 오염에 남성 파트너의 기여는 알 수 없습니다. 둥지와 난소의 티크 셀에는 goniablasts에서, seminiferous tubules의 루멘에서 trypomastigotes와 amastigotes의 덩어리의 결과 T. cruzi 감염 전송 성적으로 좋습니다. 본 연구 프로토콜 2 중 혈액 단 세포에서 기생충 핵 DNA를 보여주는 인간을 대상의 단일 gametes에는 가족 연구의 결과 제공 합니다. 따라서, 1 년 떨어져 수집 된 3 개의 독립적인 생물 학적 샘플 확인 T. cruzi 감염 자손 성적으로 전송 했다. 흥미롭게도, 특정 T. cruzi 항 체 결 석 했다 기생충 항 원에 면역 관용을 낳은 가족 자손의 대부분에서. 면역 관용의 배아 성장, 첫 주 후 닭 T. cruzi 내 화물에서 설명 되었다 그리고 flagellate 주사 계란에서 부 화 하는 병아리 특정 항 체를 생산 하지 못했습니다. 또한, 인간 정액의 주입 사정 intraperitoneally 또는 T. cruzi amastigotes는 epididymis seminiferous 관, vas deferens , 염증의 부재와 튜브를 자 궁에 굴복 하는 순진한 마우스 질으로 생식 면역 권한 있는 기관에서 반응입니다. T. cruzi의 번 식-순진한 동료와 감염 된 남성 및 여성 쥐 나중 자손 전송 했다 감염의 수집 결과. 따라서, 인구 및 사회 단체를 포함 하는 강력한 교육, 정보 및 통신 프로그램 Chagas 질병을 방지 하기 위해 필요한 간주 됩니다.

서문

Trypanosomatidae 포유류 호스트에서 trypomastigote 및 amastigote 라이프 사이클 단계를 겪 습 곤충 벡터에 epimastigotes로 존재 하는 가족에 속하는 protozoan 기생충 Trypanosoma cruzi (Reduviid: Triatominae) 창 고에 axenic 문화입니다. 최근 수십 년간, 여러 연구 국가에서 Chagas 질병의 존재 triatomine 버그 무료1,2,3,,45, 를 고려 하는 4 개의 대륙에 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; 미국 trypanosomes의 분산 처음 북반구, 라틴 아메리카 이주자에 기인 했다 하지만 일부는 학위 경우 샤 가스 병의 가능성3,4 거부 이상 수 있습니다. , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. T. cruzi 전송의 생만 인식할 수 있는 소스 임신15;의 약 10%에서 자손에 게 기생충의 chagasic 어머니의 전송을 관찰 되었습니다 남성 파트너의 공헌 정액 ejaculates 통해 utero에서 감염을 알 수 없는 남아 있다.

한 세기 전, 수 사관16,17 관찰 세포내 T. cruzi amastigotes 난소의 티크 세포와 세균 세포의 Chagas 질병의 급성 경우 고환의 라인. 둥지와 T. cruzi trypomastigotes 및 amastigotes 난소의 티크 셀, goniablasts 및 치명적인 급성 샤 가스 질병 경우의 (그림 1) seminiferous tubules의 루멘 수 풀 개발의 장기에 면역 권한 염증의 부재에서 복제18,19침투. 최근 수십 년간, 몇 가지 실험 연구 T. cruzi 의 amastigote 라운드 형태의 둥지 seminiferous 관, epididymis, vas deferens 뿐만 아니라 자 궁, 관 및 난소에 심하게 감염 된 쥐 의 티크 셀 1,20,,2122. 또한, 가족 연구 인간 단일 세균 선 셀23, 그들의 자손, T. cruzi 핵 DNA (nDNA)에 게 부모의 Chagas 환자에서 미토 콘 드리 아 DNA 확인 protozoan의 전송 문서를 동안 및 기생충의 수명 주기 단계 chagasic 마우스24ejaculates에서 관찰 되었다. 이러한 결과 T. cruzi-감염 된 호스트는 특정 항 체1,,2526의 부재에서의 자손에 의해 획득 면역 관용에 대 한 보고서와 일치 하 여. 또한, 다른 대륙3,,45,6,7,8 발병 Chagas 질병의 확산을 제안 하는 역학 보고서 ,,910,11,,1213 실험 연구 보여주는 Chagas 질병 성적으로 전달 될 수 있다1에 의해 지원 됩니다 . 현재 조사 역학 가족 연구 프로토콜을 선물 하 고 T. cruzi 감염 성교에 의해 전파를 보여줍니다.

프로토콜

인간과 동물 연구 위원회 브라질리아 대학의 학부의 연구 프로토콜 2500.167567 및 10411/2011에서에서 인체 및 실험 동물, 모든 절차 각각 승인. 윤리 위원회는 공공 재단 병원이 스파 Vianna (프로토콜 n º 054/2009, CONEP 11163/2009)의 확장 하는 사역의 건강 국가 위원회에 인간의 연구 (CONEP 2585/04)와 현장 연구에 대 한 자유로운 동의 양식을 승인. 프로토콜은 T. cruzi DNA 2 중 혈액 단 세포 및 정액 ejaculates의 단일 gametes를 평가 하기 위해 조정 되었다. 실험실 동물 받은 인도적인 치료; 희생, 전에 심장 찔린 대상이 쥐 취하 했다.

1입니다. 인간 참가자 모집

  1. 연구 팀 Chagas 환자에 게 의료 서비스를 제공 하는 건강 시스템 Chagas 질병 프로그램에 참여 하 고 있는지 확인 합니다.
  2. 가족 프로그램에 적어도 1 개의 경우 발열, 불쾌, 두통, 심 박 급진, 및 부 종, 급성 샤 가스 질병14의 주요 임상 증상을 보여주는 인간 참가자를 모집 합니다.
  3. 5 년의 기간에 대 한 연구 가족에 있는 사람들에 게 의료 서비스를 제공 합니다.
  4. 정 맥 혈액의 15 mL 연구 참가자에서 3 차례 떨어져 1 년에, 3 개의 5 mL aliquots 샘플을 나눌 가져오고 4 ° c.에 냉장고에 보관
  5. 성인 자원 봉사 가족 구성원에서 정액 ejaculates의 2 개 mL를 수집 하 고 진행 단계 3.3에에서 설명 된 대로.

2입니다. 기생충의 성장

  1. Anticlotting 나트륨 덤플링; 5 단위 혈액을 혼합 단계 1.4에서에서 약 수를 사용 하 여, 가족 참가자 급성 샤 가스 병의 진단에서 혈액의 접종에 의해 경사 문화를 확인 합니다.
    1. Unclotted 인간 혈액 5 mL 50 mL 스크류 캡 튜브 혈액 한 천 경사 플러스 간 주입-tryptose 매체 (LIT)의 5 mL에 접종 하 고 3 개월 동안 27 ° C에서 통에 샘플을 품 어.
    2. 유리 슬라이드 위에 표면에 뜨는 매체의 100 µ L, 전표 및 혈액 현미경, T. cruzi epimastigotes에 대 한 검색 모든 4 주 커버.
    3. 27 ° C에서 axenic LIT 매체의 상쾌한에 epimastigote 격리 수확 PBS ph 7.4, 1000 x g 에서 원심 분리기는 10 분;에 대 한 셀을 씻어 Dulbecco의 수정 필수 매체 (DMEM) 5 mL에 펠 릿에 epimastigotes 희석.
    4. 접종 confluent L6 근육 세포 배양 플라스 크 1 x 106 ECI1 ECI21 T. cruzi epimastigote 격리.
    5. 베 레 니케 상 trypomastigotes 75 mL 문화 플라스 크에서 L6 근육 세포 배양에는 T. cruzi ECI1에 ECI21 성장 합니다.
    6. PH 7.4 5% 태아 둔감 한 혈 청, 100 IU/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 250 nM L-글루타민, 및 5% CO2 37 ° C1에 보충에서 DMEM의 15 mL로 세포를 피드.
    7. 사용 긍정적인 표현 형을 T. cruzi 베 레 니케 trypomastigotes 조직 문화에서 ECI1 ECI21 격리 단계 5.2에서에서 설명한 대로.
    8. 부정적인 통제 Leishmania braziliensis27 DMEM 20% 태아 둔감 한 혈 청만, 보충에 성장 하 고 부정적인 컨트롤로 기생충 promastigotes를 사용 하 여.
    9. 세포 배양에서 상쾌한 1 x 106 T. cruzi ECI1 ECI21 trypomastigotes을 사용 하 여 마우스를 감염.
    10. 감염의 첫 번째 주 후 T. cruzi trypomastigotes 꼬리 혈액에 대 한 검색.
    11. 되며 오신 스테인드 심장, 골격 근육 및 감염 된 쥐의 생식 기관에의 한 달 후에 amastigotes의 둥지를 검색 합니다.

3. DNA 추출 및 PCR 분석

  1. 살 균 EDTA 튜브에 aliquot (1.4 단계) 혈액의 5ml를 배치 하 고 3000 x g에서 45 분을 위한 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 수행. 레드 셀 위의 약간 흰 단계에서 단 세포 수확, 세척 하는 백혈구 5 mL PBS, pH 7.4, 다른 15 mL 튜브에 1500 x g 에서 10 분 동안 원심 분리 하 여의 두 번 고 DNA 추출에 대 한 셀을 사용 하 여 한 피 펫을 사용 합니다.
  2. ECI-1에서 ECI 21 T. cruzi, 베 레 니케 T. cruzi, 부정적인 컨트롤 L. braziliensis (2.1.8), 단계에서에서 긍정적인 통제에서 DNA를 추출 하 고 109 인간 가족의 테스트 혈액 단 세포에서 공부 과목1 , 27 , 28.
  3. DMEM (1:4, v/v);에 1.5 단계에서 얻은 정자 샘플의 희석 2 mL 5% CO2 45 분 및 37 ° C에 품 어, 13000 x g에 5 분 동안 원심 분리 후에 상쾌한에서 정 충을 복구 하 고 단일 DNA23추출.
  4. 셀의 1 mL 추출 버퍼에 배치 (10 µ M NaCl, 20 µ M EDTA, 1 %SDS, 0.04% 가수분해-K 및 1 %dithiothreitol), 흔들어 반전 하 여 솔루션을 섞는다.
    1. 13000 x g 와 25 ° C에서 10 분에 대 한 솔루션을 원심 그리고 회전 열에 점성 상쾌한 전송.
    2. 10000 x g 에서 1 분 동안 회전 열 원심 및 삭제 eluate; 스핀 열 (자료 테이블)에 500 µ L 바인딩 버퍼를 추가 하 고 12000 x g에 1 분 동안 원심은 eluate 삭제.
    3. 스핀 열 600 µ L 세척 버퍼를 추가 하 고 12000 x g에 1 분 동안 원심은 eluate 삭제.
    4. 두 번,이 단계를 반복 하 고 살 균 1.5 mL 마이크로 원심 튜브를 회전 열을 전송.
    5. 100 µ L의 TE 버퍼 2 분 동안 실내 온도에 튜브를 품 어 다음 12000 x g에서 1 분 동안 튜브를 원심 추가 합니다. Microcentrifuge 튜브에 버퍼는 DNA를 포함 됩니다.
    6. 0.8 %agarose 젤에 aliquots를 실행 하 여 및 260에서 흡 광도 읽어서 DNA 농도 측정 한 분 광 광도 계 nm. PCR 분석에서 사용까지-20 ° C에서 DNA 샘플을 저장 합니다.
  5. 사용 T. cruzi Tcz1/2 뇌관 특정 188-nt 특정 telomere 순서를 단련29 프로브 및 가족 연구 과목의 혈액과 정자, 베 레 니케 T. cruzi 긍정적인 제어 및에서 dna는 PCR를 실행에 L. braziliensis 부정적인 제어 합니다.
    1. 10 ng 템플릿 DNA, 뇌관, 2 U의 Taq DNA 중 합 효소, 0.2 µ M dNTPs, 및 15 µ M MgCl2 25 µ L 최종 볼륨에서의 각 쌍의 0.4 µ M으로 PCR 혼합물을 준비 합니다.
    2. 94 ° c 30에 대 한 DNA 증폭 프로그램을 시작할 서식 파일, 변성 및 55 ° c 30에 대 한 샘플을 냉각 s s. 그런 다음, 94 ° C 90에서 샘플을 품 어 단련 한 뇌관을 확장 하는 s. 30 대 94 ° C에 온도 반환 다음 사이클을 시작 하 고 샘플을 품 어 s 72 ° c.에 추가 3 분 32nd 사이클의 끝에, 실 온에서 10 분에 대 한 샘플을 냉각 하 고 4 ° C29에 냉장고에 보관 합니다.
    3. T. cruzi DNA telomere 반복 시퀀스 두 말단에서 Tcz1/2 뇌관에 단련을 증폭.
    4. 1.3 %agarose 젤에 증폭 제품을 분석 하 고 관찰 자외선 조명 기에 188-nt DNA 밴드.

4. 남부 교 잡

참고: 남부 교 잡 agarose 젤에서 거짓 긍정적인 PCR amplicons의 대부분을 삭제 하도록 사용 되었다.

  1. 감염된 컨트롤, Chagas 케이스 긍정적인 컨트롤, 2 중 DNA의 109 테스트 샘플 및 남부 내 21 연구 가족 참가자의 단일 DNA에서에서 PCR 증폭 제품 제목.
  2. T. cruzi 188-nt DNA 특정 telomere 순서 조사 표시; Tcz1/2 뇌관에 단련을 사용합니다 [α-32P] 2'-deoxyadenosine 3 인산 염 (dATP) 라벨 키트, 무작위 뇌관을 사용 하 여와 프로브 고 4 ° c.에 하룻밤 60 V에서 1.3 %agarose 젤에 증폭 제품 분석
  3. 밤새 모 세관 메서드를 사용 하 여 충전 된 나일론 막에 젤을 전송 합니다.
  4. 변수 기간에 대 한 게놈 DNA의 에코R1 소화 효소 특정 버퍼의 25 µ L에 바인딩하는 방사선된 188-nt 프로브 나일론 막 전송 DNA 밴드 교배
  5. 2 x SSC와 0.1 %SDS 65 ° C에서 15 분 동안 두 번 막 씻으십시오.
  6. 1 주일에 대 한 나일론 막과 autoradiograph를 x 선 필름 막에 밴드를 노출 합니다.
  7. T. cruzi PCR 증폭 제품의 특정 방사선 DNA 프로브 때 교배는 PCR와 남부 교 잡에서 선정 하는 클론을 성장.
  8. 상업적으로는 T. cruzi-특정 telomere 발자국2,23단련 설정 Tcz1/2 뇌관을 사용 하 여 복제 시퀀스.

5. 면역학 분석 실험

참고: 감도 특이성 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)과 간접 면역 형광 검사 (IIF)의 평가 했다 혈 청 될지도 parasitemia 6 Chagas 환자와 6 Chagas 무료에서 혈 청 deidentified 은행 샘플입니다. PBS, pH 7.4에 이중 혈 청 희석 1: 100 희석에서 IIF와 ELISA 광학 조밀도 (ODs) 0.150에서 및 위에 부정적인 결과에서 긍정적인 분리 공개는 분석 실험 실시.

  1. 1 시간, 실 온에서 보관 하는 unclotted 혈액 aliquot (1.4 단계)의 5 mL을 사용 하 고는 상쾌한에 혈 청을 분리 하기 위하여 30 분 1500 x g 에서 원심.
  2. IIF 및 ELISA triplicate 1: 100 혈 청 희석 T. cruzi 와 L. braziliensis 항 원28. 위에서 설명한 대로 검색을 수행합니다
  3. IIF
    1. 3 번 1 년 떨어져 얻은 109 연구 과목의 샘플의 triplicate 혈 청 희석에 IIF 분석 결과 수행 합니다.
    2. 장소는 포 르 말린의 5 µ L 정지 1%- T. cruzi epimastigotes 또는 유리 슬라이드;에 L. braziliensis promastigotes 처리 기생충 후드 실 온에서 하룻밤을 건조 시키고 사용까지-20 ° C에서 유리 슬라이드를 저장.
    3. 유리 슬라이드 위에 환자의 혈 청 희석의 장소 20 µ L 코팅 포 르 말린 죽 (10 기생충 / µ L) T. cruzi epimastigotes 또는 L. braziliensis 의 5 µ L promastigotes.
    4. 37 ° C와 PBS와 몇 번이 고 씻어 습 한 약 실에 1 시간을 위한 슬립으로 덮여 유리 슬라이드를 품 어.
    5. 37 ° C에서 1 시간에 대 한 인간의 IgG fluorescein 표시 된 토끼 항 체 (자료 테이블)의 1:1,000 희석와 air-dried 유리 슬라이드를 품 어 세척 하 고 건조 한 슬라이드.
    6. 커버 슬립 슬라이드를 탑재 하 고 UV 빛 현미경 검사.
      참고: 긍정적인 시험은 애플 그린 T. cruzi epimastigote 실루엣, 비디오에 표시.
  4. ELISA
    1. T. cruzi 와 코팅된 미 판 우물에 L. braziliensis 수용 성 항 (1 µ g/100 µ L에서 0.1 M 탄산 버퍼, pH 9.6)를 검출 하는 ELISA를 실행 합니다.
    2. 실 온에서 2 h triplicate 코팅 스에서 1: 100 혈 청 희석을 품 어.
    3. 몇 번이 고 PBST와 접시 세척 (PBS 0.5%를 포함 트윈-20), pH 7.4, 건조 하기 전에 솔루션.
    4. 37 ° c.에 90 분 동안 토끼 반대로 인간 IgG 항 체의 1:1,000 희석의 50 µ L와 번호판을 품 어
    5. PBST 솔루션으로 몇 번이 고 접시를 세척 하 고 실 온에서 건조 하도록 허용.
    6. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활용 된 염소-토끼 IgG (자료 테이블) 37 ° c.에 90 분의 1:1,000 희석의 100 µ L와 번호판을 품 어
    7. 몇 번이 고 PBST와 접시 세척 기판 p-니트로 페 닐 인산 염 추가 하 고 색상 개발에 대 한 대기.
    8. 630에서 ODs 읽기 다중 플레이트 리더에 nm.
    9. 연구 인구에서 시험 혈 청의 triplicate 희석을 실행 하 고 특정 식별 하 ODs 플롯 T. cruzi 항 체 titers.

6입니다. 면역 관용의 평가

참고: 치킨 모델 시스템 배아 개발의 첫 번째 주 후 T. cruzi 의 감염을 테스트에 사용 되었다.

  1. 조직 문화 매체;에서 수확 하는 100/10 µ L T. cruzi trypomastigotes와 비옥한 계란을 예방 µ L 문화 매체 당 10 T. cruzi trypomastigotes와 모의 제어 계란 접종 테이프로 구멍을 봉인.
  2. 21 일 20 T. cruzi-감염 된 계란과 37 ℃와 65% 습도에 모의 제어 비옥한 계란의 동등한 수를 품 어.
  3. 계속 여자를 해치 24 h에 대 한 하 고, 그 후, 온도 제어와 후드에 32 ° C에 인큐베이터에서 3 주 동안.
  4. T. cruzi-주사 계란에서와 별도 통로 개별 장에서 24 ° C에서 긍정적인 공기 압력 실에서 성인 무대에 모의 제어 계란에서 부 화 하는 병아리를 성장.
  5. 107 포 르 말린을 죽인 trypomastigotes 비디오에서 스키마에 따라 피하, 매주 주입과 모든 성인 여자 나이의 6 달에 몇 번이 고 도전 한다.
  6. 혈 청을 얻기 위해 마지막 접종 후 4 주 모의 컨트롤 및 T. cruzi-주사 계란에서 부 화 하는 닭의 날개 정 맥에서 혈액을 그립니다.
  7. 특정을 닭 혈 청을 사용 하 여 IIF와 ELISA 프로토콜의 단계 5에서에서 설명한 대로 T. cruzi 항 체.

7. 감염 쥐의 Chagas 환자 정액에서 T. cruzi 사정

  1. 정액 ejaculates 성인 PCR + Chagas 질병 환자 (1.5 단계)와 성인 PCR-Chagas-무료 개인 사용 합니다.
  2. 12 1 개월 BALB/c 순진한 마우스 후드 24 ° C에서 긍정적인 공기 압력 아래에 보관 하 고 식품 광고 libitum먹이의 2 개 그룹을 사용 합니다.
  3. 복 막 및 그룹 A 쥐의 질에 동일 금액으로 인간의 Chagas 긍정적인 정액 aliquots (100 µ L)를 주는.
  4. 복 막 및 그룹 B 마우스 질으로 동일한 금액으로 제어 Chagas 무료 정액 aliquots (100 µ L)를 주는.
  5. 희생 마 취 실험 쥐 정액 instillations 후 5 주 있으며 조직 단면도 되며 오신와 얼룩을.
  6. 현미경을 사용 하 여 T. cruzi trypomastigotes 및 amastigotes 심장, 골격 근육, 및 그룹 쥐의 생식 기관에 대 한 검색.

8. 는 T. cruzi 성교에 의해 감염의 전송

  1. 10 남녀 6 주 된 BALB/c 마우스를 사용 하 여 실험에서.
  2. 5 남자 및 1 x 105조직 문화에서T. cruzi trypomastigotes와 intraperitoneally 5 여성 쥐를 예방. 
  3. 3 개월까지 쥐를 사육: 그룹 난 5 T. cruzi에 의해 형성 될 것 이다-감염 된 여성 쥐와 5 제어 noninfected 남성 동료; 그룹 II를 남성 5 T. cruzi-감염에 의해 형성 됩니다 그리고 5 noninfected 여성 동료를 제어. 그룹 III 5 남성과 여성 5 제어 감염 되지 않은 순진한 동료에 의해 형성 됩니다.
  4. 각 집에는 탈출을 방지 하기 위해 5mm 그리드 및 잠금 도어 안전 상자 안에 배치 하는 한 장에 쌍 사육.
  5. 차 우와 ad libitum 물 쥐를 피드. 적어도 6 주 동안 그룹 II 그리고 progenies 이유 70 총을 올립니다.
  6. 혈액 심장 펑크에 의해 부모의 (FO)와 마 취 자손 (F1) 쥐, 쥐, 희생 그리고 심장, 골격 근육 및 생식 기관의 병 적인 분석에 대 한 섹션을 제출.

9입니다. 면역 권한 평가

  1. T. cruzi에서 조직 얻을-감염 그리고 순진한 쥐 (8.6), 단계 제어 4 µ m 두꺼운 부분으로 파라핀 포함 샘플을 잘라.
  2. 파라핀을 제거 하 고 탈수 크 실 렌의 몇 가지 변화를 유리 슬라이드와 1 분에 100% ~ 70% 에탄올과 등급된 세척에 섹션.
  3. 품 어 0.05% 사포닌과 조직 섹션 한 번 뒤에 실 온에서 3 증류수 세척.
  4. 45 분 세척에 대 한 5% 탈지 분유와 조직 단면도 0.1 M PBST에에서 슬라이드를 차단 하 고 섹션 Chagas 마우스 안티-T. cruzi 혈 청 또는 1시 20분에서 감염 되지 않은 컨트롤 마우스 혈 청을 품 어 2 h에 대 한 희석.
  5. PBST 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활용 된 토끼 반대로 마우스 IgG의 1:1,000 희석와 부 화 하기 전에 실내 온도에 건조 세 번 5 분에 대 한 슬라이드를 씻어.
  6. PBST에서 슬라이드를 헹 구 고 추가 3, 3' 5 분 인큐베이션, PBST와 3 세척 및 30에 대 한 해리스 hematoxylin와 counterstaining에 대 한 diaminobenzidine의 100 µ L s.
  7. 5 분 동안 증류수에 슬라이드를 세척 하 고 70%, 80%, 90%, 그리고 1 분, 100% 에탄올에서 탈수 버퍼링 된 글 리세 린에 탑재.
  8. 밝은 분야 가벼운 현미경, 슬라이드를 검사 하 고 사진 이미지 소프트웨어와 분석기 프로그램 microcamera.
  9. 생식 기관에 염증 반응의 부재에서 기생충의 면역 권한 문서.

10. 통계 분석

  1. 시퀀스 분석에 대 한 생물 의학 편집 사용 하 여, 폭발와 정렬 수행 하 고 E 값 통계적 유의 성 (p < 0.05)를 결정 합니다.
  2. 단방향 분산 분석 (ANOVA) 및 Tukey 테스트 표준 편차 전후로 OD 수단 비교를 수행 합니다.

결과

이 연구, 프로토콜에 따라 급성의 경우 샤 가스 병의 임상 및 parasitological 시험에 의해 검출을 목적으로. 정 맥 혈액 샘플을 직접 현미경 검사와 기생충 성장 위한 생체 외에서 문화를 받게 했다. 샤 가스 병의 경우에는 21 급성 혈액 T. cruzi 보였다. T. cruzi ECI1의 절연을 확보 하는 연구 프로토콜-급성 샤 가스 질병, ECI21 및 DNA 샘플 전시 연구 인구의 나머지에 있는...

토론

여기, 우리 인간의 Chagas 질병 성병된 공략 T. cruzi 에서 유래 여부의 질문에 대답 하는 가족-기반 연구 프로토콜 토론 감염. 초기 연구 수 제공 하지 T. cruzi 의 감염, 성적인 전송의 증거 아마 때문에 사용 가능한 데이터 및 샤 가스 병에 대 한 정보는 개별3,4,에서에서 별도로 입수 했다 5,6

공개

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 말

우리 실험실 시설 및 브루노 Dalago과 라파엘 이드의 기술 지원과 Izabela Dourado, 칼라 아라우와 영리한 고메스의 중요 한 의견을 인정합니다. 우리는 과학의 발전 (FAPDF), 국가 연구 위원회, 사역의 과학 및 기술 (CNPq/MCT), 재단 하는 기관 교육 인적 자원, 교육에 대 한 빚을 (망 토 / 나), 브라질, 이러한 지원에 대 한 조사입니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
BCIP and NBT redox systemSigma-Aldrich681 451 001
Blood DNA Purification columnsAmersham Biosciences27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.  Perkin Elmer  BLU012H
DNA, Solution Salt Fish SpermAMRESCO064-10G
dNTP Set, 100 mM SolutionsGE Healthcare28-4065-51
Eco RIInvitrogen15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugatedSouthern Biotech       2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugatedBiocompareMB5198020
Hybond – N+ nylon membraneGE HealthcareRPN303B
Hybridization ovenThomas Scientific95-0031-02
Micro imaging software cell Sens softwareOlympus, Japan
Molecular probes labeling SystemInvitrogen700-0030
Nsi ISigma-AldrichR5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin KitGE Healthcare28-9042-70
Plate reader Bio-Tek GmBH2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugatedSigma-AldrichA9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugatedSigma-AldrichF8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugatedSigma AldrichA2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugatedBioradMCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fineSigma-AldrichG25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase RecombinantInvitrogen11615-010
Thermal cycler systemBiorad, USA1709703
Vector SystemsPromegaA1380

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