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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Trypanosomen Trypanosoma Agent der Chagas-Krankheit produziert langlebige asymptomatische Infektionen, die abrupt in klinisch anerkannten Pathologie zu entwickeln. Die folgenden Forschungs-Protokoll beschreibt eine kurzfristige familienbasierte epidemiologische Studie um die T. Trypanosoma Infektion, sexuell übertragbare von übergeordneten an Nachkommen zu entwirren.

Zusammenfassung

Amerikanische Trypanosomiasis ist durch Triatomine Fehler durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln, durch Bluttransfusionen oder versehentlich in Krankenhäusern und Forschungslaboren auf den Menschen übertragen. Darüber hinaus die Trypanosomen Trypanosoma Infektion wird Geburt an einer Chagasic Mutter auf ihre Nachkommen übertragen, aber der männliche Partner Beitrag im Mutterleib Kontamination ist unbekannt. Die Ergebnisse der Nester und Klumpen von Amastigoten und Trypomastigotes in der Theca-Zellen des Eierstocks, der Goniablasts und in das Lumen der seminiferous Röhrchen legen nahe, dass T. Trypanosoma Infektionen sexuell übertragen werden. Die Forschungs-Protokoll hier präsentiert die Ergebnisse einer Familie Studie Bevölkerung zeigt Parasit Zellkern-DNA in den diploiden mononukleären Blutzellen und in der haploiden Gameten von Versuchspersonen. So bestätigte drei unabhängige biologische Proben ein Jahr auseinander, daß T. Trypanosoma Infektionen sexuell an Nachkommen übertragen wurden. Interessant ist, die spezifischen T. Trypanosoma Antikörper fehlte in den meisten Familien nachkommen, die Immuntoleranz gegen die Parasiten-Antigen zu langweilen. Immuntoleranz zeigte sich nach der ersten Woche des embryonalen Wachstums im refraktär gegenüber T. Trypanosoma Huhn und Küken schlüpften aus den Eiern ist geimpft waren nicht in der Lage, die spezifischen Antikörper zu produzieren. Darüber hinaus ejakuliert der Instillation des menschlichen Spermas, intraperitoneal oder in die Scheide der naive Mäuse ergab T. Trypanosoma Amastigoten im Nebenhoden, seminiferous Röhrchen, Samenleiter und uterine Rohr mit einer Abwesenheit von entzündlichen Reaktionen in den immun privilegierte Organen der Reproduktion. Die Zucht von T. Trypanosoma-infizierten männliche und weibliche Mäusen mit naiven Kumpels führte Erwerb der Infektionen, die später auf die Nachkommen übertragen wurden. Daher gilt eine robuste Bildung, Information und Kommunikation Programm, die die Bevölkerung und sozialen Organisationen umfasst notwendig, Chagas-Krankheit zu verhindern.

Einleitung

Einzelliger Parasit Trypanosomen Trypanosoma aus der Familie Trypanosomatidae erfährt Trypomastigote und Amastigote Lebenszyklusphasen Säugetier-Wirte und existiert als Epimastigotes im Insekt-Vektor (Reduviid: Triatominae) Darm und in axenic Kultur. In den letzten Jahrzehnten zeigen mehrere Studien die Anwesenheit der Chagas-Krankheit in Ländern auf vier Kontinenten betrachtet Triatomine Fehler kostenlos1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; die Streuung der amerikanischen Trypanosomen wurde zunächst lateinamerikanischen Einwanderer in der nördlichen Hemisphäre zugeschrieben, aber die Möglichkeit, dass einige autochthone Fälle der Chagas-Krankheit kann nicht mehr geleugnet werden,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. die nur erkennbar endogenen Übertragungsquelle T. Trypanosoma hat die Chagasic Mutter Übertragung des Parasiten auf die Nachkommen in etwa 10 % der Schwangerschaften15; zugeschrieben worden der männliche Partner Beitrag im Mutterleib Infektionen durch Sperma ejakuliert ist unerkannt geblieben.

Vor mehr als einem Jahrhundert Ermittler16,17 beobachtet intrazellulären T. Trypanosoma Amastigoten in der Theca-Zellen des Eierstocks und der Keim Linie Zellen der Hoden von akuten Fällen der Chagas-Krankheit. Die Nester und Klumpen von T. Trypanosoma Trypomastigotes und Amastigoten in Theca-Zellen des Eierstocks, in Goniablasts und in das Lumen der seminiferous Röhrchen (Abbildung 1) der tödlichen akuten Chagas Krankheit Fälle entwickeln immun Privileg in den Organen des Reproduktion in Ermangelung von entzündliche Infiltrate18,19. In den letzten Jahrzehnten ein paar experimentelle Studien haben Nester der Runde Amastigote Formen von T. Trypanosoma in seminiferous Röhrchen, Nebenhoden und Samenleiter als auch in der Gebärmutter, Röhren und Eierstock Theca-Zellen von akut infizierten Mäusen gezeigt 1,20,21,22. Darüber hinaus im Laufe der Familie Studien, die Übertragung von Protozoen zu dokumentieren, mitochondriale DNA von elterlichen Chagas Patienten an ihre Nachkommen, T. Trypanosoma Kern-DNA (nDNA) wurde in menschlichen haploiden Keimzellen Linie Zellen23, überprüft, und Parasit Lebenszyklusphasen wurden in die ejakuliert Chagasic Mäuse24beobachtet. Diese Erkenntnisse sind im Einvernehmen mit Berichten über die Immuntoleranz durch die Nachkommen von T. Trypanosoma -infizierten Hosts in Ermangelung der spezifischen Antikörper1,25,26erreicht. Darüber hinaus epidemiologische Berichte, die die Verbreitung der Chagas-Krankheit endemisch auf den anderen Kontinenten3,4,5,6,7,8 vorgeschlagen ,9,10,11,12,13 sind nun unterstützt durch experimentelle Studien zeigen, dass die Chagas-Krankheit, die sexuell übertragen werden kann1 . Diese Untersuchung stellt eine epidemiologische Familie Studienprotokoll und zeigt, dass T. Trypanosoma Infektion durch Geschlechtsverkehr propagiert.

Protokoll

Der Mensch und das Tier Forschung Ausschüsse von der medizinischen Fakultät der Universität von Brasilia alle Verfahren mit Menschen und Versuchstieren, bzw. im Forschungsprotokolle 2500.167567 und 10411/2011 genehmigt. Die Ethik-Kommission der öffentlichen Stiftung Krankenhaus Gaspar Vianna (Protokoll Nr. 054/2009 und CONEP 11163/2009) genehmigt die freie Zustimmung-Formulare für die Feldstudie mit Erweiterung auf der Ministerium der Gesundheit National Commission on Human Research (CONEP 2585/04). Das Protokoll wurde angepasst, um T. Trypanosoma DNA in diploiden mononukleären Blutzellen und haploiden Gameten von Sperma ejakuliert zu beurteilen. Die Versuchstiere erhielten humane Pflege; die Mäuse, Herz Punktion vor Opfer, unterzogen wurden unter Narkose.

1. Rekrutierung von menschlichen Teilnehmern

  1. Sicherstellen Sie, dass das Research-Team beteiligt sich in ein System Chagas Krankheit Gesundheitsprogramm Chagas Patienten medizinische Versorgung anzubieten.
  2. Rekrutieren Sie menschliche Teilnehmer aus Familien, die in das Programm eingeschrieben in mindestens einem Fall mit Fieber, Unwohlsein, Kopfschmerzen, Tachykardie und Ödeme, die wichtigsten klinischen Symptome der akuten Chagas Krankheit14zeigt.
  3. Liefern Sie Gesundheitsversorgung für die Menschen in den Familien Studie über einen Zeitraum von fünf Jahren.
  4. Erhalten Sie 15 mL venöses Blut aus der Studienteilnehmer dreimal ein Jahr auseinander, die Probe in drei 5 mL-aliquoten teilen und aufbewahren im Kühlschrank bei 4 ° C.
  5. Sammle 2 mL Sperma ejakuliert von Erwachsenen ehrenamtlichen Familienmitgliedern und fahren Sie wie unter Punkt 3.3 beschrieben.

2. Wachstum des Parasiten

  1. Mit den Aliquoten aus Schritt 1.4, das Blut mit 5 Einheiten von blutgerinnungshemmender Natrium Heparin mischen; machen Sie eine Steigung Kultur durch die Impfung von Blut von Familie Teilnehmer mit der Diagnose einer akuten Chagas-Krankheit.
    1. 5 mL unclotted menschliches Blut in ein 50 mL Schraubverschluss Rohr Blutagar schräge plus 5 mL Leber Aufguss-Tryptose Medium (LIT) zu impfen, und 3 Monate die Probe in einem Shaker bei 27 ° C inkubieren.
    2. Legen Sie 100 µL des Mediums Überstand auf Objektträger, Decken mit Zettel und Suche nach Blut T. Trypanosoma Epimastigotes unter die Lupe genommen, alle vier Wochen.
    3. Ernten Sie die Epimastigote-Isolate im Überstand der axenic LIT Medium bei 27 ° C; Waschen Sie die Zellen in PBS pH-Wert 7,4, Zentrifuge bei 1.000 X g für 10 min; verdünnen Sie die Epimastigotes im Pellet in 5 mL Dulbeccos veränderten wesentliche Medium (DMEM).
    4. Impfen die konfluierende L6 Muskel Zellkulturflaschen mit 1 x 106 ECI1-ECI21 T. Trypanosoma Epimastigote isoliert.
    5. Wachsen Sie die T. Trypanosoma ECI1, ECI21 und Berenice Archetyp Trypomastigotes in L6 Muskel Zellkulturen in 75 mL Kulturflaschen.
    6. Füttern Sie Zellen mit 15 mL DMEM bei pH 7.4 mit 5 % fötalen Rinderserum, 250 nM L-Glutamin und 5 % CO2 bei 37 ° C1100 IU/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin ergänzt.
    7. Verwenden Sie der Positivkontrolle T. Trypanosoma Berenice Trypomastigotes, Phänotyp der ECI1-ECI21-Isolate aus Gewebekultur, wie im Schritt 5.2 beschrieben.
    8. Wachsen Sie die Negativkontrolle Leishmania Braziliensis27 in DMEM mit 20 % fötalen Rinderserum nur ergänzt, und verwenden Sie die Parasiten Promastigotes als Negativkontrolle.
    9. Verwenden Sie 1 x 106 T. Trypanosoma ECI1-ECI21 Trypomastigotes im Überstand von der Zellkultur, um Mäuse zu infizieren.
    10. Suche nach T. Trypanosoma Trypomastigotes im Heck Blut nach der ersten Woche der Infektion.
    11. Suchen Sie die Nester der Amastigoten in Hämatoxylin-Eosin gefärbt Abschnitte des Herz, Skelettmuskel und Fortpflanzungsorgane der infizierte Mäuse, einen Monat danach.

3. DNA-Extraktion und PCR-Analysen

  1. 5 mL Blut (Schritt 1.4) in ein steriles Röhrchen EDTA aliquoten und durchführen Sie Dichte-Gradienten-Zentrifugierung für 45 min bei 3.000 X g. Verwenden Sie eine Pipette, um der mononukleären Zellen aus der weißliche Phase über den roten Zellen zu ernten, waschen die weißen Zellen zweimal in 5 mL PBS, pH 7,4, durch Zentrifugation für 10 min bei 1.500 X g in einer anderen 15 mL Tube, und verwenden Sie die Zellen für die DNA-Extraktion.
  2. ECI-1 zu ECI-21 T. Trypanosoma, aus der Positivkontrolle Berenice T. Trypanosoma, von der negativen Kontrolle L. Braziliensis (Schritt 2.1.8), die DNA extrahieren und aus den Test mononukleären Blutzellen von 109 Menschheitsfamilie Studie Themen1 , 27 , 28.
  3. Verdünnte 2 mL Spermaproben in Schritt 1.5 in DMEM (1:4, V/V); 45 min um 5 % CO2 und 37 ° C inkubieren Sie, wiederherstellen Sie Spermien aus der Überstand nach Zentrifugation für 5 min bei 13.000 X g, und extrahieren Sie der haploiden DNA-23.
  4. Platz 1 mL der Zellen im Extraktionspuffer (10 µM NaCl, 20 µM EDTA, 1 % SDS, 0,04 % Proteinase-K und 1 % Dithiothreitol), und die Lösungen von Inversion und schütteln zu mischen.
    1. Zentrifugieren Sie die Lösungen für 10 min bei 13.000 x g und 25 ° C und übertragen Sie den viskosen Überstand an einer Spin-Spalte.
    2. Die Spin-Spalte für 1 min bei 10.000 X g Zentrifugieren und das Eluat zu verwerfen; der Spin-Spalte (Table of Materials) 500 µL Bindung Puffer hinzu, für 1 min bei 12.000 X gZentrifugieren Sie, und entsorgen Sie das Eluat.
    3. 600 µL waschen Puffer auf die Spin-Spalte hinzufügen, für 1 min bei 12.000 X gZentrifugieren und das Eluat zu verwerfen.
    4. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, und übertragen Sie die Spin-Spalte auf eine sterile 1,5 mL Mikro Zentrifugenröhrchen.
    5. Fügen Sie 100 µL TE-Puffer, das Rohr auf 2 min bei Raumtemperatur inkubieren, und dann das Rohr für 1 min bei 12.000 X gzentrifugieren. Der Puffer im Microcentrifuge Schlauch enthält die DNA.
    6. DNA-Konzentration zu messen, indem man Aliquoten auf einem 0,8 % Agarose-Gel und durch das Lesen der Absorption bei 260 nm mit einem Spektrophotometer. Speichern Sie die DNA-Proben bei-20 ° C bis zur Verwendung in der PCR-Analyse.
  5. Verwendung T. Trypanosoma Tcz1/2 Primer auf die spezifischen 188-nt spezifische Telomer-Sequenz geglüht Sonde29 und führen die PCR mit DNA aus der Familie Probanden Blut und Sperma, aus der Berenice T. Trypanosoma positiv-Kontrolle und die L. Braziliensis Negativkontrolle.
    1. Bereiten Sie die PCR Mischung mit 10 ng Schablone DNA, 0,4 µM jedes Paars von Grundierungen, 2 U Taq DNA-Polymerase, 0,2 µM dNTPs und 15 µM MgCl2 in einem 25 µL Endvolumen.
    2. Initiieren der DNA Verstärkung Programm bei 94 ° C für 30 s zu denaturieren die Vorlage, und kühlen die Proben auf 55 ° C für 30 s. Inkubieren Sie dann, die Proben bei 94 ° C für 90 s, die geglühten Primer zu verlängern. Die Rücklauftemperatur auf 94 ° C für 30 s, um den nächsten Zyklus zu initiieren und inkubieren Sie die Proben eine zusätzliche 3 min bei 72 ° C. Am Ende des Zyklus 32Nd kühlen Sie die Proben 10 min bei Raumtemperatur, und speichern Sie sie im Kühlschrank bei 4 ° C-29.
    3. Ein T. Trypanosoma DNA Telomere Wiederholsequenz geglüht, Tcz1/2 Primer an beiden Enden zu verstärken.
    4. Analysieren Sie die Amplifikationsprodukte auf einem 1,3 % Agarose-Gel zu und beobachten Sie 188-nt DNA-Bänder auf einem UV-Strahler.

4. Southern -Hybridisierung

Hinweis: Southern -Hybridisierung wurde verwendet, um die meisten die falsche positive PCR-Amplifikate im Agarosegel zu verwerfen.

  1. PCR-Amplifikationsprodukte von nicht infizierten Kontrollen von Chagas Fall Positivkontrollen aus 109 Proben von diploiden DNA und haploiden DNA 21 Familie Studienteilnehmer zur südlichen Hybridisierungen zu unterwerfen.
  2. Beschäftigen Sie die T. Trypanosoma 188-nt DNA-spezifischen Telomere Sequenz Sonde geglüht, die Tcz1/2 Primer gezeigt; Beschriften Sie die Sonde mit [α -32P] 2'-Deoxyadenosine Triphosphat (dATP) mit einer zufälligen Grundierung labeling Kit, und analysieren Sie die Amplifikationsprodukte auf einem 1,3 % Agarose-Gel bei 60 V über Nacht bei 4 ° C.
  3. Übertragen Sie das Gel in einer positiv geladenen Nylon-Membran mit der Kapillare Methode über Nacht.
  4. Hybridisieren Sie die DNA-Bänder mit der radioaktiven 188-nt-Sonde, die die EcoR1-Übersichten der genomischen DNA in 25 µL des Puffers Enzym-spezifische für Variable Zeiträume bindet an die Nylon-Membran übertragen.
  5. Waschen Sie die Membran zweimal für 15 min bei 65 ° C mit 2 X SSC und 0,1 % SDS.
  6. Röntgenfilme, die Nylon-Membran und Autoradiograph die Bands auf der Membran für eine Woche aussetzen.
  7. Wachsen Sie die Klone von PCR und Southern -Hybridisierung mit der T. Trypanosoma PCR Verstärkung Produkte, die mit der bestimmten radioaktiven DNA-Sonde hybridisiert werden ausgewählt.
  8. Kommerziell-Sequenz die Klone mit Tcz1/2 Primer set geglüht, der T. Trypanosoma -spezifische Telomer-Bilanz2,23.

5. immunologische Tests

Hinweis: Die Sensitivität und Spezifität der indirekte Immunfluoreszenz (IIF) und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) beurteilte im Serum von sechs Chagas Patienten mit nachweisbaren Parasitemia und aus sechs Chagas-free deidentifiziert Serum Bank-Proben. Die Assays mit doppelten Serum Verdünnungen in PBS, pH 7,4, ergab, dass die IIF bei Verdünnungen von 1: 100 und die ELISA optische Dichte (ODs) 0,150 und über die negativen Ergebnisse die positiven getrennt durchgeführt.

  1. Verwenden Sie 5 mL des unclotted Blutes aliquoten (Schritt 1.4) bei Raumtemperatur 1 Stunde aufbewahrt und Zentrifugieren sie 1.500 x g für 30 min, das Serum im Überstand zu trennen.
  2. Führen Sie IIF und ELISA in dreifacher Ausfertigung 1: 100 Serum Verdünnungen, wie zuvor beschrieben28. T. Trypanosoma und L. Braziliensis Antigene zu erkennen
  3. IIF
    1. Führen Sie die IIF-Assay in dreifacher Ausfertigung Serum Verdünnungen von 109 Versuchspersonen Proben dreimal ein Jahr auseinander.
    2. Platz 5 µL Suspensionen von dem Formalin 1 % - behandelt T. Trypanosoma Epimastigotes oder L. Braziliensis Promastigotes auf Glas-Objektträger; lassen Sie die Parasiten über Nacht trocknen in eine Haube bei Raumtemperatur und speichern Sie der Objektträger bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu.
    3. Platz 20 µL der Patienten Serum Verdünnungen auf Objektträger beschichtet mit 5 µL des Formalin getötet (10 Parasiten/µL) T. Trypanosoma Epimastigotes oder L. Braziliensis Promastigotes.
    4. Inkubieren Sie die Glas-Folie bedeckt mit einem Slip für 1 h in einer feuchten Kammer bei 37 ° C und dreimal mit PBS waschen.
    5. Inkubieren Sie der luftgetrocknete Objektträger mit einer 1:1,000 Verdünnung eines Kaninchen Fluorescein-markierten Antikörpers (Table of Materials), menschliche IgG für 1 h bei 37 ° C; Waschen und Trocknen der Folie.
    6. Montieren Sie die Folie mit einem Deckglas und unter einem UV-Licht-Mikroskop zu untersuchen.
      Hinweis: Eine positive Prüfung ist ein Apfelgrün T. Trypanosoma Epimastigote Silhouette, in dem Video gezeigt.
  4. ELISA
    1. Führen Sie ein ELISA um T. Trypanosoma und L. Braziliensis lösliche Antigene (1 µg/100 µL in 0.1 M Karbonat-Puffer, pH 9,6) auf beschichteten Mikrotestplatte Brunnen zu erkennen.
    2. Inkubieren Sie die Serum-Verdünnungen 1: 100 in dreifacher Ausfertigung beschichteten Vertiefungen für 2 h bei Raumtemperatur.
    3. Die Platten dreimal mit PBST waschen (PBS mit 0,5 % Tween-20), pH 7,4, Lösung vor dem Trocknen.
    4. Inkubieren Sie die Platten mit 50 µL einer 1:1,000 Verdünnung der Kaninchen Anti-Human-IgG-Antikörper für 90 min bei 37 ° c
    5. Waschen Sie die Platten dreimal mit PBST Lösung und bei Zimmertemperatur trocknen lassen.
    6. Inkubieren Sie die Platten mit 100 µL 1:1,000 Verdünnungen der alkalischen Phosphatase konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG (Table of Materials) für 90 min bei 37 ° c
    7. Die Platten dreimal mit PBST waschen, fügen Sie das Substrat p-Nitro-Phenyl-Phosphat und warten auf die Farbentwicklung.
    8. Lesen Sie die ODs bei 630 nm in einem multimode-Platte-Reader.
    9. Führen Sie die dreifacher Verdünnungen des Testserums aus der Studienpopulation und Plotten der ODs Ermittlung die spezifischen Antikörper-Titer T. Trypanosoma .

6. Bewertung der Immuntoleranz

Hinweis: Ein Huhn-Modell-System wurde zur T. Trypanosoma Infektionen nach der ersten Woche der Embryonalentwicklung zu testen.

  1. Impfen Sie befruchteten Huhneier mit 100/10 µL T. Trypanosoma Trypomastigotes aus Gewebe Kulturmedium geerntet; mock Kontrolle Eier mit 10 T. Trypanosoma Trypomastigotes pro µL Kulturmedium zu impfen. Das Loch mit Klebeband abdichten.
  2. 21 Tage inkubieren Sie 20 T. Trypanosoma -infizierten Eiern und eine gleiche Anzahl von mock Kontrolle befruchteten Eier bei 37 ° C und 65 % Luftfeuchtigkeit.
  3. Halten Sie den Küken, dass Luke in den Inkubator für 24 h und danach, bei 32 ° C im Hauben mit Temperaturregelung für drei Wochen.
  4. Wachsen Sie die Küken geschlüpft von T. Trypanosoma -geimpft Eier und mock Kontrolle Eier zu Erwachsenen Stadium in einem positiven Luft Druck Raum bei 24 ° C, in einzelnen Käfigen in getrennte Gänge gelegt.
  5. Fordern Sie die Erwachsenen Küken dreimal im Alter von sechs Monaten mit 107 Formalin getötet Trypomastigotes injiziert subkutan, wöchentlich, nach dem Schema im Video.
  6. Zeichnen Sie Blut aus einer Armvene Flügel der Hühner schlüpfen aus den Eiern T. Trypanosoma -geimpft und von der simulierten Steuerung vier Wochen nach der letzten Impfung, das Serum zu erhalten.
  7. Das Huhn Serum verwenden, um die spezifischen erkennen T. Trypanosoma Antikörper durch IIF und ELISA wie in Schritt 5 des Protokolls beschrieben.

7. eine Infektion der Mäuse mit T. Trypanosoma von Chagas Patienten Sperma ejakuliert

  1. Verwenden Sie das Sperma ejakuliert von einem Erwachsenen PCR + Chagas Krankheit Patienten (Schritt 1.5) und von einem Erwachsenen PCR - Chagas-freie Individuum.
  2. Verwenden Sie zwei Gruppen von 12 ein-Monat-alte BALB/c naive Mäuse in Hauben unter positiver Luftdruck bei 24 ° C gehalten und Essen Ad Libitumgefüttert.
  3. Die menschlichen Chagas-Positive Samen Aliquote (100 µL) in das Peritoneum und gleiche Mengen in die Scheide der Gruppe-A-Mäuse zu vermitteln.
  4. Die Kontrolle Chagas-freien Samen Aliquote (100 µL) in das Peritoneum und eine gleiche Menge in die Scheide der Gruppe-B-Mäuse zu vermitteln.
  5. Opfern Sie fünf Wochen nach der Sperma-Arbeiten der experimentellen Mäuse unter Narkose zu und die Gewebeschnitte nach Färbung mit Hämatoxylin-Eosin.
  6. Verwenden Sie Mikroskopie, um T. Trypanosoma Trypomastigotes und Amastigoten in Herz, Skelettmuskel und Fortpflanzungsorgane in Gruppen von Mäusen zu suchen.

8. Übertragung der T. Trypanosoma Infektion durch Geschlechtsverkehr

  1. Verwenden Sie 10 männliche und weibliche sechs Wochen alten BALB/c Mäusen in den Experimenten.
  2. Fünf männliche und fünf weibliche Mäuse intraperitoneal mit 1 x 105 T. Trypanosoma Trypomastigotes aus der Gewebekultur zu impfen.
  3. Die Mäuse zu züchten, bis zum Alter von drei Monaten: Gruppe ich durch fünf T. Trypanosoma entsteht-infizierten weiblichen Mäusen und fünf Steuern noninfected männlichen Kameraden; Gruppe II wird gebildet von fünf T. Trypanosoma -infizierten männlichen und fünf noninfected weiblichen Kumpels zu kontrollieren. Gruppe III wird durch fünf männliche und fünf weibliche Kontrolle naiv nicht infizierten Kameraden gebildet werden.
  4. Haus jedes Brutpaar in einem Käfig in einen Safe mit einer 5 mm-Raster und Lock-in-Tür platziert, die Flucht zu verhindern.
  5. Füttern Sie die Mäuse, Chow und Wasser ad libitum. Insgesamt 70 Entwöhnung Stammarten in Gruppen II und ich für mindestens sechs Wochen zu erhöhen.
  6. Blut durch Herz Punktion aus dem elterlichen (FO) und Nachkommen (F1) Mäuse in Narkose, die Mäuse zu opfern, und legt Abschnitte des Herz, Skelettmuskel und Fortpflanzungsorgane für pathologische Analyse.

9. Beurteilung der immun-Privileg

  1. T. TrypanosomaGewebe einzuholen-infiziert und naive Mäuse (Schritt 8,6) zu kontrollieren und Paraffin-eingebetteten Proben in 4 µm dicke Abschnitte geschnitten.
  2. Das Paraffin entfernen und die Abschnitte auf Objektträger mit einigen Änderungen von Xylol und abgestuften Waschungen mit 100 % bis 70 % Ethanol, 1 min. zu entwässern.
  3. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte mit 0,05 % Saponin einmal, gefolgt von drei wäscht von destilliertem Wasser bei Raumtemperatur.
  4. Blockieren die Gewebeschnitte mit 5 % fettfreie Trockenmilch für 45 min. Wash Folien in 0,1 M PBST und inkubieren Sie die Abschnitte mit der Chagas Maus Anti-T. Trypanosoma Serum oder das nicht-infizierte Maus Kontrollserum bei einem 01:20 Verdünnung für 2 h.
  5. Waschen Sie die Folien für 5 min in PBST und trocken bei Raumtemperatur vor der Inkubation mit einem 1:1,000 Verdünnung der alkalischen Phosphatase konjugiert Kaninchen Anti-Maus IgG.
  6. Spülen Sie die Folien in PBST und fügen 100 µL 3,3' Diaminobenzidine für eine 5 min Inkubation, gefolgt von drei Waschungen mit PBST und Gegenfärbung mit Hämatoxylin Harris für 30 s.
  7. Waschen Sie die Folien in destilliertem Wasser für 5 min in 70 %, 80 %, 90 % und 100 % Ethanol für 1 min zu entwässern Sie und im gepufferten Glyzerin zu montieren.
  8. Prüfen Sie die Folien mit einem Lichtmikroskop Hellfeld und Foto-Aufnahmen mit einer Mikrokamera mit Software und einem Analysator-Programm.
  9. Das Immunsystem Privileg des Parasiten in Ermangelung von Entzündungsreaktionen in den reproduktiven Organen zu dokumentieren.

10 statistische Analysen

  1. Biomedizinischen bearbeiten verwenden für Sequenzanalysen, Achsen mit BLAST durchführen und bestimmen die E-Value statistische Signifikanz (p < 0,05).
  2. Führen Sie ein One-Way Varianzanalyse (ANOVA) und der Tukey-Test die OD-Mittel plus oder minus Standardabweichungen zu vergleichen.

Ergebnisse

Diese Forschung, die nach dem Protokoll soll akute Fälle der Chagas-Krankheit durch klinische und parasitologischen Prüfungen zu erkennen. Venöse Blutproben wurden direkte mikroskopische Untersuchung und in-vitro-Kultur für Parasiten Wachstum ausgesetzt. Einundzwanzig akute Fälle der Chagas-Krankheit zeigten T. Trypanosoma im Blut. Die Forschungs-Protokoll gesichert die Isolation von T. Trypanosoma ECI1-ECI21 von akuten Chagas-Krankheit, und die DNA-Muster ausgestel...

Diskussion

Hierin, diskutieren wir eine Familien-basierte Forschungsprotokoll, das beantwortet die Frage, ob menschliche Chagas-Krankheit aus sexuell übertragbare Wiederkäuer T. Trypanosoma stammt Infektionen. Frühe Studien konnte nicht die sexuelle Übertragung von T. Trypanosoma Infektionen, wahrscheinlich nachweisen, weil die verfügbaren Daten und Informationen über die Chagas-Krankheit separat von den einzelnen3,4gewonnen wurden,

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir erkennen den Laboreinrichtungen und die kritischen Anmerkungen von Izabela Dourado, Carla Araujo und clevere Gomes und die technische Unterstützung von Bruno Dalago und Rafael Andrade. Wir sind verpflichtet, die Grundlage für die Zuführung der Wissenschaft (FAPDF), The National Research Council, Ministerium für Wissenschaft und Technologie (CNPq/MCT) und die Agentur für Ausbildung Human Resources, Ministerium für Bildung (CAPES / ME), Brasilien, für die Unterstützung dieser Untersuchungen.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
BCIP and NBT redox systemSigma-Aldrich681 451 001
Blood DNA Purification columnsAmersham Biosciences27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.  Perkin Elmer  BLU012H
DNA, Solution Salt Fish SpermAMRESCO064-10G
dNTP Set, 100 mM SolutionsGE Healthcare28-4065-51
Eco RIInvitrogen15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugatedSouthern Biotech       2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugatedBiocompareMB5198020
Hybond – N+ nylon membraneGE HealthcareRPN303B
Hybridization ovenThomas Scientific95-0031-02
Micro imaging software cell Sens softwareOlympus, Japan
Molecular probes labeling SystemInvitrogen700-0030
Nsi ISigma-AldrichR5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin KitGE Healthcare28-9042-70
Plate reader Bio-Tek GmBH2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugatedSigma-AldrichA9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugatedSigma-AldrichF8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugatedSigma AldrichA2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugatedBioradMCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fineSigma-AldrichG25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase RecombinantInvitrogen11615-010
Thermal cycler systemBiorad, USA1709703
Vector SystemsPromegaA1380

Referenzen

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