JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

סוכן Trypanosoma cruzi Chagas המחלה מייצרת לטווח ארוך ללא תסמינים זיהומים בפתאומיות להתפתח פתולוגיה רפואית מוכרת. פרוטוקול המחקר הבאים מתאר הקצר על בסיס משפחתי אפידמיולוגיים מחקר כדי לפענח את הזיהום טי cruzi מחלות מהאב את רומא.

Abstract

Trypanosomiasis האמריקאית מועבר לבני אדם על ידי חרקים triatomine דרך הבליעה של מזון מזוהם, על-ידי עירויי דם או בטעות, בתי חולים, מעבדות מחקר. בנוסף, הזיהום Trypanosoma cruzi מועבר מלידה מאמא chagasic לצאצא שלה, אבל התרומה של השותף זכר לזיהום ברחם אינו ידוע. הממצאים של קנים ובתצורות של amastigotes ושל trypomastigotes בתאים theca של השחלה, את goniablasts, לומן של בקוריאנית וכמה מראים כי זיהומים cruzi ט מועברות מינית. פרוטוקול המחקר במסמך זה מציג את התוצאות של אוכלוסיה משפחה המחקר מציג טפיל DNA גרעיני תאי תאי הדם דיפלואידי, את גמטות הפלואידי של בני אדם. לפיכך, שלוש דגימות ביולוגיות עצמאית שנאספו ששנה מבדילה בנינו אישר כי זיהומים טי cruzi מינית מועברות אל רומא. מעניין, הספציפית נוגדן cruzi ט נעדר הרוב צאצאי המשפחה זה נשא מחוסן סבילות אנטיגן טפיל. עמידות המערכת החיסונית הודגם עוף עקשן ל ט cruzi לאחר השבוע הראשון של צמיחה עוברית, בחורות בקעו מהביצים מצליפים-מחוסן היו מסוגלים לייצר נוגדן ספציפי. יתר על כן, החדרה של זרע אנושי גומר intraperitoneally או לתוך הנרתיק של עכברים תמים הניב cruzi ט amastigotes יותרת האשך, וכמה צנורית, צינור , צינור הרחם עם היעדרות של דלקתיות תגובות באיברים מיוחס המערכת החיסונית של רבייה. הרבייה של cruzi טי-עכברים נגועים זכר ונקבה עם החברים תמימה, גרמו רכישה של דלקות, אשר מאוחר יותר מועברות אל הוא צאצא. לכן, חזקים חינוך, מידע ותקשורת תוכנית המערבת את האוכלוסייה של הארגונים החברתיים נחשבת הדרושים למנוע Chagas המחלה.

Introduction

טפילים protozoan Trypanosoma cruzi השייך למשפחת Trypanosomatidae עובר שלבים במחזור החיים trypomastigote ו- amastigote בתרבית של המארחים, קיים epimastigotes של חרקים-וקטור (Reduviid: Triatominae) הבטן ואת תרבות axenic. במהלך העשורים האחרונים, מספר מחקרים הראו הנוכחות של Chagas המחלה במדינות ב-4 יבשות נחשב triatomine באג חינם1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; הפיזור של trypanosomes האמריקאי יוחס בתחילה עולים מאמריקה הלטינית הכדור הצפוני, אך האפשרות כי חלקם מקרים autochthonous של Chagas המחלה ניתן עוד למנוע3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. מקור אנדוגני המוכרת היחידה שידור cruzi ט יש כבר המיוחס העברת של האם chagasic הטפיל אופספרינג כ- 10% של הריונות15; התרומה של השותף זכר זיהומים ברחם דרך שופך זרע נותר לא מזוהה.

מעל מאה שנה, אחד החוקרים16,17 נצפתה תאיים cruzi ט amastigotes תאי theca של השחלה, הנבט שורת תאים של האשכים במקרים אקוטיים של Chagas המחלה. הקנים ואת גושים של cruzi ט trypomastigotes, amastigotes תאי theca של השחלה, ב- goniablasts וב -לומן של וכמה בקוריאנית (איור 1) של מקרים Chagas המחלה חריפה קטלני לפתח הרשאות מערכת החיסון באיברים של רבייה בהיעדרו של דלקתיות מחלחל18,19. במהלך העשורים האחרונים, כמה ניסיוני מחקרים הראו קינים של צורות עגולות amastigote של cruzi טי צנורית וכמה, יותרת האשך, וכן הזרע כמו גם הרחם, צינורות, השחלה תאי theca של עכברים נגועים בחריפות 1,20,21,22. יתר על כן, במהלך לימודי משפחה כדי לתעד את העברת protozoan דנ א מיטוכונדריאלי מחולים Chagas הורים לצאצאיהם, DNA גרעיני ט cruzi (nDNA) אומתה נבט הפלואידי האנושי שורת תאים23, ו שלבים במחזור החיים של הטפיל נצפתה שופך chagasic עכברים24. ממצאים אלה הם מסכים עם דיווחים על הסובלנות המערכת החיסונית על-ידי הוא צאצא של cruzi טי -נגוע מארחים בהיעדרו של25,1,26נוגדן ספציפי. בנוסף, דוחות אפידמיולוגיים כי הציע את התפשטות אנדמיים Chagas המחלה ביותר אחרים יבשות3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 נתמכות כעת על-ידי ניסיוני מחקרים המראים כי Chagas המחלה יכול להיות מועבר מינית1 . החקירה הנוכחי מציג פרוטוקול מחקר אפידמיולוגי משפחה, מראה כי זיהום cruzi ט מפיצה על ידי יחסי.

Protocol

האדם הוועדות מחקר חיה בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת של ברזיליה אישר כל ההליכים עם בני אדם, חיות מעבדה, בהתאמה, בפרוטוקולים מחקר 2500.167567 ו- 10411/2011. ועדת האתיקה של הציבור קרן בית החולים גספר ויאנה (פרוטוקול מאנו 054/2009 ו CONEP 11163/2009) אושרה על טפסי הסכמה חופשית ללימודי שדה, עם סיומת כדי משרד של הבריאות הלאומי הנציבות על מחקר אנושי (CONEP 2585/04). הפרוטוקול היה מותאם כדי להעריך cruzi ט ה-DNA בתאי תאי הדם דיפלואידי, גמטות הפלואידי של שופך זרע. חיות מעבדה קיבל טיפול אנושי; העכברים, נתון לב לנקב לפני הקרבה, היו תחת הרדמה.

1. גיוס משתתפים אנושי

  1. ודא כי צוות המחקר משתתף בתוכנית בריאות מערכת Chagas המחלה כדי לספק טיפול רפואי לחולים Chagas.
  2. גייס משתתפים האנושי ממשפחות שהשתתפו בתוכנית, מציג לפחות מקרה אחד עם חום, חולשה, כאב ראש, טכיקרדיה, בצקת, הסימפטומים הקליניים העיקריים של חריפה Chagas המחלה14.
  3. לספק טיפול רפואי בני המשפחות המחקר לתקופה של חמש שנים.
  4. להשיג 15 מ"ל של דם ורידי של המשתתפים במחקר בשלוש הזדמנויות שנה אחת לגזרים, לחלק את הדגימה aliquots מ ל שלוש, ולאחסן אותם במקרר-4 מעלות צלזיוס.
  5. לאסוף מ 2 ל שופך זרעו של מבוגרים מתנדבים בני משפחתו והמשך כפי שמתואר בשלב 3.3.

2. צמיחה של טפילים

  1. באמצעות את aliquot מהשלב 1.4, לערבב את הדם עם 5 יחידות של הפארין נתרן anticlotting; להפוך תרבות המדרון על-ידי חיסון של דם המשתתפים משפחה עם האבחנה של חריפה Chagas המחלה.
    1. לחסן 5 מיליליטר דם אנושי unclotted לתוך 50 מ ל cap בורג צינור הדם-אגר שיפוע פלוס 5 מ של אינפוזיה כבד-tryptose בינוני (LIT), דגירה המדגם ב שייקר ב 27 מעלות צלזיוס במשך 3 חודשים.
    2. במקום 100 µL של המדיום supernatant על גבי מדרון זכוכית, לכסות עם פתקי ולחפש דם cruzi ט epimastigotes תחת המיקרוסקופ, כל ארבעה שבועות.
    3. לקצור את מבודד epimastigote ב תגובת שיקוע של מדיום axenic LIT ב 27 ° C; לשטוף את התאים ב- PBS pH 7.4, צנטריפוגה ב x 1000 g 10 דקות; לדלל את epimastigotes ב בגדר ב 5 מ של Dulbecco-השתנה חיוני בינוני (DMEM).
    4. לחסן confluent שרירים L6 המבחנות תא תרבות עם עונה 1 פרק 10 מבודד6 ECI1-אל-ECI21 ט cruzi epimastigote.
    5. לגדל את cruzi ט ECI1-אל-ECI21, את trypomastigotes ארכיטיפ ברניקי בתרבויות תא שריר L6 ב 75 מ ל תרבות מבחנות.
    6. להאכיל תאים עם 15 מ"ל של DMEM ב- pH 7.4 בתוספת סרום שור העוברי 5% 100 IU/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100, 250 ננומטר-גלוטמין ו- 5% CO2 -37 ° C1.
    7. השתמש בפקד חיובי trypomastigotes ט cruzi ברניקי כדי פנוטיפ מבודד את ECI1-אל-ECI21 של תרביות רקמה, כפי שמתואר בשלב 5.2.
    8. לגדול הפקד שלילי לישמניה braziliensis27 DMEM בתוספת 20% עוברית סרום שור בלבד ולהשתמש promastigotes את הטפיל כפקד שלילי.
    9. להשתמש עונה 1 פרק 106 ט cruzi ECI1-אל-ECI21 trypomastigotes תגובת שיקוע מתרבות תא להדביק עכברים.
    10. חפש cruzi ט trypomastigotes בדם הזנב לאחר השבוע הראשון של הזיהום.
    11. חפש קינים של amastigotes ב hematoxylin-אאוזין צבעונית מקטעים של הלב, שרירי השלד, אברי הרבייה של העכברים הנגועים, חודש לאחר מכן.

3. חילוץ DNA וניתוחים PCR

  1. מקום 5 מ של הדם (שלב 1.4) aliquot בשפופרת EDTA סטרילי, ולבצע צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות למשך 45 דקות ב x 3000 g. השתמש פיפטה כדי לקצור תאי תאי מהשלב לבנבן מעל תאי אדום, לשטוף את התאים הלבנים פעמיים ב 5 מ של PBS, pH 7.4, על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב x 1,500 גרם בשפופרת שונים 15 מ"ל, ולהשתמש התאים להפקת DNA.
  2. תמצית ה-DNA של ECI-1 ECI-21 ט cruzi, מהפקד חיובי ברניקי ט cruzi, מהפקד שלילי ל' braziliensis (שלב 2.1.8 תגובה על), וללמוד מן הבדיקה תאי תאי הדם של המשפחה האנושית 109 נושאים1 , 27 , 28.
  3. ML 2 שתדללו דגימות זרע שהושג בשלב 1.5 ב- DMEM (1:4, וי/v); תקופת דגירה של 45 min ב- 5% CO2 ו- 37 מעלות צלזיוס, להתאושש spermatozoa תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 13,000 x g, לחלץ את ה-DNA הפלואידי23.
  4. מקום 1 מ"ל של התאים במאגר החילוץ (10 מיקרומטר NaCl, 20 מיקרומטר EDTA, 1% מרחביות, 0.04% proteinase-K, ו- 1% dithiothreitol), ומערבבים את הפתרונות על ידי היפוך ורעדתי.
    1. Centrifuge פתרונות 10 דקות-13,000 x g ו- 25 ° C, ולהעביר את תגובת שיקוע צמיגה לעמודה ספין.
    2. Centrifuge את העמודה ספין עבור 1 דקות ב x 10,000 ג'י ולמחוק את eluate; להוסיף 500 µL מחייב מאגר לעמודה ספין (טבלה של חומרים), centrifuge זה עבור 1 דקות ב 12,000 x g, למחוק את eluate.
    3. להוסיף מאגר כביסה µL 600 אל העמודה ספין, centrifuge זה עבור 1 דקות ב 12,000 x g, למחוק את eluate.
    4. חזור על שלב זה פעמיים, ולהעביר את העמודה ספין שפופרת צנטרפוגה מיקרו mL 1.5 סטרילי.
    5. להוסיף 100 µL טה מאגר, דגירה הצינור בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות ולאחר מכן centrifuge את צינור 1 דקות ב 12,000 x g. המאגר בצינור microcentrifuge מכיל את ה-DNA.
    6. למדידת ריכוזי ה-DNA על-ידי הפעלת aliquots על ג'ל agarose 0.8% ועל ידי קריאת את ספיגת ב-260 nm עם ספקטרופוטומטרים. לאחסן דגימות ה-DNA ב-20 ° C עד שימוש בניתוח ה-PCR.
  5. שימוש cruzi ט Tcz1/2 תחל annealed רצף ספציפי 188-nt טלומר ספציפי בדיקה29 ולהפעיל את ה-PCR עם ה-DNA זרע ודם של הנבדקים במחקר המשפחתי, מהפקד חיובי ברניס cruzi ט ו מ בקרה שלילית ל' braziliensis .
    1. להכין לתערובת PCR עם 10 ng תבנית ה-DNA, 0.4 מיקרומטר של כל זוג תחל, 2 U של Taq DNA פולימראז, 0.2 µM dNTPs, ו- 15 מיקרומטר MgCl2 נפח סופי 25 µL.
    2. ליזום תוכנית ההגברה DNA ב 94 ° C ל 30 s כדי denature את התבנית, ומגניב הדגימות עד 55 ° C ל 30 s. לאחר מכן, דגירה בדגימות ב 94 ° C עבור 90 s כדי להרחיב את תחל annealed. להחזיר את הטמפרטורה עד 94 ° C ל 30 s כדי ליזום המחזור הבא, דגירה בדגימות 3 דקות נוספות-72 מעלות צלזיוס. בסוף מחזור 32nd , מגניב הדגימות 10 דקות בטמפרטורת החדר, לאחסן אותם במקרר 4 ° C29.
    3. להגביר את cruzi טי טלומר חוזרים ברצף של DNA annealed כדי תחל Tcz1/2-בשני הגפיים.
    4. לנתח את המוצרים הגברה ב- 1.3% agarose ג'ל ולצפות הלהקות דנ א 188-nt UV-המאייר.

4. הכלאה בדרום

הערה: הכלאה הדרומי שימש כדי למחוק את רוב amplicons PCR חיובי כוזב הג'ל agarose.

  1. נושא מוצרי הגברה PCR של פקדים נגוע, מפני פקדי חיובי במקרה Chagas, 109 הבדיקה דוגמאות של DNA דיפלואידי ומן הפלואידי-DNA של משתתפי המחקר 21 משפחה כדי hybridizations הדרומי .
  2. מעסיקים cruzi ט 188-nt DNA ספציפיים טלומר רצף החללית annealed כדי תחל Tcz1/2 מוצגים; תווית החללית עם [α -32P] 2'-deoxyadenosine טריפוספט (dATP) באמצעות פריימר אקראי תיוג קיט, ולנתח המוצרים הגברה ג'ל agarose 1.3% 60 וי לילה ב 4 º C.
  3. להעביר את הג'ל קרום ניילון הטעון חיובית בשיטת נימי בן לילה.
  4. Hybridize הלהקות DNA הועבר קרום ניילון עם החללית 188-nt radiolabeled, אשר מאגד את R1 לסביבהמעכל את ה-dna גנומי ב 25 µL של המאגר אנזים ספציפי לפרקי זמן משתנים.
  5. לשטוף את הקרום פעמיים למשך 15 דקות ב 65 ° C עם מרחביות x SSC ו- 0.1% 2.
  6. חושפים את הסרטים רנטגן ניילון הממברנה, autoradiograph הלהקות הקרום למשך שבוע.
  7. לגדול שיבוטים שנבחרו הכלאה PCR, בדרום עם המוצרים הגברה PCR cruzi ט , אשר הם hybridized עם החללית ה-DNA radiolabeled ספציפיים.
  8. מסחרית רצף שיבוטים באמצעות תחל את Tcz1/2 להגדיר annealed כדי cruzi טי -טלומר ספציפי טביעת רגל2,23.

5. מבחני אימונולוגי

הערה: רגישות וספציפיות של immunofluorescence עקיף (IIF) ואת וזמינותו מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) היו מוערך בהסרום Chagas שש, חולי parasitemia הניתנת ומן Chagas נטולת שש, deidentified סרום דוגמאות הבנק. מבחני ניצח עם דילולים סרום זוגי ב- PBS, pH 7.4, חשף כי את IIF ב מטריים דילולים וצפיפות את אליסה אופטי (נחמד) ב 0.150 ומעל הופרדו החיובי התוצאות השליליות.

  1. השתמש 5 מ"ל של unclotted לדם aliquot (שלב 1.4) המשיך בטמפרטורת החדר מאובטח, centrifuge זה ב 1,500 x g למשך 30 דקות להפריד את הנסיוב, תגובת שיקוע.
  2. לבצע IIF ואליסה במטריים triplicate דילולים סרום כדי לזהות אנטיגנים cruzi ט ול' braziliensis כפי שתואר לעיל28.
  3. IIF
    1. התנהגות וזמינותו IIF בסרום triplicate דילולים דגימות של הנבדקים במחקר 109 מתקבל בשלוש הזדמנויות שנה בנפרד.
    2. מקום 5 השעיות µL של פורמלין 1% - התייחסו cruzi ט epimastigotes או ל' braziliensis promastigotes על גבי זכוכית מהשקופיות... תן טפילים הלילה יבש בשכונה בטמפרטורת החדר, לאחסן שקופיות זכוכית ב-20 ° C עד השימוש.
    3. מקום 20 µL של דילולים סרום המטופלים על גבי מדרון זכוכית מצופה µL 5 epimastigotes cruzi ט נהרג פורמלין (10 טפילים/µL) או braziliensis ל' promastigotes.
    4. דגירה השקופית זכוכית מכוסה מעידה על h 1 בתוך תא לחה 37 ° C, שטיפת שלוש פעמים עם PBS.
    5. דגירה שהשקופית זכוכית אוויר יבש עם 1:1,000 לדילול נוגדן ארנב התווית על-ידי fluorescein (טבלה של חומרים) IgG אנושי עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס; לשטוף, לייבש את השקופית.
    6. טעינת השקופית עם מכסה ונבדוק את זה תחת מיקרוסקופ אור UV.
      הערה: מבחן חיובי הוא ירוק-תפוח cruzi ט epimastigote צללית, שמוצג בסרטון.
  4. אליסה
    1. הפעל של אליסה כדי לזהות את cruzi ט ו אנטיגנים מסיסים ל' braziliensis (1 µL µg/100 במאגר קרבונט 0.1 M, pH 9.6) על בארות microplate מצופה.
    2. דגירה של דילולים סרום מטריים בבארות מצופה triplicate עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף צלחות שלוש פעמים עם PBST (PBS המכילה 0.5% Tween-20), pH 7.4, פתרון לפני ייבוש.
    4. דגירה הצלחות עם 50 µL של 1:1,000 לדילול ארנב נגד נוגדנים IgG במשך 90 דקות ב 37 º C.
    5. לשטוף צלחות שלוש פעמים עם פתרון PBST ולאפשר להם לייבוש בטמפרטורת החדר.
    6. דגירה הצלחות עם 100 µL של דילולים 1:1,000 של עז מצומדת פוספטאז אלקליין אנטי-ארנב IgG (טבלה של חומרים) במשך 90 דקות ב 37 º C.
    7. לשטוף צלחות שלוש פעמים עם PBST, להוסיף את המצע p-ניטרו phenyl פוספט והמתן לפיתוח צבע.
    8. לקרוא את מקרי מוות ממנת יתר-630 nm, קורא כינוייהם צלחת.
    9. להפעיל את דילולים triplicate של הסרום מבחן מתוך אוכלוסיית המחקר ותכין את לקיחת לזהות הספציפית את טי cruzi נוגדן titers.

6. הערכות של רגישות המערכת החיסונית

הערה: מערכת מודל עוף היה משמש לבדיקת cruzi ט זיהומים לאחר השבוע הראשון של התפתחות העובר.

  1. לחסן ביצי פורייה עם 100/10 µL ט cruzi trypomastigotes שנקטפו תרביות רקמה בינוני; לחסן שליטה מדומה ביצים עם 10 טי cruzi trypomastigotes לכל µL תרבות בינוני. לאטום את החור עם הקלטת.
  2. תקופת דגירה 20 ט cruzi -נגוע ביצים עם מספר שווה של שליטה מדומה ביצים פוריות-37 ° C ו- 65% לחות של 21 ימים.
  3. שמור האפרוחים את הפתח בחממה במשך 24 שעות, לאחר מכן, ב- 32 מעלות צלזיוס בברדסים עם בקרת טמפרטורה במשך שלושה שבועות.
  4. לגדל את האפרוחים בקעו מביצים ט cruzi -מחוסן, מביצים שליטה מדומה על הבמה למבוגרים בחדר לחץ אוויר חיובי ב 24 ° C, בכלובים בודדים להציב למעבר נפרד.
  5. לאתגר את כל הבחורות למבוגרים שלוש פעמים ב גיל שישה חודשים עם 107 פורמלין-נהרג trypomastigotes מוזרק subcutaneously, מדי שבוע, על פי התכנית וידאו.
  6. דם מווריד כנף של תרנגולות בקעו מן הביצים cruzi טי -מחוסן ומן הפקדים מעושה ארבעה שבועות לאחר החיסונים שעברה כדי לקבל את הנסיוב.
  7. להשתמש את הנסיוב עוף כדי לאתר הספציפי נוגדן cruzi ט מאת IIF ואליסה כפי שמתואר בשלב 5 של הפרוטוקול.

7. זיהום של עכברים עם טי cruzi בזרע Chagas המטופלים גומר

  1. השתמש שופך זרע של חולים במחלה PCR + Chagas למבוגרים (שלב 1.5) ומן אדם מבוגר PCR Chagas-חינם.
  2. השתמש בשתי קבוצות של 12 בן חודש אחד BALB/c תמים עכברים המשיך בברדסים תחת לחץ אוויר חיובי ב 24 ° C. וניזון מזון ad libitum.
  3. להחדיר את aliquots זרע אנושי Chagas-חיוביות (100 µL) לתוך הצפק ואת כמויות שוות לתוך הנרתיק של קבוצה-A עכברים.
  4. להחדיר את הבקרה ללא Chagas זרע aliquots (100 µL) לתוך הצפק וכמות שווה לתוך הנרתיק של עכברים קבוצה-B.
  5. להקריב את העכברים ניסויית תחת הרדמה חמישה שבועות לאחר הפתיחה המיצגים זרע, נושא הסעיפים רקמות מכתים עם hematoxylin-אאוזין.
  6. השתמש במיקרוסקופ לחיפוש ט cruzi trypomastigotes, amastigotes הלב, שרירי השלד ולאחר איברי הרבייה קבוצות של עכברים.

8. העברת טי cruzi זיהום על ידי קיום יחסי מין

  1. השתמש 10 זכר ונקבה בת שבוע 6 BALB/c עכברים בניסויים.
  2. לחסן זכר חמש ועכברים הנשי חמש intraperitoneally עם עונה 1 פרק 105 טי cruzi trypomastigotes מן התרבות רקמות.
  3. להרבות העכברים עד לגיל 3 חודשים: קבוצה ייווצר על ידי חמישה cruzi טי-עכברים נגועים הנשי ובקרת חמשת החברים זכר noninfected; הקבוצה השנייה יכול להיווצר על ידי חמישה cruzi טי -נגוע זכר ושליטה חמישה חברים הנשי noninfected. קבוצה III יכול להיווצר על ידי הזכר חמישה והחברים תמים uninfected חמש הנקבה שולטת.
  4. כל רבייה זוג בכלוב אחד בתוך הכספת עם דלת רשת וקווי הנעילה 5 מ מ כדי למנוע בריחה.
  5. להאכיל העכברים צ'או ומים ad libitum. העלאת סכום כולל של 70 הגמילה progenies קבוצות השני ואני לפחות שישה שבועות.
  6. דם על ידי דקירה בלב הורים (פו), רומא (F1) עכברים תחת הרדמה, להקריב את העכברים, ולהגיש מקטעים של הלב, שרירי השלד, איברי הרבייה לבדיקה פתולוגית.

9. הערכת רמת הרשאות מערכת החיסון

  1. להשיג רקמות של cruzi טי-נגוע, תמים לשלוט עכברים (שלב 8.6), ולגזור הדגימות פרפין-מוטבע לתוך 4 מיקרומטר סעיפים עבה.
  2. הסרת הפרפין, מייבשים הסעיפים עלו על שקופיות זכוכית עם מספר שינויים של קסילן שוטף מדורגת עם אתנול 100% עד 70%, עבור 1 דקות כל אחד.
  3. דגירה הסעיפים רקמות עם 0.05% סאפונין פעם אחת, ואחריו שלושה שוטף מים מזוקקים בטמפרטורת החדר.
  4. לחסום את הסעיפים רקמות עם 5% שומן אבקת חלב במשך 45 דקות לשטוף את השקופיות ב 0.1 M PBST, דגירה הסעיפים עם ה Chagas העכבר אנטי-סרוםcruzi ט או עם הסרום עכבר שליטה uninfected-1:20 דילול כבר שעתיים.
  5. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- PBST ויבש בטמפרטורת החדר לפני הדגירה עם 1:1,000 לדילול ארנב מצומדת פוספטאז אלקליין אנטי-העכבר IgG.
  6. לשטוף את השקופיות ב PBST ולהוסיף 100 µL של 3, 3' diaminobenzidine עבור דגירה 5 דקות, ואחריו שלושה שוטף עם PBST ו counterstaining עם האריס hematoxylin ב-30 s.
  7. לשטוף את השקופיות במים מזוקקים למשך 5 דקות, מייבשים אותם ב- 70%, 80%, 90% ו 100% אתנול עבור 1 דקות, והר אותם בגליצרין במאגר.
  8. לבחון את השקופיות עם מיקרוסקופ אור בהיר-שדה, לכידת תמונה תמונות עם microcamera עם התוכנה, תוכנית מנתח.
  9. המסמך הזכות המערכת החיסונית של הטפיל, בהעדר תגובות דלקתיות של איברי הרבייה.

10. ניתוחים סטטיסטיים

  1. השתמש לערוך ביו לניתוח רצף לבצע יישור עם הפיצוץ, לקבוע את הערך האלקטרוני מובהקות סטטיסטית (p < 0.05).
  2. מבצעים שונות של ניתוח בכיוון אחד (ANOVA) במבחן Tukey, כדי להשוות את האמצעים OD פלוס או מינוס סטיות תקן.

תוצאות

מחקר זה, שנערך לפי הפרוטוקול, שמטרתו לזהות במקרים אקוטיים של Chagas המחלה על-ידי מבחנים קליניים, parasitological. דגימות דם ורידי היו נתון בבדיקה מיקרוסקופית ישירה ותרבות במבחנה לצמיחה טפיל. עשרים ואחד במקרים אקוטיים של Chagas המחלה הראו טי cruzi בדם. פרוטוקול מחקר לאבטח את ניתוקה ש?...

Discussion

במסמך זה, נדון פרוטוקול מחקר מבוסס המשפחה ענית לי על השאלה של האם האדם Chagas המחלה נובעת התמקדנו המועברות במגע מיני cruzi ט זיהומים. לימודי יכול לא לספק ראיות שההעברה המינית של זיהומים cruzi ט , כנראה בגלל זמינות הנתונים ואת המידע על Chagas המחלה, התקבלו בנפרד הפרט3,

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

אנו להכיר במתקני מעבדה, את תגובות ביקורתיות של Izabela Dourado. קרלה אראוז'ו, גומס חכם וסיוע טכני של ברונו Dalago, רפאל אנדרדה. אנחנו חבים הקרן לקידום המדע (FAPDF), המועצה הלאומית למחקר, משרד המדע, הטכנולוגיה (CNPq/MCT), סוכנות עבור משאבי הדרכה אנוש, משרד החינוך (גלימות / לי), ברזיל, לתמיכה אלה חקירות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BCIP and NBT redox systemSigma-Aldrich681 451 001
Blood DNA Purification columnsAmersham Biosciences27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.  Perkin Elmer  BLU012H
DNA, Solution Salt Fish SpermAMRESCO064-10G
dNTP Set, 100 mM SolutionsGE Healthcare28-4065-51
Eco RIInvitrogen15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugatedSouthern Biotech       2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugatedBiocompareMB5198020
Hybond – N+ nylon membraneGE HealthcareRPN303B
Hybridization ovenThomas Scientific95-0031-02
Micro imaging software cell Sens softwareOlympus, Japan
Molecular probes labeling SystemInvitrogen700-0030
Nsi ISigma-AldrichR5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin KitGE Healthcare28-9042-70
Plate reader Bio-Tek GmBH2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugatedSigma-AldrichA9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugatedSigma-AldrichF8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugatedSigma AldrichA2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugatedBioradMCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fineSigma-AldrichG25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase RecombinantInvitrogen11615-010
Thermal cycler systemBiorad, USA1709703
Vector SystemsPromegaA1380

References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66 (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62 (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015 (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53 (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. , (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14 (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115 (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. . Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13 (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24 (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56 (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7 (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi?. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71 (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90 (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6 (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27 (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. . Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. , (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi?. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. . The production of Antibodies. , (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2 (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18 (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7 (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20 (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26 (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7 (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338 (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22 (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474 (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3 (3), 199-210 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143Trypanosoma cruziChagas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved