用两相循环流系统实时成像和定量真菌生物膜的研究

摘要

介绍了一种在水流下实时成像真菌生物膜形成的流动装置的组装、操作和清洗。我们还提供并讨论了用于获取图像的定量算法。

摘要

在口咽念珠菌病中,念珠菌属的成员必须坚持和生长在口腔粘膜表面, 而在唾液流动的影响下。虽然在流的增长模型已经开发, 许多这些系统是昂贵的, 或不允许成像, 而细胞在流动。我们开发了一种新的仪器, 使我们能够想象在流动和实时的白色念珠菌细胞的生长和发展。在这里, 我们详细介绍了该流程设备的组装和使用的协议, 以及所生成数据的量化。我们能够量化单元格附加到和从幻灯片中分离的速率, 以及确定随时间推移的幻灯片上生物量的测量值。该系统既经济又多功能, 与许多类型的光学显微镜, 包括廉价的台式显微镜, 并能延长成像时间相比, 其他流系统。总的来说, 这是一个低吞吐量的系统, 可以提供非常详细的实时信息的生物膜生长的真菌物种在流动。

引言

白色念珠菌(C. 白念珠菌) 是人类的一种机会性真菌病原体, 可感染多种组织类型, 包括口腔粘膜表面, 导致口咽念珠菌病, 并导致受影响的个人的生活质量降低¹。生物膜的形成是影响白念珠菌发病的重要特征, 对白念珠菌生物膜的形成和功能进行了大量的研究^{2,3,4, 5}, 其中许多已使用静态 (无流)体外模型进行。然而, 白念珠菌必须坚持和生长在唾液流在口腔中存在。许多流动系统已经开发, 以允许活细胞成像^6,7,8,9,10。这些不同的流系统是为不同的目的而设计的, 因此每个系统都有不同的优点和缺点。我们发现, 许多适合C. 白念珠菌的流动系统成本高昂, 需要复杂的制造部件, 或者在流动过程中无法成像, 必须在成像之前停止。因此, 我们开发了一种新的流动装置来研究¹¹流动下的白念珠菌生物膜形成。在我们的流量仪设计过程中, 我们遵循了这些主要考虑因素。首先, 我们希望能够实时量化生物膜生长和发展的多个方面, 而无需使用荧光细胞 (允许我们轻松研究突变菌株和未修改的临床分离株)。其次, 我们希望所有部件都能在商业上提供, 几乎没有任何修改 (i. e., 没有定制制造), 允许其他人更容易地重新创建我们的系统, 并允许轻松维修。第三, 我们还希望允许在相当高的流速率下延长成像时间。最后 , 我们希望 , 经过一段时间的细胞附着到基质动 , 能够监测生物膜生长在较长的时间 , 而不引入新的细胞。

这些考虑促使我们开发了图 1所示的双瓶循环流系统。两个烧瓶允许我们将实验分为两个阶段, 一个附着阶段, 从细胞种子附着烧瓶中吸取, 以及使用无细胞培养基继续生物膜生长的生长阶段, 而无需添加新细胞。该系统设计用于显微镜的孵育室, 其前面的滑块和油管 (2 到 5,图 1) 放置在孵化器内, 而所有其他组件放置在一个大型辅助容器外显微镜。此外, 带有附加温度探针的电炉搅拌器用于保持附着烧瓶中的真菌细胞37摄氏度。由于它是循环的, 这个系统能够连续成像在流动期间 (可以超过36小时取决于条件), 并可用于大多数标准显微镜, 包括直立或倒置台式显微镜。在这里, 我们讨论了流量设备的组装、操作和清洗, 并提供了一些基本的 ImageJ 定量算法来分析实验后的视频。

研究方案

1. 组装流量设备

1. 根据图 1中的示意图配置材料表中列出的部件, 并考虑下面讨论的注意事项。
   注意: 为方便起见, 流量设备分为两个侧面, 绿色侧 (所有的幻灯片的上游到培养基烧瓶), 橙色的一面 (所有的东西在幻灯片的下游到培养基烧瓶)。
   1. 确保所有的流量设备都是气密的, 以防止泄漏, 除了介质烧瓶 (图 1, 1)。为了实现这一点, 除了脉动阻尼器 (PD) 和2µm 滤瓶 (FB) 外, 在组装前将水管胶带应用到任何螺纹上, 不需要水管胶带作为橡胶垫片使其密封。
   2. 在正常运行 (即泵的下游) 正压下的每一个带刺的接头上应用耳钳。
   3. 使用颜色编码的实验室磁带, 用 A 或 G (分别为附件和增长)、泵位置、滑动连接位置和0.2 µm 过滤器连接对阀门位置进行标注。
   4. 根据流量系统和显微镜之间的距离确定要使用的油管长度, 请记住, 泵到烧瓶下游的所有流量设备 (大部分为橙色侧) 应在二次密封中。增加大约1米的额外油管上游的幻灯片 (最好是气泡陷阱) 放置在显微镜孵育室, 因为这确保所有介质到达幻灯片将在正确的温度。
   5. 将气泡疏水阀尽可能靠近滑块, 最好是在实验期间的孵育室内 (气泡通常沿油管壁形成);然而, 请记住, 它必须连接到真空运行。
   6. 确保 FB 与0.2 µm 一次性过滤器之间的油管长度约为0.5 米。
   7. 将大约2厘米的磁力搅拌棒添加到每个介质瓶中。
   8. 获得某种形式的油管钳作为截止阀 (绑扎可以使用)。
   9. 为便于使用, 请将流量设备放在可高压灭菌的篮子中。它可以有帮助, 有一个更小的篮子在一个较大的, 使绿色的一面和橙色的一面容易分离。
   10. 对于附件烧瓶, 使用 4 mm 钻头, 在橡皮塞中钻一个额外的孔以容纳热探针 (注意不要穿过另一个孔)。要使油管穿过端口, 用镊子推油管;一旦通过, 夹紧油管保持到位, 然后拉镊子回来。
       注: 如果无法将额外的孔添加到橡皮塞, 则使用四口螺钉盖的宽口螺钉瓶可以代替烧瓶和橡皮塞。
2. 一旦流量系统完全组装好, 关闭绿色和橙色侧生长瓶的阀门。根据制造商的说明, 使用带有附件烧瓶管和分级气缸的水来校准蠕动泵。

2. 执行实验

1. 实验前一天, 开始预加热显微镜孵育室至37摄氏度, 并准备一夜真菌菌株的培养 (不需要荧光)。
2. 收集单一使用组件和泵, 并放置在一个无菌的生物安全柜。
3. 从流动装置中取出气泡疏水阀和温度探头, 并将其放置在生物安全柜中。
4. 如有必要, 梳理并组织油管。
5. 高压釜的流动装置, 包括搅拌棒, 30 分钟确保无菌;完成后, 转移到生物安全柜。
6. 如图 1所示, 连接气泡疏水阀、温度探头和所有单一使用组件 (幻灯片除外)。
   1. 对于0.2 µm 过滤器 (图 1、11), 从1毫升注射器中取出柱塞, 使其成为 "适配器"。强制从 FB 的管道到这一端, 并将0.2 µm 过滤器连接到通向生长瓶的油管上。
   2. 将硅胶真空润滑脂涂在滑动适配器的倒钩上 (注意不要在连接之前得到任何油脂), 因为这有助于防止空气泄漏到系统中。
7. 用100毫升 1% (w/v) 酵母萃取物、2% (YPD) 蛋白胨和 2% (w/v) 葡萄糖 (YPD) 填充附着烧瓶, 并用200毫升, 填充生长烧瓶。确保绿色侧管到达每个烧瓶中的介质。
8. 确保所有阀门均已打开。将气泡疏水阀附着到真空中, 然后将泵连接到气泡疏水阀下游的绿色侧管上。
9. 以3.3 毫升/分钟的流速泵送液体, 以完全填充绿色侧, 然后分配和丢弃约为毫升的培养基, 因为前几毫升通常含有死细胞或随机碎屑。确保管道的绿色侧充满介质, 并在继续之前没有气泡陷井下游。
10. 用 YPD 填充通道滑块和储层, 注意不要引入气泡。
11. 将滑块连接到流设备, 然后泵出更多流体, 以创建橙色一侧约0.5 米的缓冲液。这是为了防止在发生回流时意外捕获幻灯片中的空气。
12. 准备输送到显微镜的流动装置: 夹紧关闭气泡疏水阀的入口和出口, 并夹紧绿色和橙色侧附件烧瓶阀关闭。确保 PD 和 FB 的螺帽紧固, 因为它们可以在高压灭菌过程中松动。
13. 断开泵与油管的连接, 使运输更容易。然后将所有组件 (包括加热炉搅拌器) 移动到显微镜附近的辅助容器中。
14. 准备用于成像的流动装置。
    1. 将温度探头连接到电炉搅拌器, 并开始将附件烧瓶加热至37摄氏度。将介质搅拌 300 rpm, 并在整个实验中保持此。
    2. 将幻灯片安装在显微镜上, 必要时使用胶带将其紧紧固定。
    3. 将气泡疏水阀连接到真空 (不要撤消钳位)。
    4. 将泵连接到图 1所示位置的流量设备。
    5. 以3.3 毫升/分钟的流速启动泵, 允许它运行大约 5–10 s, 然后取下气泡疏水阀入口/出口钳。
    6. 当附件烧瓶升温时, 允许泵继续运行。一旦媒体在整个流程系统中循环, 检查正常操作。
       1. 检查泵上游空气泄漏的接头 (某些气泡形成正常), 或下游流体泄漏。
       2. 检查生长介质烧瓶、PD 和 FB 是否都是从入口管滴水的介质 (如果没有, 这可能表示过滤器堵塞, 或 overtightened 耳钳)。
       3. 使用显微镜检查通道滑块上的连接或滚动单元格。过量的细胞可能表示在设置过程中的污染, 或者气泡疏水阀的聚四氟乙烯 (PTFE) 膜需要更换。
15. 一旦附着烧瓶和孵育室都在37摄氏度, 添加足够的夜间培养的真菌细胞到附着烧瓶达到 1 x 10⁶细胞/毫升。
    注意: 可以使用以下公式计算µL 中添加的卷:
    
16. 等待15分钟, 让细胞适应。
17. 打开绿色和橙色侧附件烧瓶阀, 同时关闭两个生长瓶阀以启动细胞流动。
18. 等待大约5分钟, 以允许细胞到达幻灯片, 并允许显微镜的初始对焦 (这一次可能需要根据绿色侧管的长度调整)。在此期间, 将显微镜调整为以前实验中使用的相同成像参数。如果这是第一次运行, 请按照下列步骤操作:
    1. 切换到低放大空气物镜。
    2. 查找并专注于附着的细胞或小的发芽细胞。
    3. 为科勒照明配置冷凝器, 然后切换到暗场。
    4. 将曝光时间设置为 300 ms。
    5. 调整照明强度, 直到一个小细胞暗淡, 但在背景清晰可见 (一个信号到背景比的7–8的一个萌芽的子细胞是一个合理的值)。注意/标记未来实验的照明强度。
    6. 将软件配置为每隔2小时2分钟获取一张图像。
19. 开始连接阶段的图像采集。大约5和10分钟后再检查, 以确保保持焦点。如果没有, 则尝试在获取下一个图像后立即调整焦点。
20. 在附着阶段完成后, 保存文件, 然后打开绿色和橙色侧生长瓶阀, 同时关闭两个附件烧瓶阀。如果在孵化室内有任何阀门, 请注意不要撞击舞台。
21. 从电炉搅拌器拔下温度计探针。
22. 从电炉搅拌器中取下附件烧瓶, 将生长瓶放在原位。
23. 将软件配置为每隔15分钟采集一张图像22小时, 并开始对生长阶段进行图像采集。不需要重新对焦, 但强烈建议在几个小时后检查流量设备。
    1. 检查泵上游空气泄漏的接头 (再次出现气泡形成正常), 或下游流体泄漏
    2. 检查生长介质烧瓶、PD 和 FB 是否都是滴水介质 (如果没有的话, 这可能表明过滤器堵塞, overtightened 耳钳, 或在带刺的管件上堵塞, 如果使用的细胞絮凝)。
    3. 检查 FB 中的液位。如果媒体接近瓶子顶部 (超过1.5 厘米以上的过滤器顶部), 拧紧两个螺旋盖 (不要松开它们, 因为这个烧瓶是在压力下)。如果他们不会进一步收紧, 继续试验 (虽然这可能导致泄漏), 并更换在 PD 和 FB 的橡胶垫片下一次清洁后。
24. 当生长阶段采集完成后, 保存文件, 然后打开绿色和橙色侧附件烧瓶阀, 可能会发出噪音作为在橙色一侧的压力释放。从两个培养基瓶中拉出绿色侧管, 直到它们至少在介质上方有几厘米。以高速运行泵 (约100毫升/分钟, 或按住泵上的快进按钮), 从油管中取出所有介质, 使清洗变得容易得多。清空时, 断开泵的流量装置, 并将其从显微镜中取出。

3. 清洁流动装置

1. 卸下所有非高压灭菌组件 (单次使用组件、气泡疏水阀和温度探头), 并使用高压灭菌器30分钟. 弃用一次性组件, 用70% 乙醇清洁探针, 并预留气泡疏水阀。
2. 高压灭菌完成后, 丢弃介质, 冲洗并放置培养基烧瓶。然后重新连接气泡疏水阀, 连接信息处理通道滑块用于清洁 (可重复使用), 并将流量系统连接到泵的位置, 如图 1所示。
3. 夹紧关闭橙色侧生长瓶阀。
4. 将约200毫升未稀释漂白剂放入烧杯中。将橡胶瓶塞放到漂白剂中, 然后以高速启动泵, 在整个流动装置中循环漂白 (除所有过滤器外)。一旦填充漂白剂, 停止泵, 因为离开泵在高速可以磨损和打破油管。
5. 漂白15分钟后, 握住烧杯上方的橡胶瓶塞, 再次启动泵, 从流动装置中取出漂白剂。
6. 重复步骤3.4 和3.5 两次用过量的水, 而不是漂白剂冲洗流系统。在此期间, 只有用水清洁过滤器, 因为其他清洁剂会腐蚀或堵塞过滤器。
   1. 将通常连接到0.2 µm 介质过滤器 (来自2µm FB) 到烧杯水中的油管与步骤3.6 中的橡胶瓶塞相连。
   2. 断开连接到20µm 直插式过滤器入口的油管, 尽管耳钳可以轻松地拆下。
   3. 通过一个备用的3孔塞子使用真空滤瓶和长段油管, 创建一个可连接到流量装置的真空系统。
   4. 将此真空系统连接到20µm 过滤器入口的入口, 然后开始真空;这将水通过过滤器在相反的方向, 去除死细胞。
   5. 通过过滤器拉出至少200毫升的水, 然后从水中取出油管, 清空滤水线。
   6. 断开真空系统与20µm 过滤器的连接, 然后将过滤器重新连接至正常油管。

4. 量化视频

注意: 所有文件都需要转换为标记图像文件 (TIF) 格式才能正常工作。此外, 为了比较实验, 重要的是所有的图像都采用相同的显微镜和成像参数, 如上文所述。

1. 下载并安装 ImageJ 如果尚未安装。
2. 下载补充宏文件, 并将其放在 ImageJ \ 宏文件夹中。
3. 调整提供的宏:
   1. 从 ImageJ 中的上一个实验打开图像堆栈, 然后选择包含单元格的时间点。
   2. 从菜单中选择"图片 |类型 |8位 "。
   3. 从菜单中选择"图片 |调整 |阈值 "。检查"深色背景"框。将右侧下拉菜单设置为红色。
   4. 调整较低的值, 直到所有单元格都以红色覆盖, 且多余的噪声最小 (某些非单元格斑点是正常的, 将由宏处理)。记下此较低值。
   5. 关闭阈值窗口和打开的图像。
   6. 从菜单中选择"插件 |宏 |编辑 "。提示打开文件时: "上移一个文件夹级别", 然后选择 "宏" 文件夹并打开流生物膜量化宏文件。
   7. 将"setThreshold (15, 255) " 的所有实例中的15值更改为步骤4.3.4 中确定的值。保存文件并关闭此窗口。
4. 从菜单中选择 "插件 |宏 |安装 "并选择流生物膜定量文件。
5. 现在, 在"插件 |宏 "菜单, 六新选项的各种视频量化出现。运行完整的分析并选择附件和增长视频文件, 当系统提示您对获取的数据执行所有可用分析并自动生成输出文件时。

结果

在图 2a和补充视频 1中, 使用野生型白色白细胞在37摄氏度下进行正常过夜延时实验的代表性图像。图像经过对比增强, 可提高可见性。对原始数据进行量化, 在图 2B中可以看出代表性图。为了生成这些图, 数据首先归一化到成像区域 (即除以总成像面积), 分离进一步归一化为生?...

讨论

使用上述流程系统, 可以生成真菌生物膜生长和发育的定量延时视频。为了使实验进行比较, 必须确保成像参数保持不变, 这一点至关重要。这包括确保为每个实验设置科勒照明的显微镜 (许多参考线可在线进行此过程)。除了成像参数, 在使用流设备时还要牢记一些重要步骤。首先, 确保气泡疏水阀在流体流动过程中保持真空, 这一点很重要, 因为如果不这样做, 将导致空气通过气泡疏水阀被拉入。同...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pump	Cole Parmer	07522-20	6
Pump head	Cole Parmer	77200-60	6
Tubing	Cole Parmer	96410-14	N/A
Bubble trap adapter	Cole Parmer	30704-84	3
Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line	Cole Parmer	31500-55	3
In-line filter adapter (4 needed)	Cole Parmer	31209-40	8,9
Orange-side Y	Cole Parmer	31209-55	7
Green-side Y	ibidi	10827	2
* Slides	ibidi	80196	4
* Slide luers	ibidi	10802	4
Vacuum assisted Bubble trap	Elveflow/Darwin microfluidics	KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit	3
Media flasks	Corning	4980-500	1
0.2 µm air filter	Corning	431229	1
Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)	Corning	1395-100	5,10
Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)	Wheaton	1129750	5,10
Screwcap tubing connector	Wheaton	1129814	5,10
Tubing connector beveled washer	Danco	88579	5,10
Tubing connector flat washer	Danco	88569	5,10
Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	15100002-100	7,8,9
Clamp tool	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	14100386	N/A
20 μm in-line media filter	Analytical Scientific Instruments	850-1331	8
10 μm in-line media filter	Analytical Scientific Instruments	850-1333	9
2 μm inlet media filter	Supelco/Sigma-Aldrich	58267	10
* 0.22 µm media filter	Millipore	SVGV010RS	11
* 0.22 µm media filter “adapter”	BD Biosciences	329654	11
Rubber stopper	Fisher Scientific	14-131E	1
Hotplate stirrer with external probe port	ThermoFisher Scientific	88880006	N/A
Temperature probe	ThermoFisher Scientific	88880147	N/A