실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

요약

어셈블리, 동작, 설명 그리고 흐름에서 실시간으로에서 이미지 균 biofilm 형성 하도록 설계 흐름 기구의 청소. 우리는 또한 제공 하 고 인수 이미지에 사용할 수 양적 알고리즘 토론.

초록

Oropharyngeal 칸디 다에서 칸디 다 속의 멤버 준수 하 고 침 흐름의 영향 아래 구두 점 막 표면에 성장 해야 합니다. 흐름에서 성장에 대 한 모델을 개발 하는 동안 이러한 시스템의 대부분, 또는 이미징 동안 셀 흐름에서 허용 하지 않습니다. 우리는 우리가 성장과 개발 흐름에서 실시간으로 칸디 다 albicans 셀의 이미지를 새로운 기구를 개발 했습니다. 여기, 우리 선발 어셈블리 및이 흐름 장치의 사용 뿐만 아니라 생성 되는 데이터의 정량화에 대 한 프로토콜. 우리 세포를 연결 하 고 슬라이드 뿐만 아니라 슬라이드에 바이오 매스의 측정 시간이 지남에 확인할에서 분리 속도 정할 수 있습니다. 이 시스템은 경제적이 고 다재 다능 한, 저렴 한 벤치탑 현미경를 포함 하 여 가벼운 현미경의 많은 종류 및 수 있는 확장 이미징 다른 흐름 시스템에 비해 시간. 전반적으로, 이것은 낮은 처리량 시스템 biofilm 성장의 흐름에서 곰 팡이 종에 매우 상세한 실시간 정보를 제공할 수 있는.

서문

Candida albicans (C. albicans)은 인간의 많은 조직 유형, 구강 점 막 표면을 포함 하 여, oropharyngeal 칸디 다 증을 일으키는 원인이 되 고 영향을 받는 개인¹대 한 생명의 낮은 품질의 결과 감염 시킬 수 있는 기회 곰 팡이 병원 체 이다. C. albicans의 병 인에 대 한 중요 한 특성은 Biofilm 형성 및 형성과 C. albicans biofilms^2,3,4,^{의 기능에 다 수의 연구 수행 되었습니다. 5}, 생체 외에서 정적 (흐름)를 사용 하 여 실시 되어 많은 모델. 그러나, C. albicans 는 준수 하 고 구강에 타 액 흐름의 면 전에 서 성장 해야 합니다. 수많은 흐름 시스템 라이브 셀 이미징^6,7,8,,910수 있도록 개발 되었습니다. 이러한 다른 흐름 시스템 다른 목적을 위해 설계 되었습니다 그리고 그러므로 각 시스템에 서로 다른 강점과 약점. 우리는 C. albicans 에 대 한 적절 한 시스템 흐름의 많은 비용이 많이 드는 했다, 필요한 복잡 한 부품, 조작 또는 하지 될 수 흐름 중 몇 군데와 이미징 이전 중지 했다 발견. 따라서, 우리는 흐름 제¹¹ C. albicans biofilm 형성 연구에 새로운 흐름 장치를 개발 했다. 우리의 흐름 장치 설계, 동안 우리는 이러한 주요 고려 사항을 따라. 첫째, 우리 biofilm 성장과 발전의 여러 측면을 계량 수 싶 었 어 요 (수 있도록 우리 연구 돌연변이 체 긴장 및 수정 되지 않은 임상 분리를 쉽게) 형광 세포의 사용을 요구 하지 않고 실시간. 둘째, 우리가 원하는 모든 부분을 거의 수정 없이 상업적으로 사용할 수 (즉., 아니 주문 제작), 다른 더 쉽게 우리의 시스템을 다시 만들 수 있도록 하 고 쉽게 수리에 대 한 허용. 셋째, 우리 또한 하 고 싶 었 확장 수 있도록 합리적으로 높은 흐름 율에 이미징. 마지막으로, 우리 싶어, 흐름, 아래 기판에 연결 하는 셀의 기간 뒤에 새로운 셀을 도입 하지 않고 오랜된 시간 동안 biofilm 성장을 모니터 할 수 있을.

이러한 고려 사항 지도 그림 1에 나와 있는 2 플라스 크 반복 흐름 시스템을 개발 했다. 두 개의 플라스 크 2 단계, 셀 시드 첨부 플라스 크에서 그리는 첨부 파일 단계와 성장 단계를 사용 하 여 셀 무료 미디어 새로운 셀의 추가 없이 biofilm 성장을 계속 실험을 분할 수 있습니다. 이 시스템은 앞 (2 ~ 5, 그림 1), 인큐베이터 안에 배치 되 고 튜브 슬라이드와 현미경에 대 한 보육 챔버와 함께 작동 하도록 설계 하 고 밖에 서 큰 보조 컨테이너에서 다른 모든 구성 요소 배치는 현미경입니다. 또한, 연결 된 온도 프로브 열판 활동가 37 ° c.에 첨부 플라스 크에 균 세포를 유지 하기 위해 사용 됩니다. 재순환은이 시스템은 지속적인 영상 흐름 (36 h 이상의 조건에 따라 일 수 있다), 중 고 직 립 또는 거꾸로 벤치탑 현미경을 포함 하 여 대부분의 표준 현미경에 사용 될 수 있습니다. 여기, 우리 어셈블리, 작업, 토론 고 흐름 기구의 청소 뿐만 몇 가지 기본적인 ImageJ 양적 알고리즘 실험 후 비디오 분석을 제공 합니다.

프로토콜

1. 흐름 장치 조립

1. 아래에서 설명 하는 고려 그림 1에서 도식에 따라 재료의 테이블에 에서 나열 된 부품을 구성 합니다.
   참고: 편의 위해, 장치 두 가지 측면, 녹색 측면 (모든 업스트림 미디어 플라스 크를 슬라이드의), 그리고 오렌지 나누어 흐름 측면 (모든 다운스트림 미디어 플라스 크를 슬라이드의).
   1. 모든 흐름 장치 공기 누출, 미디어 플라스 크 (그림 1, 1)의 유일한 예외를 방지 하기 위해 꽉 있는지 확인 합니다. 이 위해 적용할 배관공 테이프 맥 dampener (PD)와 2 µ m 필터 병 (FB)을 제외 하 고 조립 하기 전에 어떤 남성 스레딩 배관공 테이프 필요 없는 고무 가스 켓 밀폐 그들을 유지.
   2. 모든 가시 피팅 긍정적인 압력 하에서 정상 작동 중에 귀 클램프를 적용 (즉, 펌프의 하류).
   3. 사용 색상 코딩 A 또는 G 밸브 위치를 랩 테이프 (첨부 파일 및 성장, 각각), 펌프 위치, 슬라이드 연결 위치와 0.2 µ m 필터 연결.
   4. 현미경, 모든 흐름 장치를 하류 (오렌지 사이드의 대다수) 플라스 크에 펌프의에 있어야 보조 포함 다는 것을 명심 하 고 흐름 시스템 사이의 거리를 기반으로 하는 사용 되는 튜브의 길이 결정 합니다. 여분의 튜브의 약 1 m 추가 업스트림의 슬라이드 (선호 거품 트랩)이 슬라이드에 도달 하는 모든 미디어는 정확한 온도에 있을 것입니다 보장으로 현미경 인큐베이션 챔버 내를.
   5. 장소 슬라이드 선호 챔버 내부에 부 화는 실험 동안에 가능한 합리적으로 가깝게 거품 트랩 (거품 튜브 벽을 따라 종종 폼); 그러나, 명심 해야 작동 하는 진공에 연결.
   6. FB와 0.2 µ m 일회용 필터는 약 0.5 m 사이의 배관을 확인 합니다.
   7. 추가 각 미디어 플라스 크에 약 2 cm 자기 저 어 바.
   8. 차단 밸브 (hemostats를 사용할 수 있습니다) 역할을 튜브 클램프의 일종을 얻을.
   9. 사용의 용이성, 멸 바구니에 흐름 장치를 계속. 그것은 녹색 사이드와 오렌지 사이드의 쉬운 별거를 허용 하는 큰 하나에 두 번째 작은 바구니를가지고 유용할 수 있습니다.
   10. 4 m m 드릴 비트를 사용 하 여 첨부 파일 플라스 크에 대 한 열 프로브 (다른 구멍을 통해 갈 수 없습니다 돌)에 맞게 고무 마 개에 여분의 구멍을 드릴 합니다. 포트를 통해 튜브를 얻으려면 배관을 통해 밀어 핀셋; 일단, 장소, 그리고 핀셋 다시 밖으로 당겨에 게 튜브 클램프.
       참고: 고무 마 개에 여분의 구멍을 추가 불가능, 4-포트 나사 모자와 함께 넓은 입 나사 병 플라스 크 및 고무 스 토퍼 대신 작동 수 있습니다.
2. 일단 흐름 시스템은 완벽 하 게 조립 되었습니다, 모두 녹색과 주황색 쪽 성장 플라스 크의 밸브를 닫습니다. 첨부 파일 플라스 크 튜브와 졸업된 실린더 물을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 연동 펌프를 보정.

2. 실험 수행

1. 실험, 전날 미리 현미경 인큐베이션 챔버 37 ° C에 난방 시작 하 고 준비 하는 곰 팡이 긴장의 숙박 문화 (형광 필요 하지 않습니다).
2. 단일 사용 하 여 구성 요소 및 펌프, 수집 하 고 살 균 biosafety 내각 장소.
3. 거품 트랩 제거 온도 흐름 장치에서 조사 하 고 biosafety 내각에 배치 합니다.
4. Detangle 하 고 필요한 경우는 튜브를 구성.
5. 고압 무 균; 되도록 30 분 저 어 바를 포함 하 여 흐름 장치 완료 되 면, 캐비닛 biosafety 전송.
6. 그림 1에서처럼 거품 트랩, 온도 프로브, 및 (슬라이드)를 제외 하 고 모든 단일 사용 구성 요소를 연결 합니다.
   1. 0.2 µ m 필터 (그림 1, 11)에서 "어댑터"로 그것을 만들기 위해 1 mL 주사기 플런저를 제거 합니다. 이 끝으로 FB에서 튜브를 강제 하 고 성장 플라스 크에 지도 하는 튜브를 0.2 µ m 필터를 연결 합니다.
   2. 이 수 시스템에 공기 누출을 방지, 그것을 연결 하기 전에 슬라이드 어댑터 (내부에 어떤 그리스를 받을 수 없습니다 돌)의 바바라 주위 실리콘 진공 그리스를 적용 합니다.
7. 1% (w/v) 효 모 추출 물, 2% (w/v) 펩, 및 2% (w/v) 포도 당 (YPD), 100 mL와 함께 첨부 파일 플라스 크와 YPD의 200 mL와 함께 성장 플라스 크를 채우기. 녹색 측면 튜브 각 플라스 크에 미디어에 도달 하면 확인 하십시오.
8. 모든 밸브가 열려 있는지 확인 합니다. 진공, 거품 트랩을 부착 하 고 녹색 측면 튜브에 펌프를 연결 거품 트랩의 다운스트림.
9. 완전히 녹색 측면을 작성, 분배 그리고 밀리 리터의 처음 몇은 종종 죽은 세포 또는 무작위 파편을 포함 하기 때문에 미디어의 약 1-2 mL를 삭제를 3.3 mL/min의 유량에 액체 펌프. 튜브의 녹색 측면 미디어, 가득, 진행 하기 전에 거품의 하류 없는 거품 있다 확인 하십시오.
10. 거품을 소개 하도록 하지 YPD에 채워 채널 슬라이드와 저수지.
11. 버퍼를 만들려면 약 0.5 m의 오렌지 쪽에 더 많은 유체 흐름 장치 및 펌프를 슬라이드를 연결 합니다. 이것은 트랩 공기 역류 경우 슬라이드에서 실수로 방지 하입니다.
12. 현미경을 전송에 대 한 흐름 장치 준비: 클램프 폐쇄 입구와 출구 거품 트랩, 그리고 녹색과 오렌지 사이드 첨부 플라스 크 밸브 폐쇄 클램프의. 압력가 마로 소독 하는 동안 불지 수로 PD와 FB 나사 뚜껑 꽉 있는지 확인 하십시오.
13. 쉽게 전송 하기 위해 배관에서 펌프를 분리 합니다. 다음 현미경 근처 보조 용기에 열판 활동가 포함 하 여 모든 구성 요소를 이동 합니다.
14. 이미징에 대 한 흐름 장치를 준비 합니다.
    1. 열판 교 반기를 온도 프로브를 연결 하 고 37 ° c 첨부 플라스 크를가 열 시작 300 rpm에서 미디어를 저 어 하 고이 모든 실험에 대 한 유지.
    2. 현미경에 슬라이드를 탑재 하 고 단단히 그것을 확보 하기 위해 필요한 경우 테이프를 사용 합니다.
    3. 진공 거품 트랩을 연결 (할 실행 취소 하지 클램프 아직).
    4. 그림 1에 표시 된 위치에서 흐름 장치에 펌프를 연결 합니다.
    5. 3.3 mL/min의 유량에 펌프를 시작 하 고 약 5-10 s, 실행할 수 있도록 다음 거품 트랩 입구/출구 클램프를 제거 합니다.
    6. 첨부 파일 플라스 크가 열 하는 동안 계속 해 서 펌프를 수 있습니다. 일단 미디어 흐름 시스템을 통해 유포 하고있다, 정상 작동 확인 합니다.
       1. 공기에 누출에 대 한 피팅 확인 업스트림 펌프 (일부 거품 형성은 정상 임), 또는 하류 밖으로 유출 하는 액체의.
       2. 성장 미디어 플라스 크, PD, FB는 모든 떨어지는 미디어 입구 관에서 (해당 되는 경우,이 막힌된 필터 또는 조이면된 귀 클램프를 나타낼 수 있습니다) 확인 합니다.
       3. 현미경을 사용 하 여 채널에 연결 된 또는 롤링 셀 확인 합니다. 세포의 과도 한 수 설정, 동안 오염 나타낼 수 있습니다 또는 교체 요구는 거품의 소계 (PTFE) 멤브레인 함정.
15. 일단 첨부 파일 플라스 크와 배양 챔버는 37 ° C에서 둘 다, 1 x 10⁶ 셀/mL까지 첨부 플라스 크에 곰 팡이 세포의 충분 한 숙박 문화를 추가 합니다.
    참고: 볼륨 µ L에 추가을 계산할 수 있습니다이 수식을 사용 하 여:
    
16. 적응을 셀 수 있도록 15 분 기다립니다.
17. 셀의 흐름을 시작 하 두 성장 플라스 크 밸브를 닫는 동안 모두 녹색과 주황색 쪽 첨부 파일 플라스 크 밸브를 엽니다.
18. 셀 슬라이드에 연결할 수 있도록 약 5 분을 기다립니다 고 (이 이번 녹색 측면 튜브의 길이 따라 조정 해야 할 수도 있습니다) 현미경의 초기 초점 허용 합니다. 이 시간 동안 현미경 이전 실험에 사용 된 동일한 이미지 매개 변수를 조정 합니다. 첫 번째 실행 인 경우 다음이 단계를 따르십시오.
    1. 낮은 확대 공기 목적으로 전환 합니다.
    2. 찾기 및 연결 된 셀 또는 작은 신진 셀에 초점.
    3. 쾰러 조명에 대 한 콘덴서 구성 다음 darkfield를 전환 합니다.
    4. 300 ms 노출 시간을 설정 합니다.
    5. 작은 셀 희미 한 아직 배경 (신진 딸 셀 배경 비율이 약 7-8의 신호는 합리적인 값)에 대 한 명확 하 게 표시 될 때까지 조명 강도 조정 합니다. 참고/마크 미래 실험을 위한 조명 강도.
    6. 이미지 마다 2 분 이상 2 시간을 취득 하는 소프트웨어를 구성 합니다.
19. 첨부 파일 단계에 대 한 이미지 수집을 시작 합니다. 약 5 후 다시 확인 하 고 초점을 보장 하기 위해 10 분 유지 되었습니다. 그렇지 않은 경우에 다음 이미지를 획득 한 후에 즉시 초점을 조정 하려고.
20. 첨부 파일 단계 완료 된 후에 즉시 파일을 저장 한 다음 두 첨부 파일 플라스 크 밸브를 닫는 동안 모두 녹색과 주황색 쪽 성장 플라스 크 밸브를 엽니다. 알아서 하지 어떤 밸브는 챔버 내부에 부 화 하는 경우 단계를 범프.
21. 열판 교 반기에서 온도계 프로브를 분리 합니다.
22. 열판 교 반기에서 첨부 파일 플라스 크를 제거 하 고 그 자리에 성장 플라스 크를 놓습니다.
23. 이미지 마다 15 분 이상 22 h 고 성장 단계에 대 한 이미지 수집을 시작 하는 소프트웨어를 구성 합니다. 다시 초점 해서는 안 필요, 하지만 몇 시간 후 흐름 장치를 확인 하기 좋습니다.
    1. 공기에 누출에 대 한 피팅 확인 펌프 (다시 일부 거품 형성은 정상), 또는 하류 밖으로 유출 하는 액체의 업스트림
    2. 확인 성장 미디어 플라스 크, PD, FB는 모두 떨어지는 미디어 (해당 되는 경우,이 막힌된 필터, 조이면된 귀 클램프 또는 가시 피팅 셀 사용 되 고 flocculate 하는 경우에 덩어리를 나타낼 수 있습니다).
    3. FB에 액체 수준을 확인 합니다. 미디어 병 (이상 필터의 상단 위에 1.5 cm)의 상단에 도달 하면 (할 하지 느슨하게이 플라스 크 압력으로) 두 screwcaps를 조입니다. 그들은 더 강화 하지 것입니다, 계속 실험 (비록이 누수에서 될 수 있습니다), 다음 청소 후 PD와 FB에 고무 가스 켓을 교체 하 고.
24. 성장 단계 취득 완료 되 면, 파일을 저장 한 다음 오렌지 측에는 압력 해제로 소음을 만들 수 있습니다 녹색 및 주황색 첨부 플라스 크 밸브를 엽니다. 그들은 미디어 위에 적어도 몇 센티미터까지 모두 미디어 플라스 크에서 오는 녹색 측 배관에 올려. 훨씬 더 쉽게 청소 하 게 배관에서 모든 미디어를 제거 하는 고속 (약 100 mL/min 또는 펌프에 빨리 감기 버튼을 길게) 펌프를 실행 합니다. 비운, 흐름 장치는 펌프에서 분리 하 고 현미경에서 그것을 제거.

3. 깨끗 한 흐름 장비

1. (단일 사용 구성 요소, 거품 트랩 및 온도 프로브), 모든 비 멸 구성 요소를 제거 하 고 압력솥 30 분 삭제에 대 한 흐름 장치 단일 사용 구성 요소, 70% 에탄올으로 깨끗 한 프로브를 사용 하 고 거품 트랩을 따로.
2. 압력가 마로 소독 완료 후 미디어, 폐기 린스 하 고 미디어 플라스 크를 따로 설정. 거품 트랩에 다시 연결, ibidi 채널 슬라이드 (재사용), 청소 하는 데 사용할 고 그림 1에 표시 된 위치에 펌프에 흐름 시스템을 연결.
3. 클램프는 오렌지 사이드 성장 플라스 크 밸브를 폐쇄.
4. 비 커에 undiluted 백제의 약 200 mL를 놓습니다. 표 백제, 고무 마 개를 삽입 하 고 순환 흐름 장치 (를 제외 하 고 모든 필터)에 걸쳐 표 백제를 높은 속도에서 펌프를 시작 합니다. 표 백제로 가득, 일단 착용 하 고 휴식 튜브는 고속에 펌프를 떠나 있기 때문에 펌프를 중지 합니다.
5. 15 분 동안 표백 후 비 커 위에 고무 마 개를 누른 펌프 흐름 장치에서 제거 하는 표 백제를 다시 시작 합니다.
6. 3.4와 3.5 흐름 시스템을 씻어 표 백제 대신 초과 물으로 두 번 단계를 반복 합니다. 이 시간 동안 다른 청소 요원 부식 또는 필터를 방해할 것 이기 때문에 물으로만 필터를 청소.
   1. 일반적으로 연결할 것 (2 µ m FB에서에서 오는) 0.2 µ m 미디어 필터 고무 마 개와 비 커 물으로 단계 3.6에서에서 튜브를 놓습니다.
   2. 당길 수 있다 일반적으로 떨어져 쉽게 귀 클램프에도 불구 하 고 20 µ m 인라인 필터의 입구에 연결 된 튜브를 분리 합니다.
   3. 진공 필터 플라스 크 및 예비 3 구멍 마 개를 통해 튜브의 긴 단면도 사용 하 여 흐름 장치에 연결할 수 있는 진공 시스템을 만들.
   4. 20 µ m 필터 입구의 입구에이 진공 시스템을 연결 하 고 진공; 시작 이 죽은 세포를 제거 하는 반대 방향에서 필터를 통해 물을 끌어.
   5. 필터를 다음 제거 물 필터 라인을 물에서 튜브를 통해 물 풀 적어도 200 mL.
   6. 20 µ m 필터에서 진공 시스템을 분리 하 고 필터는 일반 튜브를 다시 연결 합니다.

4. 측정 동영상

참고: 모든 파일 작업 태그 이미지 파일 (TIF) 형식으로 변환 해야 합니다. 또한, 실험 사이 비교, 그것은 중요 한 모든 이미지 같은 현미경 및 이미징 매개 변수와 함께 찍은 위에서 설명한 대로.

1. 다운로드 및 아직 설치 하지 않은 경우 ImageJ를 설치.
2. 추가 매크로 파일을 다운로드 하 고 ImageJ\macros 폴더에.
3. 제공 된 매크로 조정:
   1. ImageJ에 이전 실험에서 이미지 스택을 열고 세포 존재와 시간 점을 선택 합니다.
   2. 를 통해 메뉴에서 선택 "이미지 | 유형 | 8 비트 ".
   3. 를 통해 메뉴에서 선택 "이미지 | 조정 | 임계값". "어두운 배경" 확인란을 선택 합니다. 빨강 오른쪽 드롭다운 메뉴를 설정 합니다.
   4. 모든 셀은 빨간색 (일부 비-셀 speckling 괜 찮 아 요 및 매크로 의해 처리 될 것 이다) 최소한의 초과 잡음으로 덮여 때까지 낮은 값을 조정 합니다. 이 더 낮은 가치를 적어 둡니다.
   5. 임계값 창 및 오픈 이미지를 닫습니다.
   6. 를 통해 메뉴에서 선택 "플러그인 | 매크로 | 편집". 파일을 열 것인지 묻는 메시지가 나타나면: "한 폴더 수준 위로 이동", 다음 매크로 폴더를 선택 하 고 흐름 biofilm 정량화 매크로 파일을 엽니다.
   7. 15 "setThreshold (15, 255);" 의 모든 인스턴스 값 단계 4.3.4에서에서 결정 하는 값을 변경 합니다. 파일을 저장 하 고이 창을 닫습니다.
4. 통해 메뉴에서 선택 "플러그인 | 매크로 | "설치 하 고 선택 흐름 biofilm 정량화 파일.
5. 이제는 에서 "플러그인 | 매크로" 메뉴, 다양 한 비디오 quantifications에 대 한 6 개의 새로운 옵션이 나타납니다. 완전 한 분석 을 실행 하 고 첨부 파일 및 성장 비디오 파일 수집 된 데이터에서 모든 사용할 수 있는 분석을 수행 하 고 자동으로 출력 파일을 생성 하 라는 메시지가 나타나면 선택 합니다.

결과

보통의 대표 이미지 하룻밤 시간 경과 실험 야생-타입 C. albicans 를 사용 하 여 셀 37 ° C에서 볼 수 있습니다 그림 2A 에 추가 동영상 1. 이미지 대비 가시성 향상을 향상 되었습니다. 원래 데이터의 정량화를 수행 하 고 대표적인 그래프 그림 2B에서 볼 수 있습니다. 이러한 그래프를 생?...

토론

흐름 시스템을 사용 하 여 위에서 설명한 대로 균 biofilm 성장과 개발의 양적 시간 경과 비디오의 생성에 대 한 수 있습니다. 비교 실험에 대 한 수 있도록 그것 이미징 매개 변수는 같은 유지 되도록 중요 한 중요성 이다. 현미경 (많은 가이드 온라인 사용할 수 있습니다이 프로세스에 대 한) 각 실험에 대 한 쾰러 조명에 대 한 설정 되어 보장 포함 됩니다. 매개 변수, 이미징 제외 흐름 장치를 작업?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pump	Cole Parmer	07522-20	6
Pump head	Cole Parmer	77200-60	6
Tubing	Cole Parmer	96410-14	N/A
Bubble trap adapter	Cole Parmer	30704-84	3
Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line	Cole Parmer	31500-55	3
In-line filter adapter (4 needed)	Cole Parmer	31209-40	8,9
Orange-side Y	Cole Parmer	31209-55	7
Green-side Y	ibidi	10827	2
* Slides	ibidi	80196	4
* Slide luers	ibidi	10802	4
Vacuum assisted Bubble trap	Elveflow/Darwin microfluidics	KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit	3
Media flasks	Corning	4980-500	1
0.2 µm air filter	Corning	431229	1
Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)	Corning	1395-100	5,10
Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)	Wheaton	1129750	5,10
Screwcap tubing connector	Wheaton	1129814	5,10
Tubing connector beveled washer	Danco	88579	5,10
Tubing connector flat washer	Danco	88569	5,10
Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	15100002-100	7,8,9
Clamp tool	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	14100386	N/A
20 micron in-line media filter	Analytical Scientific Instruments	850-1331	8
10 micron in-line media filter	Analytical Scientific Instruments	850-1333	9
2 micron inlet media filter	Supelco/Sigma-Aldrich	58267	10
* 0.22 µm media filter	Millipore	SVGV010RS	11
* 0.22 µm media filter “adapter”	BD Biosciences	329654	11
Rubber stopper	Fisher Scientific	14-131E	1
Hotplate stirrer with external probe port	ThermoFisher Scientific	88880006	N/A
Temperature probe	ThermoFisher Scientific	88880147	N/A