Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow

Zusammenfassung

Beschreiben wir die Montage, Betrieb, und Reinigung von einem Fluss Apparat Bild Pilz Biofilmbildung in Echtzeit unter fließen sollen. Wir bieten und diskutieren quantitative Algorithmen auf die aufgenommenen Bilder verwendet werden.

Zusammenfassung

Im oropharyngealen Candidose müssen Mitglieder der Gattung Candida halten und wachsen auf der mündlichen Schleimhautoberfläche während unter dem Einfluss von Speichel fließen. Während Modelle für das Wachstum unter Strömung entwickelt wurden, viele dieser Systeme sind teuer oder nicht zulassen, imaging, während die Zellen unter Strom stehen. Wir haben ein neuartiges Gerät entwickelt, das uns erlaubt, das Wachstum und die Entwicklung von Candida Albicans Zellen durch fließen und in Echtzeit-Bild. Hier zeigen wir das Protokoll für die Montage und Nutzung von dieser Strömung Apparat sowie die Quantifizierung der Daten, die generiert werden. Wir sind in der Lage, die Preise zu quantifizieren, die die Zellen zum Anfügen und trennen von Folie, sowie ein Maß für die Biomasse auf der Folie im Laufe der Zeit zu bestimmen. Dieses System ist wirtschaftlich und vielseitig, mit vielen Arten von Lichtmikroskopen, einschließlich preiswerte Benchtop Mikroskopen arbeiten und ist in der Lage, erweitert imaging Zeiten im Vergleich zu anderen wasserführenden Systemen. Insgesamt ist dies ein niedriger Durchsatz-System, die sehr detaillierte Echtzeit-Informationen auf das Wachstum von Biofilm Pilzarten unter Strom liefern kann.

Einleitung

Candida albicans (C. Albicans) ist eine opportunistische pilzliche Erreger von Menschen, die viele Gewebetypen, einschließlich mündliche Schleimhaut-Oberflächen, wodurch oropharyngealen Candidose und daraus resultierende in eine geringere Lebensqualität für die betroffenen Personen¹infizieren können. Biofilmbildung ist ein wichtiges Merkmal für die Pathogenese von C. Albicans, und zahlreiche Studien haben auf die Bildung und Funktion von C. Albicans Biofilme^{2,3,4getan wurde, 5}, viele davon wurden durchgeführt mit statisch (keine Strömung) in-vitro- Modelle. Allerdings müssen C. Albicans halten und wachsen in Gegenwart von Speichel fließen in die Mundhöhle. Zahlreiche Flow-Systeme wurden entwickelt, um für live Cell imaging^6,7,8,9,10ermöglichen. Diese verschiedenen Flow-Anlagen sind für verschiedene Zwecke konzipiert und daher jedes System hat unterschiedliche Stärken und Schwächen. Wir fanden, dass viele der Strömung, die Systeme für C. Albicans angemessen waren kostspielig, erforderliche Anlage fabriziert Teile, oder könnte nicht abgebildet im Fluss und vor Bildgebung gestoppt werden musste. Daher entwickelten wir eine neuartige Strömung Apparat um C. Albicans Biofilmbildung unter Fluss¹¹zu studieren. Bei der Konzeption unserer Flow-Apparate folgten wir dieser wichtigen Überlegungen. Erstens wollten wir mehrere Aspekte der Biofilm Wachstum und Entwicklung in quantifizieren zu können ohne die Verwendung von fluoreszierenden Zellen (so dass uns Studie mutierte Stämme und unveränderten klinischen Isolaten leicht) in Echtzeit. Zweitens wollten wir alle Teile mit wenig bis keine Änderungen im Handel erhältlich sein (zB., keine eigene Fertigung), andere mehr einfach unser System neu und für einfache Reparaturen. Drittens: Wir wollten auch ermöglichen längere Zeiten bei relativ hohen Flussraten imaging. Schließlich wollten wir, nach einer Phase der Zellen, die Befestigung auf dem Untergrund durch fließen, der Biofilm-Wachstum über einen längeren Zeitraum ohne Einführung neue Zellen überwachen zu können.

Diese Überlegungen führten uns zu zwei Kolben rezirkulierenden Flow-System in Abbildung 1dargestellt. Die zwei Kolben ermöglichen es uns, das Experiment in zwei Phasen, eine Anlage-Phase, die aus der Zelle ausgesät Anlage Flasche zieht und eine Wachstumsphase, die zellfreien Medien nutzt, um den Biofilm wachsen ohne den Zusatz von neuen Zellen aufgeteilt. Dieses System dient zur Arbeit mit einer Inkubation Kammer für das Mikroskop mit der Folie und der Schlauch davor (2 bis 5, Abbildung 1) in die brutmaschine gelegt und alle anderen Komponenten in einem großen sekundären Behälter außerhalb der Mikroskop. Darüber hinaus eine Herdplatte Rührer mit einem angeschlossenen Temperaturfühler verwendet wird, um Pilzzellen in der Anlage Kolben bei 37 ° c zu halten Wie es Rezirkulation ist, dieses System ist in der Lage, kontinuierliche Bildgebung während Flow (kann über 36 h je nach Bedingungen), und auf die gängigen Mikroskope, einschließlich aufrecht oder invertierte Benchtop Mikroskopen verwendet werden kann. Hier diskutieren wir die Montage, Betrieb, und Reinigung des Apparates fließen, sowie als bieten einige grundlegende ImageJ quantitativen Algorithmen, die Videos nach einem Experiment zu analysieren.

Protokoll

1. Montieren Sie den Flow-Apparat

1. Konfigurieren Sie die Teile mit den unten beschriebenen Überlegungen in die Tabelle der Materialien gemäß dem Schaltplan in Abbildung 1 aufgeführt.
   Hinweis: der Einfachheit halber der Fluss Apparat gliedert sich in zwei Seiten, die grüne Seite (alles oberhalb der Folie in die Medien-Fläschchen) und die Orange Seite (alles unterhalb der Folie in die Medien-Fläschchen).
   1. Sicherstellen Sie, dass alle Fluss-Apparat ist luftdicht, Lecks, mit Ausnahme der Medien-Fläschchen (Abbildung 1, 1) zu verhindern. Um dies zu erreichen, gelten Sie Klempner Band für alle männlichen Gewinde vor dem Zusammenbau mit Ausnahme der Pulsation Dämpfer (PD) und 2 µm-Filter-Flasche (FB), die keinen Klempner Band benötigen, wie die Gummidichtungen sie luftdicht halten.
   2. Ohr Klemmen an jeden Stacheldraht Armatur, die unter Überdruck während des normalen Betriebs gelten (d.h., hinter der Pumpe).
   3. Verwendung farbcodierte Lab Bänder kennzeichnen die Ventil-Standorte mit einem A oder G (für die Befestigung und Wachstum, bzw.), den Standort der Pumpe, die Folie Verbindung Standorte und 0,2 µm-Filter-Verbindung.
   4. Bestimmen Sie die Länge der Schläuche verwendet werden basierend auf dem Abstand zwischen dem Flow-System und Mikroskop, unter Berücksichtigung, die den Fluss Apparat flussabwärts der Pumpe auf den Kolben (Großteil der orange Seite) der Auffangeinrichtungen sein sollten. Fügen Sie ca. 1 m zusätzliche Schlauch oberhalb der Folie (und vorzugsweise die Blase Falle), innerhalb der Mikroskop Inkubation Kammer zu platzieren, wie dies gewährleistet, dass alle Medien erreichen die Folie bei der korrekten Temperatur werden.
   5. Ort der Blase Falle so nah wie möglich auf die Folie, vorzugsweise in der Inkubation Kammer während eines Experiments (Luftblasen oft Form entlang der Schlauch Wand); Denken Sie jedoch daran, dass es sein muss angeschlossen, ein Vakuum zu bedienen.
   6. Sicherstellen Sie, dass der Schlauch zwischen der FB und 0,2 µm Einweg-Filter ca. 0,5 m lang ist.
   7. Fügen Sie einen ca. 2 cm magnetische rühren Bar in jeder Medien-Kolben.
   8. Erhalten Sie irgendeine Form von Schläuche Schellen als Absperrventile fungieren (futterzange können verwendet werden).
   9. Halten Sie für Benutzerfreundlichkeit den Fluss-Apparat in einer Korb autoklavierbar. Es kann hilfreich sein, einen zweiten kleineren Korb in einer großen erlauben einfache Trennung von der grün und orange Seite sein.
   10. Bohren Sie für die Anlage-Kolben, mit einem 4 mm Bohrer ein zusätzliches Loch in den Gummistopfen, Temperaturfühler (Vorsicht nicht zu gehen durch ein weiteres Loch) unterzubringen. Um den Schlauch über die Ports zu erhalten, schieben Sie den Schlauch durch mit einer Pinzette; Spannen Sie einmal durch, den Schlauch um Platz, und dann ziehen Sie die Pinzette wieder heraus zu halten.
       Hinweis: Wenn es nicht möglich, die extra-Loch den Gummistopfen hinzuzufügen ist, funktionieren eine breit-Mund Schraube Flasche mit einem 4-Port-Schraubverschluss anstelle der Kolben und Rubber Stopper.
2. Sobald die Flow-System komplett montiert wurden, schließen Sie die Ventile der beiden grün und orange Seite Wachstum Fläschchen. Verwenden Sie Wasser mit der Anlage Kolben Schlauch und ein Messzylinder die Peristaltische Pumpe entsprechend den Anweisungen des Herstellers zu kalibrieren.

2. führen Sie ein Experiment

1. Am Vortag das Experiment beginnen, die Mikroskop Inkubation Kammer auf 37 ° C vorheizen und bereiten eine Übernachtung Kultur eine pilzartige Sorte (Fluoreszenz ist nicht erforderlich).
2. Sammeln Sie Einweg-Komponenten und Pumpe zu, und in eine sterile Biosafety Kabinett.
3. Entfernen Sie die Blase-Falle und die Temperatur Sonde aus dem Fluss Gerät und legen Sie diese in das Biosafety-Kabinett.
4. Entwirren Sie und organisieren Sie die Schläuche zu, wenn nötig.
5. Autoklaven der Fluss Apparat, darunter rühren Bars, für 30 min um Sterilität zu gewährleisten; Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie auf die Biosicherheit Kabinett.
6. Legen Sie die Blase Falle, Temperaturfühler und alle Einweg-Komponenten (außer der Folie), wie in Abbildung 1dargestellt.
   1. Entfernen Sie für den 0,2 µm-Filter (Abbildung 1, 11) den Kolben von 1 mL Spritze zu machen, als einen "Adapter". Erzwingen Sie die Schläuche aus der FB in diesem Zweck, und befestigen Sie die 0,2 µm-Filter auf das Rohr in den Kolben Wachstum führt.
   2. Fetten Sie Silikon Vakuum um die Widerhaken an den Diahalter (Vorsicht nicht zu Fett auf der Innenseite ein) vor dem Anschluss, da dieser verhindert Undichtigkeiten in das System.
7. Füllen Sie die Anlage-Flasche mit 100 mL 1 % (w/V) Hefeextrakt, 2 % (w/V) Pepton und 2 % (w/V) Glukose (YPD), und füllen Sie die Wachstums-Flasche mit 200 mL YPD. Stellen Sie sicher, dass die grüne Seite-Schläuche des Mediums in jedem Kolben erreicht.
8. Stellen Sie sicher, dass alle Ventile geöffnet sind. Ein Vakuum die Blase Falle beimessen, und die Pumpe an der grünen Seite Schlauch anschließen stromabwärts der Blase Überfüllung.
9. Pumpen Sie die Flüssigkeit mit einer Durchflussrate von 3,3 mL/min vollständig füllen die grüne Seite, dann zu verzichten und etwa 1 – 2 mL des Mediums zu verwerfen, da die ersten paar Milliliter oft abgestorbene Zellen oder zufällige Verunreinigungen enthalten. Stellen Sie sicher, dass die grüne Seite des Rohrs mit Medien gefüllt ist und keine Luftblasen unterhalb der Blase Überfüllung, bevor Sie fortfahren hat.
10. YPD, kümmert sich nicht um Luftblasen einzuführen füllen Sie die Kanal-Folie und der Behälter ein.
11. Verbinden Sie der Folie mit der Strömung Apparat und die Pumpe mehr Flüssigkeit um einen Puffer von ca. 0,5 m auf der orange Seite zu erstellen. Dies soll versehentlich Trapping Luft in der Folie bei Rückfluss zu verhindern.
12. Bereiten Sie den Fluss-Apparat für den Transport an das Mikroskop: Klemme geschlossen den Einlass und Auslass der Blase Falle und Klemme das Grün und Orange Seite Anlage Kolben Ventile geschlossen. Sicherstellen Sie, dass die Schraubverschlüsse für die PD und FB dicht sind, wie sie beim Autoklavieren lockern können.
13. Trennen Sie die Pumpe vom Schlauch zum Transport zu erleichtern. Verschieben Sie dann alle Komponenten, einschließlich des Kochplatte Rührers in einen sekundären Behälter in der Nähe des Mikroskops.
14. Bereiten Sie den Fluss-Apparat für die Bildgebung.
    1. Legen Sie den Temperaturfühler auf der Herdplatte Rührer und beginnen Sie, Heizung der Anlage Küvette auf 37 ° C. Rühren Sie die Medien bei 300 u/min und halten Sie dies für das ganze Experiment.
    2. Montieren Sie die Folie auf das Mikroskop, und verwenden Sie Band bei Bedarf fest zu sichern.
    3. Befestigen Sie die Blase Falle ein Vakuum (nicht rückgängig gemacht werden die Klammer noch).
    4. Verbinden Sie die Pumpe auf den Fluss-Apparat an der Stelle, die auf Abbildung 1angegeben.
    5. Starten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 3,3 mL/min, für ca. 5 – 10 s laufen lassen Sie, und entfernen Sie dann die Blase Falle Einlass/Auslass-Klemme.
    6. Lassen Sie die Pumpe weiter laufen, während die Anlage Flasche sich erwärmt. Nach Medien im gesamten System der Strömung in Umlauf gebracht hat, für den normalen Betrieb zu überprüfen.
       1. Überprüfen Sie Armaturen für Luft, die der Pumpe (einige Blasenbildung ist normal) oder Flüssigkeit austreten flussabwärts flussaufwärts.
       2. Prüfen Sie, ob das Wachstum Medien Kolben, PD und FB alle Tropfen Medien aus dem Schlauch sind (wenn nicht, dies ein verstopfter Filter oder eine überdreht Ohr Klemme hindeuten könnte).
       3. Überprüfen Sie das Mikroskop für angehängte oder rollenden Zellen auf der Kanal-Folie. Eine übermäßige Anzahl von Zellen möglicherweise Kontamination während des Setups, oder müsste ausgetauscht werden, dass die Polytetrafluorethylen (PTFE) Membran der Blase fangen.
15. Sobald die Anlage Kolben und Inkubation Kammer sind beide bei 37 ° C, fügen Sie genug über Nacht Kultur von der Pilzzellen in den Anlage-Kolben, 1 x 10⁶ Zellen/mL zu erreichen.
    Hinweis: Die Lautstärke in µL hinzufügen kann mit dieser Formel berechnet werden:
    
16. Warten Sie 15 min um die Zellen zu akklimatisieren können.
17. Öffnen Sie beide grün und orange Seite Anlage Kolben Ventile beim Schließen beide Wachstum Kolben Ventile um den Fluss der Zellen zu starten.
18. Warten Sie etwa 5 min damit Zellen die Folie zu erreichen, und für die anfängliche Fokussierung des Mikroskops (diesmal müssen angepasst werden, abhängig von der Länge des Schlauches grüne Seite) zu ermöglichen. Während dieser Zeit stellen Sie das Mikroskop auf die gleichen bildgebenden Parameter, die in bisherigen Experimenten verwendet. Wenn dies der erste Lauf ist, gehen Sie folgendermaßen vor:
    1. Wechseln Sie zu einer niedrigen Vergrößerung Luft Objektiv.
    2. Finden Sie und konzentrieren Sie sich auf eine angehängte oder kleine angehende Zellen.
    3. Kondensator für Köhler Beleuchtung zu konfigurieren und dann zu Dunkelfeld wechseln.
    4. Legen Sie die Belichtungszeit auf 300 ms.
    5. Die leuchtenden Intensität, bis eine kleine Zelle ist noch deutlich sichtbar vom Hintergrund (ein Signal an Hintergrund-Verhältnis von ca. 7 – 8 für eine angehende tochterzelle ist ein brauchbarer Wert) dimmen. Endnotenzeichen Sie Fuß-/die leuchtende Intensität für zukünftige Experimente.
    6. Konfigurieren Sie die Software, um ein Bild alle 2 min über 2 h zu erwerben.
19. Beginnen Sie Bilderfassung für die Anlage-Phase. Überprüfen Sie zurück nach ca. 5 und 10 min um sicherzustellen, dass Fokus wurde beibehalten. Wenn dies nicht der Fall ist, versuchen, passen die Fokussierung sofort, nachdem das nächste Bild abgerufen wurde.
20. Unmittelbar nach die Anlage-Phase beendet ist, speichern Sie die Datei, und öffnen Sie dann beide grün und orange Seite Wachstum Kolben Ventile beim Schließen beide Anlage Kolben Ventile. Achten Sie darauf, nicht die Bühne stoßen, wenn alle Ventile in der Inkubation Kammer sind.
21. Trennen Sie die Thermometer-Sonde von der Herdplatte Rührer.
22. Entfernen des Anlage Kolbens von der Herdplatte Rührer und Wachstum Kolben an seinem Platz.
23. Konfigurieren Sie die Software erwerben ein Bild alle 15 min über 22 h und Bilderfassung für die Wachstumsphase zu beginnen. Scharfstellens sollte nicht notwendig sein, aber es wird dringend empfohlen, den Fluss Apparat nach ein paar Stunden zu überprüfen.
    1. Überprüfen Sie Armaturen für Luft, die der Pumpe (wieder einige Blasenbildung ist normal) oder Flüssigkeit austreten flussabwärts flussaufwärts
    2. Überprüfen Sie, ob das Wachstum Medien Kolben, PD und FB alle sind tropft Medien (wenn nicht, dies könnte eine verstopfte Filter, eine überdreht Ohr Klemme oder eine Verstopfung an einem Stacheldraht passend, wenn die Zellen verklumpen).
    3. Überprüfen Sie den Flüssigkeitsstand in der FB. Wenn die Medien den oberen Teil der Flasche (mehr als 1,5 cm über die Oberkante des Filters) nähert, ziehen Sie beide Schraubverschluss (nicht, lösen da dieser Flasche unter Druck steht). Wenn sie nicht weiter anziehen werden, weiter das Experiment (obwohl dies zu einer Leckage führen kann), und ersetzen Sie die Gummidichtungen an der PD und FB nach der nächsten Reinigung.
24. Wenn die Wachstums-Phase-Übernahme abgeschlossen ist, speichern Sie die Datei, und öffnen Sie dann die grüne und orange Seite Anlage Kolben Ventile, die Lärm machen können, wie der Druck auf die orange Seite veröffentlicht. Ziehen Sie die grüne Seite Schläuche kommen aus beiden Medien-Kolben, bis sie mindestens ein paar Zentimeter über die Medien sind. Führen Sie die Pumpe mit hoher Geschwindigkeit (ca. 100 mL/min oder Halt der schnellgangtaste an der Pumpe) um alle Medien aus den Schlauch zu entfernen, die macht die Reinigung einfacher. Wenn geleert, trennen Sie den Fluss Apparat von der Pumpe und entfernen Sie es vom Mikroskop.

3. Reinigen Sie den Flow-Apparat

1. Entfernen Sie alle nicht autoklavierbar Komponenten (Einzelnutzung Komponenten, Bubble Trap und Temperaturfühler) und Autoklaven der Fluss Apparat für 30 min. Ablagestapel verwendet Einweg-Komponenten, saubere Sonde mit 70 % Ethanol und Blase Falle beiseite stellen.
2. Nach dem Autoklavieren beendet ist, Medien, zu verwerfen und spülen und Medien Fläschchen beiseite. Dann schließen Sie die Blase Falle, verbinden Sie eine Ibidi-Kanal-Folie verwendet werden, für die Reinigung (wiederverwendbar), und verbinden Sie die Flow-System an der Pumpe an der Stelle, die in Abbildung 1dargestellt.
3. Klemme geschlossen die orange Seite Wachstum Kolben Ventil.
4. Legen Sie etwa 200 mL unverdünntes Bleichmittel in einen Becher füllen. Legen Sie die Gummistopfen in das Bleichmittel, und starten Sie die Pumpe mit hoher Geschwindigkeit Bleichmittel in den Fluss-Apparat (außer alle Filter) in Umlauf. Sobald mit Bleichmittel gefüllt, stoppen Sie die Pumpe verlassen, weil die Pumpe auf mit hoher Geschwindigkeit kann tragen und den Schlauch zu brechen.
5. Nach dem Bleichen für 15 min halten Sie die Gummistopper über den Becher und starten Sie die Pumpe wieder um das Bleichmittel aus dem Fluss-Gerät zu entfernen.
6. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 zweimal mit zuviel Wasser anstelle von Bleichmittel, die Flow-System zu spülen. Während dieser Zeit reinigen Sie die Filter nur mit Wasser, weil andere Reinigungsmittel werden korrodieren oder die Filter verstopfen.
   1. Legen Sie die Schläuche, die normalerweise mit den 0,2 µm Medienfilter (aus 2 µm FB) in das Becherglas Wasser mit dem Gummistopfen aus Schritt 3.6 verbinden würde.
   2. Trennen Sie den Schlauch angebracht um den Einlass von 20 µm Inline-Filter, der in der Regel mit Leichtigkeit trotz der Ohr-Klemme auseinander gezogen werden kann.
   3. Verwenden Sie ein Vakuumfilter Fläschchen und einen langen Abschnitt der Schlauch durch eine freie 3-Loch stopfen ein Vakuum-Systems zu erstellen, das an dem Fluss-Gerät eine Verbindung herstellen können.
   4. Verbinden Sie dieses Vakuum-System zu, um den Einlass von 20 µm Filter Einlauf, und starten Sie das Vakuum; Dies wird Wasser durch den Filter in umgekehrter Richtung, entfernen abgestorbene Zellen ziehen.
   5. Ziehen Sie mindestens 200 mL Wasser durch den Filter, dann entfernen Sie den Schlauch aus dem Wasser, die Filter-Linien von Wasser zu entleeren.
   6. Trennen Sie Vakuum-System von 20 µm Filter und schließen Sie den Filter, um ihre normale Schläuche.

(4) Quantifizierung der Videos

Hinweis: Alle Dateien müssen in den Tag (TIF) Bilddateiformat Arbeit umgewandelt werden. Zusätzlich, um zwischen Experimente zu vergleichen, ist es wichtig, dass alle Bilder mit dem gleichen Mikroskop und bildgebenden Parameter getroffen werden, wie oben beschrieben.

1. Downloaden Sie und installieren Sie ImageJ, falls nicht bereits installiert.
2. Herunterladen Sie die zusätzliche Makrodatei, und legen Sie sie im Ordner "ImageJ\macros".
3. Passen Sie die zur Verfügung gestellten Makro:
   1. Öffnen Sie ein Bildstapel aus einem früheren Experiment in ImageJ, und wählen Sie einen Zeitpunkt mit Zellen vorhanden.
   2. Wählen Sie aus dem Menü über "Bild | Typ | 8-Bit".
   3. Wählen Sie aus dem Menü über "Bild | Anpassen | Schwelle". Das Kontrollkästchen Sie "Dark Background" . Setzen Sie das Dropdown-Menü rechts auf rot.
   4. Passen Sie den niedrigeren beizulegenden Wert, bis alle Zellen in rot mit minimalen übermäßig laut bedeckt sind (einige nicht-Zelle Sprenkeln ist okay und verarbeitet werden durch das Makro). Notieren Sie sich diesen niedrigeren Wert.
   5. Schließen Sie den Schwellenwert-Fenster und das geöffnete Bild.
   6. Wählen Sie aus dem Menü über "Plugins | Makros | Bearbeiten". Wenn Sie aufgefordert werden, eine Datei zu öffnen: "move up eine Ordnerebene", dann wählen Sie den Ordner Makros und der Flow Biofilm Quantifizierung Makro-Datei zu öffnen.
   7. Ändern Sie die 15 Wert in allen Instanzen des "SetThreshold (15, 255);" auf 4.3.4 Schritt ermittelte Wert. Speichern Sie die Datei und schließen Sie dieses Fenster.
4. Wählen Sie aus dem Menü über "Plugins | Makros | Installieren"und wählen Sie die Flow-Biofilm-Quantifizierung-Datei.
5. Nun, unter dem "Plugins | Makros" Menü, sechs neue Optionen für verschiedene video Quantifizierungen angezeigt. Führen Sie die vollständige Analyse aus und wählen Sie die Anlage und das Wachstum Videodateien wenn aufgefordert, alle verfügbaren Analysen auf die erfassten Daten und Output-Dateien automatisch zu generieren.

Ergebnisse

Repräsentative Bilder eines normalen Übernachtung Zeitraffer Experiment mit Wildtyp C. Albicans Zellen bei 37 ° C in Abbildung 2A und ergänzenden Video 1gesehen werden. Die Bilder wurden Kontrast verbessert, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Quantifizierung der Originaldaten wurde durchgeführt und repräsentative Grafiken sehen in Abbildung 2B. Um diese Diagramme z...

Diskussion

Mit Hilfe der Flow-System ermöglicht wie oben beschrieben für die Generation der quantitativen Zeitraffer-Videos von Pilz Biofilm Wachstum und Entwicklung. Um Vergleiche zwischen Experimente zu ermöglichen ist es von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die bildgebenden Parameter gleich gehalten werden. Dazu gehört, dass das Mikroskop für Köhler Beleuchtung für jedes Experiment eingerichtet ist, (viele Guides sind online verfügbar für diesen Prozess). Abgesehen von imaging-Parameter, gibt es einige...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pump	Cole Parmer	07522-20	6
Pump head	Cole Parmer	77200-60	6
Tubing	Cole Parmer	96410-14	N/A
Bubble trap adapter	Cole Parmer	30704-84	3
Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line	Cole Parmer	31500-55	3
In-line filter adapter (4 needed)	Cole Parmer	31209-40	8,9
Orange-side Y	Cole Parmer	31209-55	7
Green-side Y	ibidi	10827	2
* Slides	ibidi	80196	4
* Slide luers	ibidi	10802	4
Vacuum assisted Bubble trap	Elveflow/Darwin microfluidics	KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit	3
Media flasks	Corning	4980-500	1
0.2 µm air filter	Corning	431229	1
Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)	Corning	1395-100	5,10
Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)	Wheaton	1129750	5,10
Screwcap tubing connector	Wheaton	1129814	5,10
Tubing connector beveled washer	Danco	88579	5,10
Tubing connector flat washer	Danco	88569	5,10
Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	15100002-100	7,8,9
Clamp tool	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	14100386	N/A
20 μm in-line media filter	Analytical Scientific Instruments	850-1331	8
10 μm in-line media filter	Analytical Scientific Instruments	850-1333	9
2 μm inlet media filter	Supelco/Sigma-Aldrich	58267	10
* 0.22 µm media filter	Millipore	SVGV010RS	11
* 0.22 µm media filter “adapter”	BD Biosciences	329654	11
Rubber stopper	Fisher Scientific	14-131E	1
Hotplate stirrer with external probe port	ThermoFisher Scientific	88880006	N/A
Temperature probe	ThermoFisher Scientific	88880147	N/A