Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico

Resumen

Describimos el montaje, operación y limpieza de un aparato de flujo diseñado para la formación de biopelículas fúngicas de imagen en tiempo real bajo flujo. También ofrecemos y discutir los algoritmos cuantitativos para ser utilizado en las imágenes adquiridas.

Resumen

En la candidiasis orofaríngea, miembros del género Candida deben cumplir y crecen en la superficie de la mucosa oral mientras que bajo los efectos del flujo salival. Mientras que se han desarrollado modelos para el crecimiento bajo flujo, muchos de estos sistemas son caros, o no permiten la proyección de imagen mientras que las células están bajo flujo. Hemos desarrollado un novedoso aparato que permite el crecimiento y desarrollo de las células de la Candida albicans bajo flujo y en tiempo real de la imagen. Aquí detallamos el protocolo para el montaje y el uso de este aparato de flujo, así como la cuantificación de los datos que se generan. Somos capaces de cuantificar los tipos de las células a y separan de la diapositiva, así como determinar una medida de la biomasa en la diapositiva con el tiempo. Este sistema es económico y versátil, trabajando con muchos tipos de microscopios ópticos, como microscopios de mesa barato, y es capaz de extendido veces en comparación con otros sistemas de flujo de imágenes. En general, se trata de un sistema de bajo rendimiento que puede proporcionar información muy detallada en tiempo real sobre el crecimiento de biofilm de especies fúngicas bajo flujo.

Introducción

Candida albicans (C. albicans) es un patógeno fúngico oportunista de seres humanos que pueden infectar a muchos tipos de tejido, incluyendo superficies de la mucosa orales, provocando candidiasis orofaríngea y resultando en una menor calidad de vida para los individuos afectados¹. Formación de biofilms es una característica importante para la patogenia de la C. albicans, y se han realizado numerosos estudios sobre la formación y la función de C. albicans biofilms^{2,3,4, 5}, muchos de los cuales se realizan en estática (sin flujo) en vitro modelos. Sin embargo, C. albicans debe adherirse y crecer en presencia de flujo salival en la cavidad bucal. Han desarrollado numerosos sistemas para permitir que células vivas imágenes^6,7,8,9,10. Estos diferentes sistemas han sido diseñados para diferentes propósitos, y por lo tanto cada sistema tiene diferentes fortalezas y debilidades. Hemos encontrado que muchos del flujo de los sistemas apropiados para C. albicans eran costosos, complejo requiere fabricación de partes, o no podía ser había reflejada durante el flujo y tuvo que ser parado antes de la proyección de imagen. Por lo tanto, hemos desarrollado un aparato de flujo novela para estudiar la formación de biopelículas de C. albicans bajo flujo¹¹. Durante el diseño de nuestro aparato de flujo, seguimos estas consideraciones principales. En primer lugar, queríamos ser capaces de cuantificar varios aspectos del crecimiento del biofilm y desarrollo en tiempo real sin requerir el uso de células fluorescentes (permitiéndonos estudio cepas mutantes y aislados clínicos sin modificar fácilmente). En segundo lugar, queríamos que todas las partes a ser comercialmente disponibles con poca o ninguna modificación (es decir., no hay fabricación de encargo), permitiendo que otros más fácilmente recrean nuestro sistema y permitir fácil reparación. En tercer lugar, también hemos querido permitir extendido veces a velocidades de flujo razonablemente alta de imagen. Por último, hemos querido, después de un período de fijación para el sustrato bajo flujo, de células para controlar el crecimiento de biofilm en un período de tiempo sin la introducción de nuevas células.

Estas consideraciones nos llevaron a desarrollar el sistema de flujo recirculación dos frasco, ilustrado en la figura 1. Los dos matraces nos permiten dividir el experimento en dos fases, una fase de apego que extrae del frasco de semillas celular accesorio y una fase de crecimiento que utiliza los medios libres de células para continuar el crecimiento de biopelícula sin la adición de nuevas células. Este sistema está diseñado para trabajar con una cámara de incubación para el microscopio, con la corredera y el tubo anterior (de 2 a 5, figura 1) se coloca dentro de la incubadora, y todos los componentes colocan en un contenedor secundario grande fuera de la microscopio. Además, se utiliza un agitador de placa calefactora con un sensor de temperatura conectado para mantener células fúngicas en el matraz de accesorio a 37 ° C. Mientras está recirculando, este sistema es capaz de la proyección de imagen continua durante el flujo (puede ser más de 36 horas dependiendo de las condiciones) y puede utilizarse en la mayoría de los microscopios, incluyendo microscopios de mesa vertical o invertido. Aquí discutimos el montaje, operación, y la limpieza de los aparatos de flujo, así como proporcionar algunos algoritmos cuantitativos básicos de ImageJ para analizar los videos después de un experimento.

Protocolo

1. montar el aparato de flujo

1. Configurar las piezas listadas en la Tabla de materiales de acuerdo con el esquema en la figura 1 con las consideraciones que se discuten más abajo.
   Nota: Para mayor comodidad, el flujo de aparatos se dividieron en dos partes, la parte verde (todo aguas arriba de la corredera a los frascos de los medios de comunicación) y la naranja lado (todo aguas abajo de la diapositiva para los frascos de los medios de comunicación).
   1. Asegúrese de que todo el aparato de flujo es hermético para evitar fugas, con la única excepción de los frascos de los medios de comunicación (figura 1, 1). Para lograr esto, aplique cinta de plomería a cualquier macho roscado antes de ensamblar excepto el apagador de la pulsación (PD) y 2 μm filtro botella (FB), que no requieren cinta de plomería como las juntas de goma mantienen hermético.
   2. Aplique oreja abrazaderas cada arponado que está bajo presión positiva durante el funcionamiento normal (es decir, aguas abajo de la bomba).
   3. Código de colores de uso cintas de laboratorio para identificar la ubicación de la válvula con una A o G (para fijación y crecimiento, respectivamente), la ubicación de la bomba, los lugares de conexión de la diapositiva y la conexión del filtro de 0.2 μm.
   4. Determinar la longitud de la tubería a utilizar basado en la distancia entre el sistema de flujo y el microscopio, teniendo en cuenta que todo el aparato de flujo aguas abajo de la bomba para los frascos (mayoría de la parte naranja) debe estar en la contención secundaria. Añadir aproximadamente 1 m de tubo extra aguas arriba de la diapositiva (y preferiblemente la trampa de la burbuja) para colocar dentro de la cámara de incubación del microscopio, ya que esto garantiza que todos los medios llegar a la diapositiva en la temperatura correcta.
   5. Lugar la trampa burbuja tan cerca como sea razonablemente posible a la diapositiva, preferiblemente dentro de la cámara de incubación durante un experimento (a menudo forma a lo largo de la pared del tubo de burbujas); sin embargo, tenga en cuenta que debe ser conectada a una aspiradora para operar.
   6. Asegúrese de que la tubería entre el FB y el 0.2 μm filtro desechable es aproximadamente 0,5 m de largo.
   7. Añadir un aproximadamente barra de agitación magnética de 2 cm en cada matraz de los medios de comunicación.
   8. Obtener algún tipo de abrazaderas de tubería para actuar como válvulas (pueden utilizarse pinzas hemostáticas).
   9. Para facilidad de uso, mantenga el aparato de flujo en una canasta de autoclave. Puede ser útil tener una segunda cesta más pequeños en uno más grande para permitir la separación fácil de la verde y la naranja.
   10. Para el frasco de fijación, usando una broca de 4 mm, perfore un agujero extra en el tapón de goma para la sonda térmica (tenga cuidado de no pasar por otro agujero). Para obtener la tubería a través de los puertos, pasar el tubo con las pinzas; una vez, abrazadera de la tubería para mantenerlo en su lugar y luego tire la pinza retroceda.
       Nota: Si no es posible añadir el agujero adicional para el tapón de goma, una botella de boca ancha tornillo con un tapón de rosca de cuatro puertos puede funcionar en lugar del tapón del frasco y goma.
2. Una vez montado completamente el sistema de flujo, cierre las válvulas de ambos frascos de crecimiento del lado verde y el naranja. Use agua con el tubo del matraz de accesorio y una probeta graduada a calibrar la bomba peristáltica según las instrucciones del fabricante.

2. realizar un experimento

1. El día antes del experimento, comenzar a precalentar la cámara microscopio de incubación a 37 ° C y preparar una cultura de la noche a la mañana de una cepa fúngica (fluorescencia no es necesaria).
2. Recoger la bomba y componentes de uso individual y en un estéril bioseguridad gabinete.
3. Quitar la trampa de la burbuja y la temperatura de la sonda del aparato de flujo y colocar éstos en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
4. Desenredar y organizar el tubo, si es necesario.
5. Autoclave el aparato de flujo, incluyendo las barras de agitación durante 30 minutos asegurar la esterilidad; al terminar, traslado al gabinete de seguridad de la biotecnología.
6. Coloque la trampa de la burbuja, sonda de temperatura y todos los componentes de uso individual (excepto la corredera) como se muestra en la figura 1.
   1. Para el filtro de 0.2 μm (figura 1, 11), retire el émbolo de la jeringa de 1 mL para que sea como un "adaptador". La tubería de la FB en este extremo de la fuerza y coloque el filtro de 0.2 μm en la tubería hacia el frasco de crecimiento.
   2. Aplique grasa de vacío de silicona alrededor de la lengüeta del adaptador deslizante (tenga cuidado de no tener grasa en el interior) antes de conectar, como este ayuda a prevenir fugas de aire en el sistema.
7. Llene el matraz de accesorio con 100 mL de extracto de levadura 1% (p/v), peptona 2% (p/v) y glucosa de 2% (w/v) (YPD) y llene el frasco de crecimiento con 200 mL de YPD. Asegúrese de que la tubería del lado verde llega a los medios de comunicación en cada matraz.
8. Asegúrese de que todas las válvulas están abiertas. Coloque la trampa de la burbuja en un vacío y conecte la bomba a la tubería verde del lado aguas abajo de la trampa de la burbuja.
9. La bomba el líquido con un caudal de 3.3 mL/min totalmente llenar el lado verde, luego dispensar y desechar aproximadamente 1 – 2 mL de los medios de comunicación porque los dos primeros mililitros contienen a menudo las células muertas o escombros al azar. Asegúrese de que el lado verde de la tubería se llena con los medios de comunicación y sin burbujas de aguas abajo de la trampa de la burbuja antes de proceder.
10. Se llenan de la diapositiva del canal y el embalse de YPD, teniendo cuidado de no para introducir burbujas.
11. Conectar la diapositiva con el aparato de flujo y la bomba más líquido para crear un buffer de unos 0,5 m en el lado naranja. Esto es para evitar que accidentalmente el aire reventado en la diapositiva en caso de reflujo.
12. Preparar el aparato de flujo para el transporte al microscopio: abrazadera cerrada la entrada y salida de la trampa de burbujas y el verde y el naranja accesorio válvulas de frasco cerradas de laterales de la abrazadera. Asegurar que los tapones para el PD y el FB apretados como pueden aflojarse durante el autoclavado.
13. Desconecte la bomba de la tubería para facilitar el transporte. Mueva todos los componentes, incluyendo el agitador de placa calefactora, en un contenedor secundario cerca del microscopio.
14. Preparar el aparato de flujo para la proyección de imagen.
    1. Conecte la sonda de temperatura para el agitador de placa calefactora y comenzar a calentar el matraz de accesorio a 37 ° C. Remover los medios de comunicación a 300 rpm y mantener esto para el experimento entero.
    2. Montar el portaobjetos en el microscopio y utilizar cinta si es necesario, para sujetarla firmemente.
    3. Coloque la trampa de la burbuja en un vacío (no ha deshacer la abrazadera).
    4. Conecte la bomba al aparato de flujo en el lugar indicado en la figura 1.
    5. Arrancar la bomba con un caudal de 3.3 mL/min, déjelo funcionar durante aproximadamente 5 – 10 s y luego quite la abrazadera de entrada y salida de trampa de burbujas.
    6. Permita que la bomba continúe funcionando mientras calienta el matraz del accesorio. Una vez que los medios de comunicación ha circulado en todo el sistema de flujo, compruebe el funcionamiento normal.
       1. Revise los accesorios para escaparse en el aire arriba de la bomba (algunos formación de burbujas es normal), o el líquido escaparse hacia fuera más abajo.
       2. Verifique que el frasco de medio de crecimiento, PD y FB están todos los medios de goteo por el tubo de entrada (si no, esto podría indicar un filtro obstruido o una pinza de oído demasiado apretada).
       3. Con el microscopio, busque células adjuntas o balanceo de la diapositiva del canal. Un número excesivo de células puede indicar contaminación durante la preparación, o que la membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) de la burbuja de la trampa hay que sustituir.
15. Una vez que la cámara de incubación y matraz de accesorio son a 37 ° C, agregar suficiente cultura durante la noche de las células fúngicas al matraz de accesorio para llegar a 1 x 10⁶ células/mL.
    Nota: El volumen en μL puede calcularse mediante esta fórmula:
    
16. Esperar 15 minutos para permitir que las células se adapte.
17. Abra ambas válvulas de frasco verde y naranja lado accesorio al cerrar ambas válvulas del frasco de crecimiento para iniciar el flujo de las células.
18. Espere aproximadamente 5 minutos permitir que las células llegar a la diapositiva y permiten el enfoque inicial del microscopio (este tiempo puede necesitar ser ajustado dependiendo de la longitud de la tubería del lado verde). Durante este tiempo, ajustar el microscopio a los mismos parámetros de proyección de imagen utilizado en experimentos anteriores. Si se trata de la primera carrera, siga estos pasos:
    1. Cambiar a un objetivo de aire de baja magnificación.
    2. Encontrar y centrarse en una celda adjunta o pequeño florecimiento.
    3. Configurar el condensador para la iluminación de Köhler, luego cambie a campo oscuro.
    4. Configurar el tiempo de exposición a ms de 300.
    5. Ajuste la intensidad de luz hasta que una pequeña célula es dim todavía claramente visible contra el fondo (una relación señal a fondo de aproximadamente 7-8 para una célula de la hija de florecimiento es un valor razonable). Nota/marca la intensidad de iluminación para experimentos futuros.
    6. Configurar el software para obtener una imagen cada 2 min durante 2 h.
19. Comenzar la adquisición de imágenes para la fase de apego. Compruebe detrás después de aproximadamente 5 y 10 min para enfoque se ha mantenido. Si no es así, trate de ajustar el enfoque inmediatamente después de adquirir la siguiente imagen.
20. Inmediatamente después de finalizada la fase de apego, guarde el archivo y luego ambas válvulas de frasco de crecimiento laterales verdes y naranjas al cerrar ambas válvulas del frasco de accesorio. Tenga cuidado de no para golpear la etapa si ninguna está dentro de la cámara de incubación.
21. Desconecte la sonda del termómetro del agitador de placa calefactora.
22. Retirar el matraz de accesorio el agitador de placa calefactora y coloque el frasco de crecimiento en su lugar.
23. Configurar el software para adquirir una imagen cada 15 minutos más de 22 h y comenzar la adquisición de la imagen de la fase de crecimiento. Nuevo enfoque no debería ser necesario, pero se recomienda revisar el aparato de flujo después de unas horas.
    1. Revise los accesorios para escaparse en el aire arriba de la bomba (otra vez algunos formación de burbujas es normal), o el líquido escaparse hacia fuera abajo
    2. Comprobar que el frasco de medio de crecimiento, PD y FB todos goteando los medios de comunicación (si no, esto podría indicar un filtro obstruido, una pinza de oído demasiado apretada o un estorbo en un montaje de púas si las células flocular).
    3. Compruebe el nivel del líquido en el FB. Si los medios de comunicación se aproxima a la parte superior de la botella (más de 1,5 cm por encima de la parte superior del filtro), apriete ambos screwcaps (no afloje, como este frasco está bajo presión). Si no se aprieta más, continuar con el experimento (aunque esto puede resultar en una pérdida) y sustituir las juntas de goma en el PD y el FB después de la próxima limpieza.
24. Cuando la adquisición de la fase de crecimiento ha terminado, guarde el archivo y luego abrir las válvulas de frasco de accesorio de lado verde y el naranja que pueden hacer un ruido como libera la presión en el lado naranja. Jale hacia arriba el tubo de lado verde provenientes de dos frascos de media hasta por lo menos varios centímetros por encima de los medios de comunicación. Funcionar la bomba a una velocidad alta (aproximadamente 100 mL/min o pulsado el botón de avance rápido en la bomba) para eliminar todos los medios de comunicación de la tubería, que hace la limpieza más fácil. Durante el vaciado, desconectar el aparato de flujo de la bomba y retire del microscopio.

3. Limpie el aparato de flujo

1. Retire todos los componentes no autoclavables (componentes de uso individual, trampa de burbujas y sonda de temperatura) y autoclave aparato flujo durante 30 minutos descartar componentes desechables, sonda limpia con etanol al 70% y apartar trampa de burbujas.
2. Finalizada la esterilización en autoclave, desechar los medios de comunicación y enjuagar y reservar frascos de medios de comunicación. Luego vuelva a conectar la trampa de la burbuja, conectar una diapositiva de ibidi canal a utilizar para la limpieza (reutilizable) y conectar el sistema de flujo a la bomba en la ubicación que se muestra en la figura 1.
3. Abrazadera cierre la válvula de frasco de crecimiento lateral naranja.
4. Colocar aproximadamente 200 mL de lejía sin diluir en un vaso de precipitados. Coloque los tapones de goma en el blanqueador y luego arrancar la bomba a una velocidad alta para circular cloro en todo el aparato de flujo (excepto todos los filtros). Una vez llena de cloro, detenga la bomba porque dejando la bomba en a alta velocidad puede usar y romper el tubo.
5. Después del blanqueo por 15 min, mantenga los tapones de goma sobre el vaso y encienda la bomba para quitar el cloro del aparato de flujo.
6. Repita los pasos 3.4 y 3.5 dos veces con exceso de agua en vez de lejía para limpiar el sistema de flujo. Durante este tiempo, limpie los filtros con agua debido a otros agentes de limpieza se corroe o atascar los filtros.
   1. Coloque la tubería que normalmente conectaría con el filtro de los medios de comunicación de 0.2 μm (procedente del μm 2 FB) en el agua del vaso de precipitados con los tapones de goma del paso 3.6.
   2. Desconecte el tubo conectado a la entrada del filtro 20 μm en línea, que generalmente puede ser tirado aparte con facilidad a pesar de la pinza de oído.
   3. Utilizar un frasco de vacío del filtro y una sección larga de la tubería a través de un tapón de orificio de 3 repuesto para crear un sistema de vacío que se puede conectar al aparato de flujo.
   4. Conectar este sistema de vacío a la entrada de la entrada del filtro 20 μm y empezar el vacío; Esto tirará agua por los filtros en la dirección inversa, eliminando las células muertas.
   5. Tire por lo menos 200 mL de agua a través de los filtros, luego quite la tubería del agua para vaciar las líneas de filtro de agua.
   6. Desconecte el sistema de vacío del filtro 20 μm, y vuelva a conectar el filtro a su tubería normal.

4. cuantificación de los Videos

Nota: Todos los archivos necesitan para convertirse en el etiqueta de imagen (TIF) formato para trabajar. Además, para comparar entre experimentos, es crítico que todas las imágenes se toman con el mismo microscopio y parámetros de proyección de imagen, como hemos comentado anteriormente.

1. Descargar e instalar ImageJ si no ya instalado.
2. Descargar el archivo de macro suplemental y colocarlo en la carpeta ImageJ\macros.
3. Ajustar la macro provista:
   1. Abrir una pila de imágenes de un experimento anterior en ImageJ y seleccione un punto del tiempo con las células presentes.
   2. Seleccione del menú vía "imagen | Tipo | 8-bit".
   3. Seleccione del menú vía "imagen | Ajustar | Umbral". Marque la casilla "fondo oscuro" . Establece el menú de lista desplegable derecha rojo.
   4. Ajustar el valor más bajo hasta que se cubran todas las celdas en rojo con mínimo ruido exceso (algunas células no moteado está bien y se tramitarán por el macro). Anote este valor más bajo.
   5. Cierre la ventana de umbral y la imagen abierta.
   6. Seleccione del menú vía "Plugins | Las macros | Editar". Cuando se le pida para abrir un archivo: "subir de nivel una carpeta", luego seleccione la carpeta de macros y abra el archivo de macro de cuantificación de biofilm de flujo.
   7. Cambie el valor 15 en todas las instancias de "setThreshold (15, 255);" en el valor determinado en el paso 4.3.4. Guarde el archivo y cerrar esta ventana.
4. Seleccione del menú a través de "Plugins | Las macros | Instalar"y seleccione el archivo de cuantificación del biofilm de flujo.
5. Ahora, bajo el "Plugins | Las macros" menú, aparecen seis nuevas opciones para distintas cuantificaciones videos. Ejecute el análisis completo y seleccione el accesorio y el crecimiento de archivos de vídeo cuando se le pida para realizar todos los análisis disponibles sobre los datos adquiridos y generar automáticamente los archivos de salida.

Resultados

Imágenes representativas de un normal noche Time-lapse experimento usando tipo C. albicans las células a 37 ° C se aprecia en la figura 2A y 1 de Video suplementaria. Las imágenes han sido contraste mejorado para mejorar la visibilidad. Se realizó la cuantificación de los datos originales, y gráficos representativos pueden verse en la figura 2B. Para generar estos...

Discusión

Utilizando el sistema de flujo señalados anteriormente permite la generación de vídeos Time-lapse cuantitativas de biofilm hongos crecimiento y desarrollo. Para permitir comparaciones entre experimentos es de vital importancia para poder garantizar los parámetros de proyección de imagen son el mismo. Esto incluye asegurar que el microscopio está configurado para la iluminación Köhler para cada experimento (muchas guías están disponibles en línea para este proceso). Aparte de los parámetros de la proyección d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pump	Cole Parmer	07522-20	6
Pump head	Cole Parmer	77200-60	6
Tubing	Cole Parmer	96410-14	N/A
Bubble trap adapter	Cole Parmer	30704-84	3
Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line	Cole Parmer	31500-55	3
In-line filter adapter (4 needed)	Cole Parmer	31209-40	8,9
Orange-side Y	Cole Parmer	31209-55	7
Green-side Y	ibidi	10827	2
* Slides	ibidi	80196	4
* Slide luers	ibidi	10802	4
Vacuum assisted Bubble trap	Elveflow/Darwin microfluidics	KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit	3
Media flasks	Corning	4980-500	1
0.2 µm air filter	Corning	431229	1
Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)	Corning	1395-100	5,10
Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)	Wheaton	1129750	5,10
Screwcap tubing connector	Wheaton	1129814	5,10
Tubing connector beveled washer	Danco	88579	5,10
Tubing connector flat washer	Danco	88569	5,10
Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	15100002-100	7,8,9
Clamp tool	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	14100386	N/A
20 micron in-line media filter	Analytical Scientific Instruments	850-1331	8
10 micron in-line media filter	Analytical Scientific Instruments	850-1333	9
2 micron inlet media filter	Supelco/Sigma-Aldrich	58267	10
* 0.22 µm media filter	Millipore	SVGV010RS	11
* 0.22 µm media filter “adapter”	BD Biosciences	329654	11
Rubber stopper	Fisher Scientific	14-131E	1
Hotplate stirrer with external probe port	ThermoFisher Scientific	88880006	N/A
Temperature probe	ThermoFisher Scientific	88880147	N/A