用化学干燥进行扫描电镜 (sem) 形态分析的原核生物和真核生物的制备

摘要

扫描电镜分析是帮助物种鉴定或表型鉴别的有效方法。该协议描述了检查三种具有代表性的生物体的具体形态细节的方法, 并将广泛适用于检查许多组织和组织类型的特征。

摘要

扫描电子显微镜 (sem) 是一种广泛使用的技术, 已被应用于研究生物标本, 从单个蛋白质到细胞, 组织, 细胞器, 甚至整个生物体。该协议侧重于两种化学干燥方法, 六甲基二硅烷 (hmds) 和 t-丁醇 (tba), 及其在原核生物和真核生物的成像使用 sem。在这篇文章中, 我们描述了如何固定, 洗涤, 脱水, 干燥, 安装, 溅射外套, 和图像三种类型的生物体: 蓝藻(toxifilum mysicida, golenkina sp., 和一个未知的 sp), 两种黄酮类化合物属单诺莫诺莫莫莫莫尼卡(金银花和假花蝇) 和果蝇 (果蝇)。本协议的目的是描述一种快速、廉价和简单的方法, 以获取有关样品的结构、大小和表面特性的详细信息, 这些信息可广泛应用于大量生物的形态评估。成功完成此协议将允许其他人使用 sem 通过将这些技术应用于他们的系统来可视化样本。

引言

扫描电子显微镜 (sem) 使用高能电子的聚焦束从二次电子中生成显示样本¹的形态和地形的图像。sem 可用于直接确定样品的物理尺寸、表面结构和三维形状, 并提供更大的分辨率和更大的景深相比, 光显微镜。另一种形式的电子显微镜 (em), 透射电子显微镜 (tem) 使用聚焦电子通过样品, 产生图像与内部结构的细节。虽然 tem 的分辨率高于光或 sem, 可用于解析单个原子这样小的结构, 但它有三个主要缺点: 广泛的样品制备、一个小的视野和一个浅景深 2,³。虽然其他可视化协议存在使用 sem 来检查特定的细胞, 细胞器,或组织^4,5^{,6, 7, 8,9},¹⁰ 、该协议的独特之处在于, 我们描述了可广泛应用于大量生物进行形态评估的方法。

sem 在研究无机材料方面有着广泛的应用, 包括纳米粒子^11、12、聚合物^13,以及在地质、工业和材料科学^{14 中}的众多应用^{. 15,16}。在生物学中, sem 长期以来一直被用作检测从单个蛋白质到整个生物体的生物样本的方法 17^,18。扫描电镜具有特殊的价值, 因为形态表面细节可以用来为科学发现提供信息。sem 分析是一种快速、廉价、简单的方法, 可以获得关于各种生物样品的结构、大小和表面特性的详细信息。

由于 sem 通常在高真空 (^10-6 torr 最小值) 下工作, 以支持高速电子的相干束, 因此样品室中不允许使用液体 (水、油、醇), 因为液体可防止真空形成。因此, 使用 sem 检测的所有样品都必须脱水, 通常使用分级乙醇系列, 然后采用干燥过程来去除乙醇。有几种方法来干燥生物组织用于扫描电镜, 包括空气干燥, 冻干, 使用临界点干燥 (cpd) 装置, 或使用 t-丁醇 (tba) 或六甲基二硅烷 (hmds)^化学干燥^19,20,21,22. 大多数情况下, 选择干燥方法是经验性的, 因为每个生物样本对每个干燥方法的反应可能不同。对于任何给定的示例, 所有这些方法都可能是适当的, 因此比较每种方法的优缺点对于选择适当的方法很有用。

虽然在室温或干燥炉 (60°c) 下空气干燥样品是最简单的方法, 但大多数生物样品显示干燥引起的损伤, 如枯萎和塌陷, 导致样品变形。冷冻干燥的过程也会去除样品中的水 (或冰), 但需要将样品进行闪存冷冻,并置于真空下, 通过升华过程去除冰, 从而有可能对样品造成损害。此外, 用户必须有权访问冻干机。sem 脱水样品最常用的方法是临界点干燥 (cpd)。在 cpd 中, 样品中的乙醇被液体二氧化碳 (co₂) 所取代, 在被称为临界点的特定温度和压力条件下 (31.1°c 和 1, 073 psi), co₂在不产生表面张力的情况下蒸发, 从而产生表面张力, 从而有效地保持样品的形态和结构特征。虽然 cpd 通常是标准方法, 但它有几个缺点。首先, 这一过程需要使用临界点干燥器, 这不仅昂贵, 而且还需要使用液体二氧化碳。其次, 可以干燥的样品的大小仅限于临界点干燥机的腔体大小。第三, 在 cpd 过程中液体的交换会导致湍流, 从而损坏样品。

与 cpd 相比, 化学干燥具有许多优势, 并可作为一种合适的替代品, 在 sem 样品制备中得到广泛应用。使用 tba 和 hmds 等化学脱水剂为其他方法提供了快速、廉价和简单的替代方法, 同时仍然保持样品的结构完整性。我们最近发现, 在成人嗜酸性视网膜组织23中使用 cpd 或 tba 作为干燥方法时, 组织的完整性或最终图像的质量没有差异.与 cpd 不同, tba 和 hmds 不需要干燥仪器或液体_co2 , 也不限制要干燥的样品的大小。除了获得这些化学品外, 完成干燥过程只需标准的化学烟罩和适当的个人防护设备 (手套、实验室涂层和安全护目镜) 即可完成。虽然 tba 和 hmds 都是易燃的, 但 tba 的毒性和成本都比 hmds 低, 成本也更低 (约为 hmds 成本的 1.5倍)。

在这篇文章中, 我们描述了如何固定, 洗涤, 脱水, 干燥, 安装, 溅射外套, 和图像三种类型的生物体: 蓝藻(toxifilum mysicida, golenkina sp., 和一个未知的 sp), 两种黄酮类化合物属单诺莫诺莫莫莫莫尼卡(金银花和假花蝇) 和果蝇 (果蝇)。这些生物体的大小 (0.5μm 至4毫米) 和细胞多样性 (单细胞到多细胞) 范围很广, 但所有生物体都很容易适应 sem 分析, 只需进行样品制备所需的微小变化。该协议描述了使用化学脱水和扫描电镜分析来检查三种生物的形态细节的方法, 并将广泛适用于检查许多组织和组织类型。

研究方案

1. 准备和固定

1. 准备蓝藻。
   1. 在14:10 小时的光暗循环中,^在24°c 的温度下在 f/2 介质中生长单藻培养物。将足够的培养物转移到 1.5 ml 的微离心管中, 使细菌颗粒在10分钟内沉淀后, 其大小约为0.05 毫升。取出培养基, 更换1.5 毫升的固剂 (1.25 戊二醛, 0.1 m 磷酸盐缓冲液 ph 7.0), 轻轻反转数次, 并在4°c 下孵育过夜。
   2. 根据电池的大小, 用玻璃移液器将固定单元转移到装有25mm 的聚碳酸酯25毫米过滤器的10毫升过滤器中.用橡胶塞子密封侧臂和漏斗, 以包含漏斗中的培养。取下两个塞子后, 在过滤瓶上用温和的真空去除固定装置。
      注意: 如果聚碳酸酯滤清器上的电池密度不是最佳的, 请调整使用的起始培养量。
2. 准备单细胞藻类 (黄酮类化合物)。
   1. 在 af-6 介质26中生长单^藻培养物, 在 14:10小时的浅暗循环温度下, 在介质中添加150毫升 l-1 的商业上可用的土壤-水介质。用玻璃移液器将低密度 (od₆₀₀ < 0.5) 培养的2毫升转移到装有8μm 毛孔的聚碳酸酯25毫米过滤器的10毫升过滤装置 (图 1) 中。用橡胶塞子密封侧臂和漏斗, 以包含漏斗中的培养。
      注意: 如果聚碳酸酯滤清器上的电池密度不是最佳的, 请调整使用的起始培养量。
   2. 将三滴四氧化二铬直接放入培养物中, 并允许孵育 30分钟, 在取出两个塞子后, 在过滤瓶上轻轻吸尘。
      注: oso₄是一种急性毒素 (皮肤、口腔和吸入途径), 对皮肤有腐蚀性, 对眼睛有害, 并具有呼吸增敏剂。oso₄应使用适当的个人防护设备 (包括手套、实验室涂层和眼睛保护) 在化学烟罩中进行处理。
3. 准备果蝇(果蝇)²³。
   1. 使用100% 的二氧化碳对成年苍蝇进行麻醉。将麻醉成人 (约10至30苍蝇) 放入小型塑料螺帽小瓶或 1.5 ml 离心管中。
   2. 浸泡麻醉剂在4°c 下在1毫升的固定物 (1.25 戊二醛, 0.1 m 磷酸盐缓冲液 ph 7.2) 下 2小时 (或隔夜) 飞行。如果苍蝇漂浮在固定物的表面, 加入几滴2.5% 的聚乙二醇叔八烷基苯醚, 以削弱固定剂的表面张力, 从而使组织完全浸入。使用玻璃管拆卸固定装置。

2. 清洗和脱水

1. 清洗蓝藻并使其脱水。
   1. 用5毫升 0.1 m 磷酸盐缓冲液 ph 7.0 在室温下每次10分钟清洗固定样品3次。保持烧瓶和漏斗塞住, 以保持清洗。取下两个塞子后, 用过滤瓶上的温和真空取下每次清洗。
   2. 在使用分级乙醇系列保持连续浸泡的同时, 在漏斗中保持10分钟的体积, 使样品脱水。分级乙醇浓度为: 25%、50%、75%、95% 和 2% 100% 乙醇变化。保持烧瓶和漏斗塞住, 以控制漏斗中的乙醇, 防止通过蒸发和通过过滤器的被动流动造成损失。
   3. 在取下两个塞子后, 在过滤瓶上用温和的真空去除乙醇。将滤清器/样品转移到一次性铝制称重盘中, 该片仅含有100% 乙醇, 可在干燥前覆盖样品。
2. 清洗单细胞藻类 (黄酮类化合物) 并使其脱水。
   1. 在室温下用5毫升的去离子水清洗固定样品三次, 每次10分钟。保持烧瓶和漏斗塞, 以包含在漏斗中的清洗。取下两个塞子后, 用过滤瓶上的温和真空取下每次清洗。
   2. 在漏斗中使用分级乙醇系列在5毫升的体积中, 在保持连续浸泡10分钟的同时, 使样品脱水。分级乙醇浓度为: 25%、50%、75%、95% 和 2% 100% 乙醇变化。保持烧瓶和漏斗塞住, 以控制漏斗中的乙醇, 防止通过蒸发和通过过滤器的被动流动造成损失。
   3. 在取下两个塞子后, 在过滤瓶上用温和的真空去除乙醇。将滤清器/样品转移到一次性铝制称重盘中, 该片仅含有100% 乙醇, 可在干燥前覆盖样品。
3. 清洗果蝇(果蝇) 并使其脱水。
   1. 用1毫升 0.1 m 磷酸盐缓冲液 ph 7.2 在室温下在 1.5 ml 微离心管中清洗固定样品 3次, 时间为10分钟。用玻璃移液器取下每次洗碗, 注意不要取出苍蝇。
   2. 使用分级乙醇系列使样品脱水, 在微泡管中的体积为1毫升, 为10分钟。乙醇浓度为: 25%、50%、75%、80%、95%、100%。用玻璃移液器去除乙醇, 注意不要取出苍蝇。
   3. 在干燥前, 用足够的100% 乙醇将样品保留在 1.5 ml 微离心管中。

3. 干燥

1. 使用 t-丁醇 (tba)^进行化学干燥27。
   1. 将100% 乙醇溶液更换为1:1 的 tba 溶液和100% 乙醇溶液 20分钟. 将1:1 溶液更换为 100% tba 20分钟. 重复两次。将溶液保持在 37°c, 这样 tba 就不会冻结。
      注: 100% tba 的冰点为 25.5°c;1: 1 解决方案在室温下不会冻结。tba 是易燃的, 引起严重的眼睛刺激, 吸入是有害的, 并可能导致呼吸道刺激, 嗜睡, 或头晕。tba 应使用适当的个人防护设备 (包括手套、实验室涂层和护目镜) 在化学烟罩中进行处理。
   2. 将 tba 中的样品 (如果在 1.5 ml 微离心管中) 转移到一次性铝称重盘中。一旦进入铝称重盘, 取出 tba, 并更换足够新鲜的 100% tba 覆盖样品。在4°c 下冻结 tba 10分钟。
   3. 转移到真空干燥器 (钟罐) 与冷冻凝胶包, 以保持 tba 冷冻。用旋转泵排出并保持真空, 使样品通过冷冻 tba 的真空升华干燥至少3小时或一夜。
2. 使用六甲基二硅烷 (hmds)²⁰进行化学干燥。
   1. 将100% 乙醇溶液更换为1:2 溶液的 hmds, 将100% 乙醇溶液更换 20分钟. 用2:1 溶液和100% 乙醇溶液更换1:2 溶液, 用2:1 溶液更换2:1 溶液, 用 100% hmds 更换 20分钟. 重复一次。
      注: hmds 是易燃的, 是一种急性毒素 (皮肤途径)。hmds 应使用适当的个人防护设备 (包括手套、实验室涂层和眼睛保护) 在化学烟罩中进行处理。
   2. 将 hmds 中的样品 (如果在 1.5 ml 微离心管中) 转移到一次性铝称重盘中。一旦进入铝称重盘, 将100% 的 hmds 替换为足够新鲜的 100% hmds 来覆盖样品。
   3. 将样品转移到塑料或玻璃非真空干燥剂与新鲜干燥剂 (5-6 厘米深), 并放置在化学烟罩。或者, 将样品直接放在化学烟罩中, 用宽松的盖子 (如盒子) 干燥, 以防止碎片落在样品上。让样品干燥12至24小时。

4. 安装

1. 安装蓝藻和黄酮类化合物。
   1. 标记12或25毫米铝安装存根的底部, 以指示顶部放置的内容。如果使用12毫米存根, 则用干净的剃须刀片或手术刀将用干燥的细胞将聚碳酸酯滤清器切割成宿舍, 如果使用25毫米的存根, 则将整个滤清器放入宿舍。
   2. 将每个过滤器放在固定在存根顶部的粘合剂或碳粘合剂标签上。
2. 果蝇 (果蝇)。
   1. 在铝安装存根的底部贴上标签, 以表明顶部放置的是什么。
      将干燥的苍蝇放置在胶粘剂或碳粘合剂标签上的所需位置, 用精密的推子固定在存根的顶部。
   2. 在存根的外缘周围涂上银导电胶粘剂,即银漆。使用牙签将银漆连接到苍蝇上, 以确保导电性。不要让油漆接触所需的成像区域。
   3. 将存根放在存根支架盒中, 并将打开的存根支架盒放在干燥器中。让银漆干燥至少3小时或夜间, 以获得最佳效果。

5. 喷射式涂层

1. 通过4至5次燃烧氩气准备溅射涂层设备。如果湿度高 (即,房间空气感觉潮湿, 通常约50% 的相对湿度), 执行六到七次冲洗。推杆按照制造商的说明涂上存根。
2. 基于使用的样品的涂层样品:
   1. 对于带有蓝藻的过滤器, 将定时器设置为180秒的溅射涂层。
   2. 对于具有真核藻类的过滤器,即优格伦特, 将定时器设置为 120 s 的溅射涂层, 然后在45°角的三面上的20秒。
   3. 对于大型样品,即飞头, 将定时器设置为飞溅涂层, 直接为 60秒, 然后在45°角的每一侧30秒。
      注意: 涂层完成后, 存根的颜色应为浅灰色。

6. 成像

1. 使用包括二次电子 (se) 检测器的扫描电子显微镜的图像样本。
   1. 对于蓝藻, 请应用以下设置: 3-5 kv 加速器电压 (ac)、20-30 探头电流 (pc) 和 5 mm 工作距离 (wd)。对于黄酮类化合物, 请使用 3 kv ac、30 pc 和 5 mm wd。对于苍蝇, 请使用 5 kv ac、30 pc 和5至10毫米 wd。
2. 根据要可视化的细节或对象的大小调整放大倍率。调整柱头、光圈和焦点, 直到产生清晰的图像。根据制造商的 sem 说明, 使用高分辨率设置捕获图像。

结果

蓝藻是对全球碳、氧和氮循环28、²⁹至关重要的原核生物群。在估计的6000种蓝藻中, 大多数有粘液鞘, 覆盖和连接细胞和其他结构³¹, 连同形状, 可以通过显微镜^下解决32。细胞大小、形状和色素存在区分个别物种和水生栖息地, 可以想象为蓝藻 "开花"²⁸。现代?...

讨论

在这里, 我们描述了一个协议使用 sem 来获取有关三种生物的外部形态特征的详细信息, 其他生物可以应用于检查许多类型的生物体或组织的特征。在协议的每个步骤中, 都可能出现潜在的误差点, 下文将对此进行详细讨论。

虽然这里给出的固定和洗涤量是具体的, 但一般来说, 固定和洗涤的体积应该是样品体积的5-10x。所有的固定、清洗和脱水时间都是基于我们的经验, 如果出?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
gold–palladium	Ted Pella, Inc.	91212
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black	Sigma	WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110606
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
F/2 media	Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin	https://utex.org/products/f_2-medium	No Catalog number given - see link
AF6 media	Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota	https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf	No Catalog number given - see link
Soil water medium	Carolina Biological Supply Company	153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4	No Catalog number given - see link
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE	The company doesn't appear to sell this model any longer