Preparação de organismos procariotas e eucariotas, utilizando secagem química para análise morfológica em microscopia eletrônica (SEM)

Resumo

SEM análise é um método eficaz para auxiliar na identificação de espécies ou discriminação fenotípica. Este protocolo descreve os métodos para examinar detalhes morfológicos específicos dos três tipos de representante dos organismos e seria amplamente aplicável para examinar características de muitos organismos e tipos de tecido.

Resumo

Microscopia eletrônica (SEM) é uma técnica amplamente disponível que foi aplicada para estudar espécimes biológicos variando entre proteínas individuais para as células, tecidos, organelas e organismos nem todo. Este protocolo centra-se em dois métodos de secagem químicos, hexamethyldisilazane (HMDS) e álcool t-butílico (TBA) e sua aplicação para geração de imagens de organismos procariotas e eucariotas, usando SEM. Neste artigo, descrevemos como corrigir, lavar, desidratar, secar, montar, salpicar o casaco e três tipos de organismos de imagem: cianobactérias (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. e um desconhecido SP.), dois Ciliophora do género Monomorphina (M. aenigmatica e M. pseudopyrum) e a mosca da fruta (Drosophila melanogaster). O propósito do presente protocolo é descrever um método rápido, barato e simples para obter informações detalhadas sobre a estrutura, tamanho e características de superfície das amostras que podem ser amplamente aplicadas a uma grande variedade de organismos, para morfológica avaliação. Conclusão bem-sucedida do presente protocolo permitirá que os outros a usar SEM Visualizar amostras aplicando essas técnicas a seu sistema.

Introdução

Um microscópio eletrônico de varredura (MEV) utiliza um feixe focalizado de elétrons de alta energia para gerar uma imagem de elétrons secundários que mostra a morfologia e topografia de uma amostra de¹. SEM pode ser usado para determinar diretamente o tamanho físico de uma amostra, a estrutura de superfície e a forma tridimensional e oferece maior resolução e maior profundidade de campo em comparação com microscopia de luz. Outra forma de (EM) microscopia eletrônica de varredura, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) usa focalizado de elétrons que passam através da amostra, gerando imagens com detalhes finos da estrutura interna. Enquanto TEM tem uma resolução maior do que a luz ou SEM e pode ser usado para resolver estruturas tão pequenas quanto átomos único, tem três desvantagens principais: preparação da amostra extensa, um pequeno campo de visão e uma profundidade de campo,^2,3. Embora outros visualizado protocolos existem usando SEM examinar específicas das células, organelas ou tecidos^{4,5,6,7,8,9, 10} , este protocolo é o único que podemos descrever métodos que podem ser amplamente aplicados a uma grande variedade de organismos, para avaliação morfológica.

SEM tem encontrado grandes aplicações pela análise de materiais inorgânicos, incluindo as nanopartículas^11,12, polímeros¹³e numerosas aplicações em Ciências Geológicas, industrial e material^{14, 15,16}. Em biologia, SEM tem sido muito utilizado como um método para analisar amostras biológicas variando entre proteínas individuais para toda organismos^17,18. SEM é de particular valor porque detalhes morfológicos de superfície podem ser usados para informar a descoberta científica. SEM análise é um método rápido, barato e simples para obter informações detalhadas sobre a estrutura, tamanho e características de superfície de uma vasta gama de amostras biológicas.

Porque um SEM normalmente opera sob alto vácuo (10^-6 Torr mínimo) para oferecer suporte a um feixe coerente de elétrons de alta velocidade, nada de líquidos (água, óleos, álcoois) é permitida na câmara de amostra, como líquidos evitar um vácuo de formando. Assim, todas as amostras examinadas usando SEM devem ser desidratadas, tipicamente usando uma série gradual do etanol, seguida por um processo de secagem para remover o etanol. Existem vários métodos de secagem de tecidos biológicos para uso em SEM, incluindo o ar de secagem, liofilização, uso de um ponto crítico secagem (CPD) dispositivo, ou químico de secagem usando álcool t-butílico (TBA) ou hexamethyldisilazane (HMDS)^{19, 20 , 21 , 22}. mais frequentemente, a seleção de um método de secagem é empírica desde que cada amostra biológica pode reagir de forma diferente para cada método de secagem. Para qualquer determinada amostra, todos esses métodos podem ser apropriados, comparar as vantagens e desvantagens de cada um é útil na seleção do método apropriado.

Enquanto o ar de secagem de uma amostra em temperatura ambiente ou em um forno de secagem (60 ° C) é o método mais simples, a maioria das amostras biológicas mostrar danos induzida por secagem como murchar e entrar em colapso, resultando em distorção da amostra. O processo de liofilização também remove a água (ou gelo) de uma amostra, mas requer amostras para ser congelado e colocado sob vácuo para remover o gelo através do processo de sublimação, potencialmente danificar a amostra. Além disso, o usuário deve ter acesso a um liofilizador. O método mais comumente usado para desidratar amostras para SEM é ponto crítico (CPD) de secagem. No CPD, o etanol em uma amostra é substituído com líquido de dióxido de carbono (CO₂) e, sob temperatura específica e as condições de pressão, conhecidas como o ponto crítico (31,1 ° C e 1.073 psi), CO₂ , vaporiza sem criar tensão de superfície, desse modo efetivamente, mantendo as características morfológicas e estruturais da amostra. Enquanto o CPD é geralmente o método padrão, tem várias desvantagens. Em primeiro lugar, o processo requer acesso a um ponto crítico secador, que não só é caro, mas também exige o uso de líquido de dióxido de carbono. Em segundo lugar, o tamanho da amostra que pode ser secada é limitado ao tamanho da câmara do secador ponto crítico. Em terceiro lugar, a troca de líquidos durante o CPD pode causar turbulência que pode danificar a amostra.

Secagem química oferece muitas vantagens sobre o CPD e serve como uma alternativa adequada que está se tornando amplamente utilizada na preparação da amostra SEM. O uso de produtos químicos dehydrants como TBA e HMDS oferece uma alternativa rápida, barata e simples para outros métodos, mantendo ainda a integridade estrutural da amostra. Recentemente mostramos que não houve diferença na integridade do tecido ou da qualidade da imagem final capturada quando usando CPD ou TBA como método de secagem em adultos Drosophila tecido retinal²³. Ao contrário de CPD, TBA e HMDS não necessitam de um instrumento de secagem ou líquido de CO₂ e não há nenhuma limitação no tamanho da amostra a ser secada. Além de obterem os produtos químicos, apenas um padrão químico de coifa e equipamento de protecção adequado (luvas, jaleco e óculos de segurança) são necessários para completar o processo de secagem. Enquanto ambos TBA e HMDS são inflamáveis, TBA é menos tóxico e mais barato (aproximadamente 1/3 do custo de HMDS) do que HMDS.

Neste artigo, descrevemos como corrigir, lavar, desidratar, secar, montar, salpicar o casaco e três tipos de organismos de imagem: cianobactérias (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. e um desconhecido SP.), dois Ciliophora do género Monomorphina (M. aenigmatica e M. pseudopyrum) e a mosca da fruta (Drosophila melanogaster). Estes organismos representam uma ampla gama de tamanho (0,5 µm a 4 mm) e diversidade celular (unicelular ao multicelular), no entanto, todos são facilmente passíveis de análise SEM com apenas pequenas variações necessárias para a preparação das amostras. Este protocolo descreve os métodos para usar desidratação química e análise SEM examinar detalhes morfológicos dos três tipos de organismos e seria amplamente aplicável para examinar muitos organismos e tipos de tecido.

Protocolo

1. preparação e fixação

1. Prepare cianobactérias.
   1. Crescem as culturas unialgal em mídia de F/2^24,25 a uma temperatura de 28 ° C em um 14:10 h luz ciclo escuro. Transferência de cultura suficiente para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL tal que, após permitir 15 min resolver, a pelota bacteriana é cerca de 0,05 mL em tamanho. Remova a mídia e substituir com 1,5 mL de fixador (1,25% glutaraldeído, tampão de fosfato 0,1 M pH 7,0), gentilmente inverter várias vezes e incubar durante a noite a 4 ° C.
   2. Transferi as células fixas com uma pipeta de vidro para um equipamento de filtração de 10 mL (Figura 1) que contém um filtro de 25 mm de policarbonato com 0,8 ou 0,2 µm poros, dependendo do tamanho das células. Selar o lado do braço e funil com rolhas de borracha para conter a cultura no funil. Retire o fixador por vácuo suave sobre o frasco de filtração, após a remoção de ambos os bujões.
      Nota: Se a densidade celular no filtro de policarbonato não é o ideal, ajuste a quantidade de cultura usada a começar.
2. Prepare algas unicelulares (Ciliophora).
   1. Cultivar culturas unialgal em AF-6 mídia²⁶ com 150 mL L^-1 de meio comercialmente disponíveis do solo-água adicionado para a mídia, a uma temperatura de 22 ° C em um 14:10 h luz ciclo escuro. Transferência de 2 mL de baixa densidade (OD₆₀₀ < 0.5) cultura com uma pipeta de vidro para um equipamento de filtração de 10 mL (Figura 1) que contém um filtro de 25 mm de policarbonato com 8 µm de poros. Selar o lado do braço e funil com rolhas de borracha para conter a cultura no funil.
      Nota: Se a densidade celular no filtro de policarbonato não é o ideal, ajuste a quantidade de cultura usada a começar.
   2. Adicione três gotas de tetróxido de ósmio de 4% (OsO₄) diretamente para a cultura e deixe para incubar por 30 min. Retire o fixador por vácuo suave sobre o frasco de filtração, após a remoção de ambos os bujões.
      Nota: OsO₄ é uma toxina aguda (dérmica, oral e inalação rotas), corrosivo para a pele, prejudiciais para os olhos e um sensibilizador respiratório. OsO₄ deve ser tratada em uma coifa química utilizando equipamento de protecção adequado incluindo luvas, jaleco e óculos de proteção.
3. Prepare a Drosophila melanogaster (mosca de fruta)²³.
   1. Anestesia moscas adultas usando 100% de dióxido de carbono. Lugar anestesiados adultos (cerca de 10 a 30 moscas) em um tubo de centrifugação de frasco ou 1,5 mL tampa de rosca de plástico pequena.
   2. Mergulhe as moscas anestesiadas em 1 mL de fixador (1,25% glutaraldeído, 0,1 M de tampão fosfato pH 7,2) para 2 h (ou durante a noite) a 4 ° C. Se as moscas flutuam à superfície do fixador, adicione algumas gotas de éter de tert-octilfenil 2,5% glicol de polietileno para enfraquecer a tensão superficial do fixador permitindo a submersão total do tecido. Retire o fixador usando uma pipeta de vidro.

2. lavar e desidratação

1. Lave e desidratar cianobactérias.
   1. Lave a amostra fixa três vezes com 5 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 7,0 à temperatura ambiente durante 10 minutos cada. Mantenha o frasco e funil rolhado para segurar a lavagem. Remova cada lavagem por vácuo suave sobre o frasco de filtração, após a remoção de ambos os bujões.
   2. Desidrate a amostra, mantendo a imersão contínua usando uma série gradual do etanol, por 10 min em um volume de 5 mL no funil. As concentrações de etanol classificados são: 25%, 50%, 75%, 95% e 2 trocas de 100% de etanol. Mantenha o frasco e funil rolhado para conter o etanol no funil, evitando a perda de ambos através da evaporação e passiva através do filtro.
   3. Remova o etanol por vácuo suave sobre o frasco de filtração, após a remoção de ambos os bujões. Transferi a filtro/amostra para uma cápsula contendo apenas o suficiente etanol 100%, para cobrir a amostra antes da secagem em alumínio descartável.
2. Lave e desidrata algas unicelulares (Ciliophora).
   1. Lave a amostra fixa três vezes com 5 mL de água desionizada à temperatura ambiente durante 10 minutos cada. Mantenha o frasco e funil rolhado para conter a lavagem no funil. Remova cada lavagem por vácuo suave sobre o frasco de filtração, após a remoção de ambos os bujões.
   2. Desidrate a amostra, mantendo a imersão contínua usando uma série de etanol classificados por 10 min em um volume de 5 mL no funil. As concentrações de etanol classificados são: 25%, 50%, 75%, 95% e 2 trocas de 100% de etanol. Mantenha o frasco e funil rolhado para conter o etanol no funil, evitando a perda de ambos através da evaporação e passiva através do filtro.
   3. Remova o etanol por vácuo suave sobre o frasco de filtração, após a remoção de ambos os bujões. Transferi a filtro/amostra para uma cápsula contendo apenas o suficiente etanol 100%, para cobrir a amostra antes da secagem em alumínio descartável.
3. Lave e desidratar Drosophila melanogaster (mosca de fruta).
   1. Lave a amostra fixa três vezes com 1 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 7,2 em temperatura ambiente por 10 min em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Remova cada lavagem com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não remover as moscas.
   2. Desidrate a amostra usando uma série gradual do etanol, por 10 min em um volume de 1 mL em um tubo de microcentrífuga. As concentrações de etanol são: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Remova o etanol com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não remover as moscas.
   3. Manter a amostra no tubo de microcentrifuga de 1,5 mL com suficiente etanol 100%, para cobrir a amostra antes da secagem.

3. secagem

1. Realize a secagem química usando t-butílico álcool (TBA)²⁷.
   1. Substitua a solução de etanol 100% com uma solução de 1:1 da TBA e 100% etanol de 20 min. substituir a solução de 1:1 com 100% de TBA de 20 min. repetir duas vezes. Manter a solução a 37 ° C para que a TBA não congela.
      Nota: 100% TBA tem um ponto de congelação de 25,5 ° C; a solução de 1:1 não irá congelar em temperatura ambiente. TBA é inflamável, causa irritação ocular grave, é prejudicial se inalado e pode causar irritação respiratória, sonolência ou tonturas. TBA deve ser tratada em uma coifa química utilizando equipamento de protecção adequado incluindo luvas, jaleco e óculos de proteção.
   2. Transferi a amostra no TBA, se em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, para um prato de pesagem de alumínio descartável. Uma vez no prato de pesagem de alumínio, remover TBA e substitua apenas bastante frescos TBA 100% para cobrir a amostra. Congele a TBA a 4 ° C por 10 min.
   3. Transferir para um vácuo exsicador (redoma) com pacotes de gel congelada para manter TBA congelado. Evacuar e manter um vácuo com uma bomba rotativa para permitir que a amostra secar por vácuo sublimação da TBA congelado pelo menos 3 h ou durante a noite.
2. Realize a secagem química usando hexamethyldisilazane (HMDS)²⁰.
   1. Substitua a solução de etanol 100% com uma solução de 1:2 de HMDS e 100% etanol de 20 min. substituir a solução de 1:2 com uma solução de 2:1 de HMDS e 100% etanol de 20 min. a 2:1 solução com 100% HMDS de 20 min. repetir uma vez.
      Nota: HMDS é inflamável e uma toxina aguda (via dérmica). HMDS deve ser tratada em uma coifa química utilizando equipamento de protecção adequado incluindo luvas, jaleco e óculos de proteção.
   2. Transferi a amostra em HMDS, se em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, para um prato de pesagem de alumínio descartável. Uma vez que o alumínio pesando prato, substituir a 100% HMDS com apenas bastante frescos 100% HMDS para cobrir a amostra.
   3. Transferir a amostra para um Dessecador de não-vácuo de plástico ou vidro com dessecante fresco (5-6 cm de profundidade) e coloque em uma capa das emanações químicas. Como alternativa, coloque a amostra diretamente em uma coifa química para secar com uma tampa solta, tais como uma caixa, para evitar que detritos caindo na amostra. Permitir que a amostra secar durante 12 a 24 h.

4. montagem

1. Montagem de cianobactérias e Ciliophora.
   1. Rotule a parte inferior de qualquer um de alumínio 12 - ou -25mm montagem esboço para indicar o que está sendo colocado no topo. Corte o filtro de policarbonato com as células secas em bairros com uma lâmina de barbear limpa ou bisturi se usando um esboço de 12 mm, ou colocar o filtro inteiro se usando um esboço de 25 mm.
   2. Coloca cada filtro em adesivo ou uma guia de adesivo de carbono fixado ao topo de um esboço.
2. Montagem de Drosophila melanogaster (mosca de fruta).
   1. Rotule o fundo do esboço de montagem alumínio para indicar o que está sendo colocado no topo.
      Coloque as moscas secas na posição desejada na guia adesivo adesivo ou carbono fixado ao topo de um esboço sob um microscópio de dissecação com pinças de precisão.
   2. Aplique o adesivo condutivo prateado, i.e., prata, pintura, em torno das bordas exteriores dos stubs. Conecte as moscas usando um palito de dente para garantir a condutividade, a tinta prateada. Não permita que a tinta tocar a área de imagem desejada.
   3. Coloque os stubs em uma caixa de titular de esboço e coloque a caixa de titular do esboço aberto num exsicador. Permitir que a tinta prata secar pelo menos durante 3 horas ou durante a noite para obter os melhores resultados.

5. revestimento de salpicar

1. Prepare o aparelho de revestimento por pulverização catódica através da realização de quatro a cinco liberações de gás argônio. Se a umidade é alta (ou seja, o ar é úmido, geralmente sobre 50% de humidade relativa), realizar liberações de seis a sete. Por pulverização catódica revestir os stubs seguindo as instruções do fabricante.
2. Amostras de casaco com base na amostra utilizada:
   1. Para filtros com cianobactérias, defina o temporizador a salpicar o casaco para 180 s reto na.
   2. Para filtros com algas eucarióticas, ou seja, Ciliophora, definir o temporizador a salpicar o casaco para 120 s reto em e, em seguida, 20 s em três lados em um ângulo de 45 °.
   3. Para grandes amostras, ou seja, cabeças de mosca, definir o temporizador a salpicar o casaco para 60 s reto em e, em seguida, 30 s de cada lado em um ângulo de 45 °.
      Nota: Depois que o revestimento é completo, esboços sobre deve ser cinza-claro.

6. imaging

1. Amostras de imagem usando um microscópio eletrônico de varredura que inclui um detector de elétrons secundários (SE).
   1. Para cianobactérias, aplique as seguintes configurações: 3-5 kV tensão de accelerator (AC), sonda de corrente (PC) 20-30 e distância de trabalho de 5 mm (WD). Para Ciliophora, use 3 kV AC, 30 PC e 5 mm WD. Para moscas, use 5 kV AC, 30 PC e 5 a 10 mm WD.
2. Ajuste a ampliação, dependendo do tamanho do detalhe ou do objeto a ser visualizado. Ajuste o foco, aberturas e stigmators até uma imagem clara é produzida. Capturar a imagem usando as configurações de alta resolução de acordo com as instruções do fabricante da SEM.

Resultados

Cianobactérias são um grupo de procariontes de organismos que são críticas para o global de carbono, oxigênio e nitrogênio ciclos^28,29. Da cerca de 6000 espécies de cianobactérias³⁰, mais tem uma bainha mucilaginoso que cobrem e conectar as células juntas e com outras estruturas de³¹, que junto com a forma, pode ser resolvido, microscopicamente,³². Ta...

Discussão

Aqui descrevemos um protocolo usando SEM para obter informações detalhadas sobre características morfológicas externas dos três tipos de organismos que outros podem aplicar para examinar características de muitos tipos de organismos ou de tecidos. Dentro de cada etapa do protocolo, são os pontos potenciais de erro que possa surgir e são discutidas em detalhes abaixo.

Enquanto os volumes de fixador e lavagens dadas aqui são específicos, em geral, o fixador e lavagens devem ser 5-10x o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
gold–palladium	Ted Pella, Inc.	91212
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black	Sigma	WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110606
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
F/2 media	Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin	https://utex.org/products/f_2-medium	No Catalog number given - see link
AF6 media	Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota	https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf	No Catalog number given - see link
Soil water medium	Carolina Biological Supply Company	153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4	No Catalog number given - see link
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE	The company doesn't appear to sell this model any longer