Preparazione di organismi procarioti ed eucarioti mediante essiccazione chimica per analisi morfologica in microscopia elettronica (SEM)

Riepilogo

Analisi SEM sono un metodo efficace per aiutare nell'identificazione di specie o discriminazione fenotipica. Questo protocollo descrive i metodi per l'esame di specifici dettagli morfologici dei tre tipi rappresentativi di organismi e sarebbe ampiamente applicabile ad esaminare le caratteristiche di molti organismi e tipi di tessuto.

Abstract

Microscopia elettronica (SEM) è una tecnica ampiamente disponibile che è stata applicata per lo studio di campioni biologici che vanno da singole proteine, cellule, tessuti, organelli e persino interi organismi. Questo protocollo si concentra su due metodi di essiccazione chimiche, esametildisilazano (HMDS) e alcol t-butilico (TBA) e loro applicazione all'imaging di organismi sia procarioti ed eucarioti utilizzando SEM In questo articolo, descriviamo come difficoltà, lavare, disidratare, asciugare, montare, polverizza il cappotto e tre tipi di organismi di immagine: cianobatteri (Toxifilum mysidocida, SP. Golenkina e an SP sconosciuto), due euglene dal genere Monomorphina (M. Enigmonia e M. pseudopyrum) e la Mosca della frutta (Drosophila melanogaster). Lo scopo del presente protocollo è di descrivere un metodo veloce, economico e semplice per ottenere informazioni dettagliate sulla struttura, dimensioni e caratteristiche superficiali degli esemplari che possono essere ampiamente applicati a una vasta gamma di organismi per morfologica valutazione. Completamento del presente protocollo permetterà ad altri di utilizzare SEM per visualizzare esempi di applicazione di queste tecniche al loro sistema.

Introduzione

Un microscopio elettronico a scansione (SEM) usa un fascio focalizzato di elettroni ad alta energia per generare un'immagine da elettroni secondari che mostra la morfologia e topografia di un campione¹. SEM può essere utilizzato per determinare direttamente la dimensione fisica di un campione, la struttura della superficie e la forma tridimensionale e offre una risoluzione maggiore e maggiore profondità di campo rispetto alla microscopia. Un'altra forma di microscopia elettronica (EM), microscopia elettronica a trasmissione (TEM) utilizza concentrati gli elettroni che passano attraverso il campione, generando le immagini con dettagli raffinati della struttura interna. Mentre TEM ha risoluzione superiore a quella luce o SEM e può essere utilizzato per risolvere strutture piccole come singoli atomi, ha tre inconvenienti principali: preparazione del campione vasto, un piccola campo di vista e una profondità di campo^2,3. Anche se altri visualizzati protocolli esistano utilizzando SEM per esaminare specifiche cellule, organelli o tessuti^{4,5,6,7,8,9, 10} , questo protocollo è unico in quanto Descriviamo i metodi che possono essere ampiamente applicate a una vasta gamma di organismi per la valutazione morfologica.

SEM ha trovato grandi applicazioni per l'esame di materiali inorganici tra cui nanoparticelle^11,12, polimeri¹³e numerose applicazioni in Scienze geologiche, industriale e materiale^{14, 15,16}. In biologia, SEM è stato utilizzato a lungo come un metodo per l'esame di campioni biologici che vanno da singole proteine a interi organismi^17,18. SEM è di particolare valore perché morfologiche particolari di superficie possono essere utilizzati per informare la scoperta scientifica. Analisi SEM sono un metodo veloce, economico e semplice per ottenere informazioni dettagliate sulla struttura, dimensioni e caratteristiche superficiali di una vasta gamma di campioni biologici.

Perché un SEM opera normalmente sotto alto vuoto (10^-6 Torr minimo) per supportare un fascio coerente di elettroni ad alta velocità, liquidi (acqua, oli, alcoli) non sono consentito nel pozzetto di misurazione, come liquidi che impedire il formarsi di un vuoto. Così, tutti i campioni esaminati usando SEM devono essere disidratati, in genere utilizzando una serie di graduali etanolo seguita da un processo di essiccazione per rimuovere l'etanolo. Ci sono diversi metodi di essiccazione tessuti biologici per l'uso nel SEM, tra cui essiccazione all'aria, liofilizzazione, utilizzo di un dispositivo di punto critico essiccazione (CPD), o essiccazione utilizzando alcol t-butilico (TBA) o esametildisilazano (HMDS)^19, chimica ^{20 , 21 , 22}. più spesso, la selezione di un metodo di essiccazione è empirico poiché ogni campione biologico può reagire diversamente a ogni metodo di essiccazione. Per qualsiasi dato campione, tutti questi metodi può essere appropriati, quindi confrontare i vantaggi e gli svantaggi di ciascuno è utile per selezionare il metodo appropriato.

Mentre aria asciugatura un campione a temperatura ambiente o in un forno di essiccazione (60 ° C) è il metodo più semplice, maggior parte dei campioni biologici mostrano danni indotti da essiccazione come avvizzimento e collasso, con conseguente distorsione del campione. Il processo di liofilizzazione inoltre rimuove l'acqua (o ghiaccio) da un campione, ma richiede campioni per essere congelato flash e messo sottovuoto per rimuovere il ghiaccio tramite il processo di sublimazione, potenzialmente danneggiare il campione. Inoltre, l'utente deve avere accesso a un liofilizzatori. Il metodo più comunemente usato per la disidratazione di campioni per il SEM è punto critico essiccazione (CPD). In CPD, l'etanolo in un campione viene sostituita con liquido anidride carbonica (CO₂) e, sotto specifica condizioni di temperatura e pressione conosciute come il punto critico (31,1 ° C e 1.073 psi), CO₂ vaporizza senza creare tensione superficiale, quindi in modo efficace mantenendo le caratteristiche morfologiche e strutturali del campione. Mentre CPD è generalmente il metodo standard, ha diversi inconvenienti. In primo luogo, il processo richiede l'accesso a un punto critico asciugacapelli, che non è solo costoso, ma richiede anche l'uso di anidride carbonica liquida. In secondo luogo, la dimensione del campione che possa essere essiccato è limitata alla dimensione camera del punto critico asciugacapelli. In terzo luogo, lo scambio di liquidi durante CPD può causare turbolenze che possono danneggiare il campione.

Essiccazione chimica offre molti vantaggi rispetto CPD e serve come un'alternativa appropriata diventando ampiamente utilizzato nella preparazione del campione di SEM. L'uso di dehydrants chimici quali TBA e HMDS offre un'alternativa veloce, poco costoso e semplice ad altri metodi, pur mantenendo l'integrità strutturale del campione. Recentemente abbiamo dimostrato che non c'era nessuna differenza nell'integrità del tessuto o la qualità dell'immagine finale catturato quando si utilizza CPD o TBA come il metodo di essiccazione in adulto Drosophila tessuto retinico²³. A differenza di CPD, TBA e HMDS non necessitano di uno strumento di essiccazione o liquido CO₂ e non c'è nessuna limitazione sulla dimensione del campione per essere asciugato. Oltre a ottenere le sostanze chimiche, solo una cappa chimica standard e appropriati dispositivi di protezione individuale (guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza) sono necessari per completare il processo di essiccazione. Mentre TBA sia HMDS sono infiammabili, TBA è meno tossico e meno costoso (circa 1/3 del costo di HMDS) di HMDS.

In questo articolo, descriviamo come difficoltà, lavare, disidratare, asciugare, montare, polverizza il cappotto e tre tipi di organismi di immagine: cianobatteri (Toxifilum mysidocida, SP. Golenkina e an SP sconosciuto), due euglene dal genere Monomorphina (M. Enigmonia e M. pseudopyrum) e la Mosca della frutta (Drosophila melanogaster). Questi organismi rappresentano una vasta gamma di dimensioni (0,5 µm a 4 mm) e la diversità cellulare (unicellulare a pluricellulare), eppure tutte sono facilmente suscettibili di analisi SEM con solo piccole variazioni necessarie per la preparazione dei campioni. Questo protocollo descrive i metodi per l'utilizzo di disidratazione chimica e analisi SEM per esaminare i dettagli morfologici di tre tipi di organismi e sarebbe ampiamente applicabile all'esame di molti organismi e tipi di tessuto.

Protocollo

1. preparazione e la fissazione

1. Preparare i cianobatteri.
   1. Coltivare colture unialgali in F/2 media^24,25 ad una temperatura di 28 ° C su un 14:10 h ciclo scuro della luce. Trasferire cultura sufficiente in una microcentrifuga da 1,5 mL, in modo che dopo 15 min di stabilirsi, il pellet batterico è circa 0,05 mL di dimensioni. Rimuovere il supporto e sostituire con 1,5 mL di fissativo (1,25% glutaraldeide, 0.1 M tampone fosfato pH 7.0), delicatamente capovolgendo e incubare per una notte a 4 ° C.
   2. Trasferire le cellule fisse con una pipetta di vetro in un impianto di filtrazione di 10 mL (Figura 1) che contiene un filtro di 25 mm in policarbonato con 0,8 o 0,2 µm pori, a seconda delle dimensioni delle cellule. Il braccio laterale della guarnizione e imbuto con tappi di gomma per contenere la cultura nell'imbuto. Rimuovere il fissativo da dolce vuoto sul pallone di filtrazione, dopo la rimozione di entrambi i tappi.
      Nota: Se la densità delle cellule sul filtro in policarbonato non è ottima, regolare la quantità di avvio impostazioni cultura utilizzate.
2. Preparare le alghe unicellulare (euglene).
   1. Coltivare colture unialgali AF-6 media²⁶ con 150 mL L^-1 di mezzo commercialmente disponibile del suolo-acqua aggiunto ai media, ad una temperatura di 22 ° C su un 14:10 h ciclo scuro della luce. Trasferire 2 mL di densità bassa (OD₆₀₀ < 0,5) cultura con una pipetta di vetro in un impianto di filtrazione di 10 mL (Figura 1) che contiene un filtro di 25 mm in policarbonato con 8 µm pori. Il braccio laterale della guarnizione e imbuto con tappi di gomma per contenere la cultura nell'imbuto.
      Nota: Se la densità delle cellule sul filtro in policarbonato non è ottima, regolare la quantità di avvio impostazioni cultura utilizzate.
   2. Aggiungere tre gocce di 4% tetrossido di osmio (OsO₄) direttamente alla cultura e lasciar per incubare per 30 minuti, rimuovere il fissativo da dolce vuoto sul pallone di filtrazione, dopo la rimozione di entrambi i tappi.
      Nota: OsO₄ è una tossina acuta (cutanea, orale e inalazione routes), corrosivo per la pelle, dannoso per gli occhi e un sensibilizzante delle vie respiratorie. OsO₄ deve essere gestita in una cappa chimica mediante appropriati dispositivi di protezione individuale, compresi guanti, camice e occhiali protettivi.
3. Preparare la Drosophila melanogaster (moscerino della frutta)²³.
   1. Anestetizzare mosche adulte utilizzando il 100% di anidride carbonica. Posto anestetizzati adulti (circa 10-30 mosche) in una provetta da centrifuga tappo a vite in plastica piccolo flaconcino o 1,5 mL.
   2. Immergere anestetizzati mosche in 1 mL di fissativo (1,25% glutaraldeide, tampone fosfato 0,1 M a pH 7,2) per 2 ore (o tutta la notte) a 4 ° C. Se le mosche galleggiano sulla superficie del fissativo, aggiungere poche gocce di 2,5% polietilene glicole etere tert-octylphenyl per indebolire la tensione superficiale del fissativo permettendo per immersione totale del tessuto. Rimuovere il fissativo usando una pipetta di vetro.

2. lavaggio e disidratazione

1. Lavare e disidratare i cianobatteri.
   1. Lavare il campione fisso tre volte con 5 mL di tampone fosfato 0,1 M a pH 7.0 a temperatura ambiente per 10 min. ciascuno. Mantenere il matraccio ed imbuto tappato per contenere il lavaggio. Rimuovere ogni lavaggio delicato sottovuoto sul pallone di filtrazione, dopo la rimozione di entrambi i tappi.
   2. Disidratare il campione mantenendo immersione continua usando una serie graduata di etanolo, per 10 min in un volume di 5 mL nell'imbuto. Le concentrazioni di etanolo graduato sono: 25%, 50%, 75%, 95% e 2 cambi di etanolo al 100%. Mantenere il pallone e l'imbuto tappato per contenere l'etanolo nell'imbuto, prevenire la perdita di entrambi tramite evaporazione e passivo flusso attraverso il filtro.
   3. Eliminare l'etanolo dal delicato vuoto sul pallone di filtrazione, dopo la rimozione di entrambi i tappi. Trasferire il filtro/campione per un USA e getta in alluminio peso piatto contenente appena sufficiente etanolo al 100% per coprire il campione prima dell'essiccazione.
2. Lavare e disidratare le alghe unicellulare (euglene).
   1. Lavare il campione fisso tre volte con 5 mL di acqua deionizzata a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno. Mantenere il matraccio ed imbuto tappato per contenere il lavaggio nell'imbuto. Rimuovere ogni lavaggio delicato sottovuoto sul pallone di filtrazione, dopo la rimozione di entrambi i tappi.
   2. Disidratare il campione mantenendo immersione continua usando una serie graduata di etanolo per 10 min in un volume di 5 mL nell'imbuto. Le concentrazioni di etanolo graduato sono: 25%, 50%, 75%, 95% e 2 cambi di etanolo al 100%. Mantenere il pallone e l'imbuto tappato per contenere l'etanolo nell'imbuto, prevenire la perdita di entrambi tramite evaporazione e passivo flusso attraverso il filtro.
   3. Rimuovere l'etanolo dal delicato vuoto sul pallone di filtrazione, dopo la rimozione di entrambi i tappi. Trasferire il filtro/campione per un USA e getta in alluminio peso piatto contenente appena sufficiente etanolo al 100% per coprire il campione prima dell'essiccazione.
3. Lavare e disidratare Drosophila melanogaster (moscerino della frutta).
   1. Lavare il campione fisso tre volte con 1 mL di tampone fosfato 0,1 M a pH 7,2 a temperatura ambiente per 10 min in una microcentrifuga da 1,5 mL. Rimuovere ogni lavaggio con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non rimuovere le mosche.
   2. Disidratare il campione usando una serie graduata di etanolo, per 10 min in un volume di 1 mL in un tubo di microfuge. Le concentrazioni di etanolo sono: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Rimuovere l'etanolo con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non rimuovere le mosche.
   3. Conservare il campione nel tubo microcentrifuga da 1,5 mL con appena abbastanza etanolo al 100% per coprire il campione prima dell'essiccazione.

3. asciugatura

1. Eseguire l'essiccazione chimica utilizzando t-butil alcool (TBA)²⁷.
   1. Sostituire la soluzione di etanolo 100% con una soluzione di 1:1 di etanolo TBA e 100% per 20 min. sostituire la soluzione di 1:1 con TBA 100% per 20 min., ripetere due volte. Mantenere la soluzione a 37 ° C per non ricongelare TBA.
      Nota: 100% TBA ha un punto di congelamento di 25,5 ° C; non congelare la soluzione di 1:1 a temperatura ambiente. TBA è infiammabile, provoca grave irritazione oculare, è nocivo se inalato e può provocare irritazione delle vie respiratorie, sonnolenza o vertigini. TBA deve essere gestita in una cappa chimica mediante appropriati dispositivi di protezione individuale, compresi guanti, camice e occhiali protettivi.
   2. Trasferire il campione in TBA, se in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, in un piatto di pesatura di alluminio usa e getta. Una volta sul piatto di pesatura in alluminio TBA di rimuovere e sostituire con appena abbastanza fresco 100% TBA per coprire il campione. Congelare il TBA a 4 ° C per 10 min.
   3. Trasferire in un essiccatore sotto vuoto (campana) con confezioni di gel congelato per mantenere TBA congelato. Evacuare e mantenere il vuoto con una pompa rotativa a lasciare il campione a secco di sublimazione sottovuoto il TBA congelato per almeno 3 ore o durante la notte.
2. Eseguire l'essiccazione chimica utilizzando esametildisilazano (HMDS)²⁰.
   1. Sostituire la soluzione di etanolo 100% con una soluzione di 1:2 di HMDS ed etanolo al 100% per 20 min. sostituire la soluzione di 1:2 con una soluzione di 2:1 di HMDS ed etanolo al 100% per 20 min. 2:1 soluzione con 100% HMDS per 20 min. Ripetere un' volta.
      Nota: HMDS è infiammabile e una tossina acuta (via cutanea). HMDS deve essere gestita in una cappa chimica mediante appropriati dispositivi di protezione individuale, compresi guanti, camice e occhiali protettivi.
   2. Trasferire il campione in HMDS, se in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, in un piatto di pesatura di alluminio usa e getta. Una volta in alluminio peso piatto, sostituire il 100% HMDS con appena abbastanza fresco 100% HMDS per coprire il campione.
   3. Trasferire il campione nell'essiccatore non-vuoto di plastica o vetro con essiccante fresco (5-6 cm di profondità) e inserire in una cappa chimica. In alternativa, è possibile posizionare il campione direttamente in una cappa chimica a secco con un coperchio, ad esempio una casella, per evitare che i detriti cadano sul campione. Lasciare asciugare per 12-24 h il campione.

4. montaggio

1. Montare i cianobatteri ed euglene.
   1. Etichettare il fondo sia un alluminio di 12 o 25 mm montaggio albero mozzo per indicare ciò che è stato posto sulla parte superiore. Il filtro in policarbonato con le cellule secche tagliate a quarti con una lama di rasoio pulito o bisturi se utilizza uno stub di 12 mm, o posizionare l'intero filtro se si utilizza uno stub di 25 mm.
   2. Posizionare ogni filtro adesivo o una scheda adesiva carbonio fissata alla parte superiore di uno stub.
2. Montare Drosophila melanogaster (moscerino della frutta).
   1. Etichetta fondo lo stub di montaggio in alluminio per indicare ciò che è stato posto sulla parte superiore.
      Posizionare le mosche secche nella posizione desiderata nella scheda adesiva adesivo o carbonio fissata alla parte superiore di uno stub sotto un microscopio per dissezione con pinzette di precisione.
   2. Applicare l'adesivo conduttivo argento, cioè, argento vernice, intorno ai bordi esterni degli stub. Collegare la vernice d'argento per le mosche con uno stuzzicadenti per garantire la conducibilità. Non consentire la vernice di toccare l'area di imaging desiderato.
   3. Posizionare gli stub in una scatola di supporto albero mozzo e posizionare la casella di titolare stub aperto in un essiccatore. Consentire la vernice argento asciugare almeno 3 ore o durante la notte per ottenere i migliori risultati.

5. ricopertura

1. Preparare l'apparato di rivestimento di polverizzazione eseguendo quattro o cinque vampate di gas argon. Se l'umidità è alta (cioè, l'aria della stanza si sente umida, di solito circa 50% di umidità relativa), eseguire vampate di sei o sette. Polverizzi ricoprire gli stub seguendo le istruzioni del produttore.
2. I campioni di cappotto basati sull'esemplare utilizzato:
   1. Per i filtri con i cianobatteri, impostare il timer per sputter cappotto per 180 s dritto su.
   2. Per i filtri con alghe eucariote, cioè, euglene, impostare il timer per sputter cappotto per 120 s dritto su, quindi 20 s su tre lati ad un angolo di 45 °.
   3. Per campioni di grandi dimensioni, ossia, volare teste, impostare il timer per sputter cappotto per 60 s dritto, poi 30 s su ogni lato ad un angolo di 45 °.
      Nota: Dopo che il rivestimento è completo, Stub deve essere grigio chiaro a colori.

6. imaging

1. Esempi di immagine utilizzando un microscopio elettronico a scansione che include un rivelatore elettronico secondario (SE).
   1. Per i cianobatteri, applicare le seguenti impostazioni: 3-5 kV tensione di acceleratore (AC), 20-30 sonda corrente (PC) e 5 mm di distanza di lavoro (WD). Per euglene, utilizzare 3 kV AC, 30 PC e 5mm WD. Per le mosche, utilizzare 5 kV AC, 30 PC e 5 a 10 mm WD.
2. Regolare l'ingrandimento a seconda delle dimensioni del dettaglio o oggetto da visualizzare. Regolare il stigmators, diaframmi e messa a fuoco fino a produrre un'immagine chiara. Acquisire l'immagine utilizzando le impostazioni ad alta risoluzione secondo le istruzioni del produttore di SEM.

Risultati

I cianobatteri sono un procariotico gruppo di organismi che sono fondamentali per il globale del carbonio, ossigeno e azoto cicli^28,29. Di circa 6000 specie di cianobatteri³⁰, la maggior parte hanno una guaina mucillaginosa che coprono e collegare insieme le cellule e ad altre strutture³¹, che, insieme con la forma, può essere risolto microscopicamente³². Dim...

Discussione

Qui abbiamo descritto un protocollo utilizzando SEM per ottenere informazioni dettagliate sulle caratteristiche morfologiche esterne di tre tipi di organismi che gli altri possono applicare per esaminare le caratteristiche di molti tipi di organismi o tessuti. All'interno di ogni passaggio del protocollo, ci sono potenziali punti di errore che possono verificarsi e sono discussi in dettaglio di seguito.

Mentre i volumi per il fissativo e lavaggi dati qui sono specifici, in generale il fissativ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
gold–palladium	Ted Pella, Inc.	91212
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black	Sigma	WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110606
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
F/2 media	Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin	https://utex.org/products/f_2-medium	No Catalog number given - see link
AF6 media	Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota	https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf	No Catalog number given - see link
Soil water medium	Carolina Biological Supply Company	153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4	No Catalog number given - see link
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE	The company doesn't appear to sell this model any longer