Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
SEM analiz tür kimlik ya da fenotipik ayrımcılık yardım etmek için etkili bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı organizmalar üç temsilcisi tür özel morfolojik detayları inceleyerek yöntemlerini açıklar ve birçok organizma özelliklerinin incelenmesi için genel olarak geçerli olacaktır ve doku türleri.
Elektron mikroskobu (SEM) tarama biyolojik örnekler bireysel proteinler hücre, doku, organelleri ve hatta bütün organizmalar için arasında değişen çalışma uygulanan yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu protokol iki kimyasal kurutma yöntemi, hexamethyldisilazane (HMDS) ve t-butil alkol (TBA) ve görüntüleme için uygulama prokaryotik ve ökaryotik organizmaların SEM kullanarak odaklanmaktadır Bu makalede, biz tamir, yıkama, kurutmak, Kuru, mount, ceket şaplatın ve organizmalar üç tür görüntü açıklanmıştır: Siyanobakteriler (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. ve bilinmeyen bir sp.), cins Monomorphina gelen iki euglenoids (M. aenigmatica ve M. pseudopyrum) ve meyve sineği (Drosophila melanogaster). Bu iletişim kuralının amacını yapısı, boyut ve geniş organizmalar için geniş bir ürün yelpazesi uygulanabilir örneklerin yüzey özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için hızlı, ucuz ve basit bir yöntem tarif etmektir morfolojik değerlendirme. Bu iletişim kuralı başarıyla tamamlanması diğerleri sistemlerine bu teknikleri uygulayarak örnekleri görselleştirmek için SEM kullanmak izin verir.
Taramalı elektron mikroskobu (SEM) yüksek enerjili elektronların odaklanmış ışın demeti ikincil elektron Morfoloji ve örnek1topografya gösteren bir görüntü oluşturmak için kullanır. SEM doğrudan bir örnek, yüzey yapısı ve üç boyutlu şekil ve teklifler daha fazla çözünürlüğünü fiziksel boyutunu ve daha büyük ışık mikroskobu ile karşılaştırıldığında alan derinliğini belirlemek için kullanılabilir. Elektron mikroskobu (EM) başka bir formu, iç yapısının ince detayları ile görüntüleri oluşturma örneği üzerinden geçmek odaklı elektron transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanır. TEM ışık veya SEM daha daha yüksek çözünürlüğe sahip ve yapıları tek atomları küçük çözümlemek için kullanılan iken, üç önemli dezavantajları vardır: geniş numune hazırlama, küçük bir görüş alanı ve sığ derinliği alanı2,3. Diğer görüntülenir, ancak belirli hücreleri, organelleri veya doku4,5,6,7,8,9, incelemek için SEM kullanarak protokoller bulunmaktadır 10 , biz geniş organizmalar morfolojik değerlendirmesi için geniş bir ürün yelpazesi uygulanabilir yöntemleri tarif bu protokolü benzersizdir.
SEM nano tanecikleri11,12, polimerler13ve çok sayıda uygulama jeolojik, endüstriyel ve Malzeme Bilimleri14' te, gibi inorganik maddeler incelenmesi için geniş uygulamalar buldu 15,16. Biyolojide, SEM uzun bireysel proteinler bütün organizmalar17,-18arasında değişen biyolojik örnekleri inceleyerek bir yöntem olarak kullanılmıştır. Morfolojik yüzey detayları bilimsel keşif bilgilendirmek için kullanılabilir çünkü SEM belirli değeri var. SEM çözümleme yapısı, boyut ve biyolojik örnekleri geniş bir yüzey özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için hızlı, ucuz ve basit bir yöntemdir.
Bir SEM normalde tutarlı bir yüksek hızlı elektron huzmesi desteklemek için yüksek vakum altında (10-6 Torr en az) çalıştığından, hiçbir sıvı (su, yağlar, alkoller) gibi sıvılar bir vakum önleyebilirsiniz örnek odasında izin verilir. Böylece, tüm örnekleri SEM kullanarak muayene, genellikle etanol kaldırmak için bir kurutma işlemi tarafından izlenen bir kademeli etanol serisi kullanan susuz gerekir. Biyolojik dokuların kullanılmak üzere hava kurutma, lyophilization, kritik nokta kurutma (GBM) aygıt veya t-butil alkol (TBA) veya hexamethyldisilazane (HMDS)19, kullanarak kurutma kimyasal kullanımı da dahil olmak üzere SEM, kurutma birkaç yöntem vardır 20 , 21 , 22. biyolojik her örnek farklı kurutma her yönteme tepki bu yana çoğu zaman, bir kurutma yöntemi ampirik seçimdir. Avantajları ve dezavantajları karşılaştırarak uygun yöntem seçiminde yararlı bu yüzden herhangi bir verilen örnek için tüm bu yöntemlerin uygun olabilir.
Oda sıcaklığında veya kurutma fırın (60 ° C) bir örnek kurutma hava en basit yöntem olmakla birlikte, çoğu biyolojik örnekler kuruyup gibi kurutma-indüklenen zarar göster ve daraltmak, numune bozulma sonucu. Lyophilization süreci aynı zamanda su (veya buz) bir örnek kaldırır ama flaş dondurulmuş olmak örnekleri gerektirir ve vakum altında buz üzerinden kaldırmak için örnek zararlı süblimasyon, işlemi yerleştirilen. Buna ek olarak, Kullanıcı bir lyophilizer erişimi olmalıdır. Örnekleri SEM için dehydrating en sık kullanılan kritik noktası (GBM) kurutma yöntemidir. CPD içinde örnek bir etanol ile sıvı karbondioksit (CO2) ve belirli sıcaklık ve basınç koşulları kritik nokta (31,1 ° C ve 1,073 psi), CO2 yüzey gerilimi, böylece oluşturmadan buharlaştırır olarak bilinen altında değiştirilir etkili bir şekilde örnek morfolojik ve yapısal özelliklerini koruyarak. CPD genellikle standart yöntem olmakla birlikte, birçok sakıncaları vardır. İlk olarak, süreci önemli olan sadece pahalı değil ama aynı zamanda sıvı karbondioksit kullanımı gerektirir noktası kurutma makinesi, erişim gerektirir. İkinci olarak, kurutulmuş örnek boyutu kurutma makinesi kritik nokta Oda boyutu sınırlıdır. Üçüncü olarak, CPD sırasında sıvı alışverişi örnek zarar verebilir türbülans neden olabilir.
Kimyasal kurutma CPD birçok avantaj sunar ve yaygın SEM örnek hazırlanmasında kullanılır hale uygun bir alternatif olarak hizmet vermektedir. TBA ve HMDS gibi kimyasal dehydrants kullanımı hala örnek yapısal bütünlüğünü koruyarak diğer yöntemleri için hızlı, ucuz ve basit bir alternatif sunmaktadır. Biz son zamanlarda doku veya CPD veya TBA yetişkin Drosophila Retina doku23yılında kurutma yöntemi olarak kullanırken yakalanan son görüntü kalitesini bütünlüğünü hiçbir fark olduğunu gösterdi. CPD, aksine TBA ve HMDS kurutma bir enstrüman veya sıvı CO2 gerekmez ve kurutulmuş için örnek boyutu sınır yoktur. Kimyasallar alma ek olarak, yalnızca standart kimyasal duman hood ve uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, önlük ve koruyucu gözlük) kurutma işlemi tamamlamak için gereklidir. TBA ve HMDS yanıcı olmakla birlikte, daha ucuz ve daha az toksik TBA (yaklaşık 1/3 HMDS maliyetini) HMDS daha.
Bu makalede, biz tamir, yıkama, kurutmak, Kuru, mount, ceket şaplatın ve organizmalar üç tür görüntü açıklanmıştır: Siyanobakteriler (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. ve bilinmeyen bir sp.), cins Monomorphina gelen iki euglenoids (M. aenigmatica ve M. pseudopyrum) ve meyve sineği (Drosophila melanogaster). Bu organizmaların boyutu (4 mm için 0.5 µm) ve hücresel çeşitlilik (tek için çok hücreli hücreli) geniş bir temsil, henüz tüm numune hazırlama için gerekli sadece küçük farklılıklar nedeniyle kolayca SEM analiz için mükellef bulunmaktadır. Bu iletişim kuralı organizmalar üç tür morfolojik ayrıntıları incelemek için kimyasal su kaybı ve SEM çözümlemesi kullanarak yöntemlerini açıklar ve birçok organizma incelenmesi için genel olarak geçerli olacaktır ve doku türleri.
1. hazırlık ve fiksasyon
2. yıkama ve susuzlaştırma
3. kurutma
4. montaj
5. sputter kaplama
6. görüntüleme
Siyanobakteriler küresel karbon, oksijen ve azot döngüsü28,29kritik organizmaların prokaryotik bir grubuz. Siyanobakteriler30yaklaşık 6000 tür, en kapak ve hücreleri birbirine bağlamak mukoza bir kılıf var ve diğer yapılar için olabilen şekliyle birlikte31, mikroskobik32çözüldü. Hücre boyutu, şekli ve pigmentler mevcut bireysel tür ayır...
Burada biz SEM diğer birçok türde organizmalar veya doku özelliklerini incelemek için uygulayabileceğiniz organizmalar üç tür dış morfolojik özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için bir iletişim kuralı'nı nitelendirdi. Her adımda Protokolü'nün, noktalarıdır potansiyel hata ortaya çıkabilir ve aşağıda ayrıntılarıyla ele alınmıştır.
Genel olarak bu birim için sabitleştirici ve burada verilen yıkar belirli olmakla birlikte, sabitleştirici ve yıka...
Yazarlar ifşa gerek yok.
Bu eser MLS ve bir yaz bilim adamı Ödülü için bir hibe MAK için Office araştırma ve Central Michigan Üniversitesi'nde yüksek lisans çalışmaları finanse edildi. Siyanobakteriler kıyı çalışmaları, Texas A & M Üniversitesi'nde Corpus Christi için Zimba ve plankton lab, merkezi parçası tarafından temin edildi. Euglenoids Triemer lab, Michigan State University tarafından temin edildi.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given - see link |
AF6 media | Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given - see link |
Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given - see link |
Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE | The company doesn't appear to sell this model any longer |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır