Preparación de los organismos procarióticos y eucarióticos con secado químico para análisis morfológico en microscopía electrónica de barrido (SEM)

Resumen

Análisis de SEM es un método eficaz para ayudar en la identificación de las especies o la discriminación fenotípica. Este protocolo describe los métodos para examinar los detalles morfológicos específicos de tres tipos representativos de organismos y sería ampliamente aplicable a examinar características de muchos organismos y tipos de tejidos.

Resumen

Microscopía electrónica de barrido (SEM) es una técnica ampliamente disponible que se ha aplicado para estudiar a especímenes biológicos que van desde proteínas individuales a las células, tejidos, organelos y organismos incluso todo. Este protocolo se centra en dos métodos de secado químicos, hexamethyldisilazane (HMDS) y el alcohol t-butílico (TBA) y su aplicación a la proyección de imagen de organismos procarióticos y eucarióticos con SEM. En este artículo describimos cómo fijar, lavar, deshidratar, secar, montar, sputter coat y imagen tres tipos de organismos: cianobacterias (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. y un desconocido SP.), dos euglenoides del género Monomorphina (M. Enigmonia y M. pseudopyrum) y la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster). El propósito de este protocolo es describir un método rápido, barato y simple para obtener información detallada sobre la estructura, tamaño y características de la superficie de las muestras que pueden aplicarse ampliamente a una amplia gama de organismos para morfológico evaluación. Culminación exitosa de este protocolo permitirá a otros utilizar SEM para visualizar muestras aplicando estas técnicas a su sistema.

Introducción

Un microscopio electrónico de barrido (MEB) utiliza un haz enfocado de electrones de alta energía para generar una imagen de electrones secundarios que muestra la morfología y la topografía de una muestra de¹. SEM puede utilizarse para determinar directamente el tamaño físico de una muestra, la estructura superficial y la forma tridimensional y ofrece una mayor resolución y mayor profundidad de campo en comparación con microscopia ligera. Otra forma de microscopia electrónica (EM), microscopía electrónica de transmisión (TEM) utiliza electrones enfocados que pasan a través de la muestra, generando imágenes con los detalles finos de la estructura interna. Mientras que TEM tiene mayor resolución que la luz o SEM y puede utilizarse para resolver estructuras tan pequeñas como átomos individuales, tiene tres inconvenientes principales: preparación de la muestra amplia, un pequeño campo de visión y poca profundidad de campo^2,3. Aunque otros visualizar protocolos existen uso de SEM para examinar determinados tejidos, células y organelos^{4,5,6,7,8,9, 10} , este protocolo es el único que se describen métodos que pueden aplicarse ampliamente a una amplia gama de organismos para la evaluación morfológica.

SEM ha encontrado aplicaciones amplios para examinar materiales inorgánicos incluyendo nanopartículas^11,12, polímeros¹³y numerosas aplicaciones en ciencias geológicas, industrial y material^{14, 15,16}. En biología, SEM ha sido utilizado como un método para examinar muestras biológicas que van desde proteínas individuales a todo organismos^17,18. SEM es de valor especial porque detalles morfológicos superficiales pueden utilizarse para informar el descubrimiento científico. Análisis de SEM es un método rápido, barato y simple para obtener información detallada sobre la estructura, tamaño y características de la superficie de una amplia gama de muestras biológicas.

Porque un SEM opera normalmente bajo alto vacío (10^-6 Torr mínimo) para apoyar un haz coherente de electrones de alta velocidad, no líquidos (agua, aceites, alcoholes) son permitidos en la cámara de muestras, como líquidos evitar un vacío de formación. Así, todas las muestras examinadas usando SEM deben estar deshidratadas, por lo general mediante una serie gradual de etanol seguida de un proceso de secado para eliminar el etanol. Existen varios métodos de secado de tejidos biológicos para su uso en el SEM, incluyendo el secado, liofilización, uso de un dispositivo de (CPD) secado de punto crítico, o producto químico de secado utilizando el alcohol t-butílico (TBA) o hexamethyldisilazane (HMDS)^{19, 20 , 21 , 22}. con mucha frecuencia, selección de un método de secado es empírica, ya que cada muestra biológica puede reaccionar diferentemente a cada método de secado. Cualquier muestra dada, todos estos métodos pueden estar apropiados, comparar las ventajas y desventajas de cada uno es útil seleccionar el método apropiado.

Mientras que el aire de secado de una muestra a temperatura ambiente o en un horno de secado (60 ° C) es el método más simple, más muestras biológicas muestran daños de sequía-inducida como arrugamiento y colapsan, dando por resultado la distorsión de la muestra. El proceso de liofilización también quita el agua (o hielo) de una muestra, pero requiere muestras ser flash-congeladas y colocado bajo vacío para quitar el hielo mediante el proceso de sublimación, potencialmente dañar la muestra. Además, el usuario debe tener acceso a un liofilizador. El método más comúnmente utilizado para deshidratar muestras para SEM es punto crítico de secado (CPD). En CPD, se sustituye el etanol en una muestra de líquido dióxido de carbono (CO₂) y, bajo condiciones de presión conocidas como el punto crítico (31,1 º C y psi 1.073), CO₂ se vaporiza sin crear tensión superficial, de tal modo y temperatura específica efectivamente manteniendo las características morfológicas y estructurales de la muestra. Mientras que el CPD es generalmente el método estándar, tiene varios inconvenientes. En primer lugar, el proceso requiere el acceso a un secador de punto crítico que no sólo es caro, pero también requiere el uso de dióxido de carbono líquido. En segundo lugar, el tamaño de la muestra que puede ser secado se limita al tamaño de la cámara del secador de punto crítico. En tercer lugar, el intercambio de líquidos en CPD puede causar turbulencia que puede dañar la muestra.

Secado químico ofrece muchas ventajas sobre CPD y sirve como una alternativa conveniente que es ser ampliamente utilizada en la preparación de muestras SEM. El uso de químicos dehydrants TBA como HMDS ofrece una alternativa rápida, barata y sencilla que otros métodos, mientras que mantiene la integridad estructural de la muestra. Recientemente demostró que no hubo diferencias en la integridad de los tejidos o la calidad de la imagen final cuando utilizando CPD o TBA como el método de secado en el adulto Drosophila tejido retiniano²³. A diferencia de CPD, TBA y HMDS no requieren de un secado de la instrumento o líquido CO₂ y no hay ninguna limitación en el tamaño de la muestra a secar. Además de los productos químicos, sólo una campana química estándar y equipos de protección personal (guantes, bata y gafas de seguridad) deben completar el proceso de secado. Mientras tanto TBA como HMDS son inflamables, TBA es menos tóxicos y menos costosos (aproximadamente 1/3 el costo de HMDS) de HMDS.

En este artículo describimos cómo fijar, lavar, deshidratar, secar, montar, sputter coat y imagen tres tipos de organismos: cianobacterias (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. y un desconocido SP.), dos euglenoides del género Monomorphina (M. Enigmonia y M. pseudopyrum) y la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster). Estos organismos representan una amplia gama en tamaño (0,5 μm a 4 mm) y la diversidad celular (unicelular a multicelular), sin embargo, todos son fácilmente susceptibles de análisis SEM con sólo pequeñas variaciones es necesarias para la preparación de las muestras. Este protocolo describe los métodos para el uso de deshidratación química y el análisis de SEM para examinar detalles morfológicos de tres tipos de organismos y sería ampliamente aplicable al examen de muchos organismos y tipos de tejidos.

Protocolo

1. preparación y fijación

1. Preparación de cianobacterias.
   1. Crecen cultivos axénicos en F/2 medios^24,25 a una temperatura de 28 ° C en un 14:10 h luz ciclo oscuro. Transferencia de cultura suficiente a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que después de permitir que 15 min resolver, el pellet bacteriano es aproximadamente 0,05 mL en tamaño. Quitar los medios de comunicación y reemplazar con 1,5 mL de fijador (glutaraldehído 1.25%, tampón de fosfato 0,1 M pH 7.0), suavemente invertir varias veces e incubar durante una noche a 4 ° C.
   2. La transferencia de las células fijas con una pipeta de vidrio en una plataforma de filtración de 10 mL (figura 1) que contiene un filtro de 25 mm de policarbonato 0,8 o 0,2 μm de poro, dependiendo del tamaño de las células. El brazo lateral del sello y embudo con tapones de goma para contener la cultura en el embudo. Retirar el fijador suave vacío en el matraz de filtración, después de quitar ambos tapones.
      Nota: Si la densidad celular en el filtro de policarbonato no es óptima, ajuste la cantidad de a partir de cultivo utilizado.
2. Preparar las algas unicelulares (euglenoides).
   1. Crecen cultivos axénicos en AF-6 medios de comunicación²⁶ con 150 mL L^-1 de medio agua del suelo disponible a los medios de comunicación, a una temperatura de 22 ° C en un 14:10 h luz ciclo oscuro. Transferir 2 mL de baja densidad (OD₆₀₀ < 0.5) cultura con una pipeta de vidrio en una plataforma de filtración de 10 mL (figura 1) que contiene un filtro de 25 mm de policarbonato con poros μm 8. El brazo lateral del sello y embudo con tapones de goma para contener la cultura en el embudo.
      Nota: Si la densidad celular en el filtro de policarbonato no es óptima, ajuste la cantidad de a partir de cultivo utilizado.
   2. Añadir tres gotas 4% de tetróxido de osmio (OsO₄) directamente a la cultura y dejar para incubar por 30 minutos retirar el fijador suave vacío en el matraz de filtración, después de quitar ambos tapones.
      Nota: OsO₄ es una toxina aguda (dérmica, oral e inhalación rutas), corrosivo a la piel, daño a los ojos y un sensibilizador respiratorio. OsO₄ debe manejarse en una campana de vapores químicos con equipos de protección personal como guantes, bata y protección ocular.
3. Preparación de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta)²³.
   1. Anestesiar a moscas adultas usando dióxido de carbono 100%. Lugar anestesiado adultos (10 a 30 moscas) en un tubo de centrífuga tapón plástico pequeño frasco o 1,5 mL.
   2. Sumerja moscas anestesiados en 1 mL de fijador (glutaraldehído 1.25%, tampón de fosfato 0,1 M pH 7.2) para 2 h (o noche) a 4 ° C. Si las moscas flotan hacia la superficie de este fijador, añadir unas gotas de éter de tert-Octylpheny 2.5% polietilenglicol para debilitar la tensión superficial del fijador que permite la inmersión total del tejido. Eliminar el fijador mediante una pipeta de vidrio.

2. lavado y deshidratación

1. Lavar y deshidratar cianobacterias.
   1. Lavar la muestra fija tres veces con 5 mL de tampón de fosfato 0,1 M pH 7.0 a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno. Mantener el matraz y embudo de cierre hermético para contener el lavado. Quitar cada colada por vacío suave en el matraz de filtración, después de quitar ambos tapones.
   2. Deshidratar la muestra manteniendo la inmersión continua mediante una serie gradual de etanol, durante 10 minutos en un volumen de 5 mL en el embudo. Las concentraciones de etanol graduado son: 25%, 50%, 75%, 95% y 2 cambios de etanol 100%. Mantener el matraz y embudo de cierre hermético para contener el etanol en el embudo, evitando así pérdidas de ambos a través de evaporación y el flujo de pasivo a través del filtro.
   3. Retire el etanol por suave vacío en el matraz de filtración, después de quitar ambos tapones. Transferir la muestra de filtro a un desechable de aluminio peso plato que contiene suficiente etanol 100% para cubrir la muestra antes del secado.
2. Lavar y deshidratar algas unicelulares (euglenoides).
   1. Lavar la muestra fija tres veces con 5 mL de agua desionizada a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno. Mantener el matraz y embudo de cierre hermético para contener el lavado en el embudo. Quitar cada colada por vacío suave en el matraz de filtración, después de quitar ambos tapones.
   2. Deshidratar la muestra manteniendo la inmersión continua mediante una serie gradual de etanol durante 10 minutos en un volumen de 5 mL en el embudo. Las concentraciones de etanol graduado son: 25%, 50%, 75%, 95% y 2 cambios de etanol 100%. Mantener el matraz y embudo de cierre hermético para contener el etanol en el embudo, evitando así pérdidas de ambos a través de evaporación y el flujo de pasivo a través del filtro.
   3. Eliminar el etanol por suave vacío en el matraz de filtración, después de quitar ambos tapones. Transferir la muestra de filtro a un desechable de aluminio peso plato que contiene suficiente etanol 100% para cubrir la muestra antes del secado.
3. Limpiar y deshidratar la Drosophila melanogaster (mosca de la fruta).
   1. Lavar la muestra fija tres veces con 1 mL de tampón de fosfato 0,1 M pH 7.2 a temperatura ambiente durante 10 min en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Quitar cada colada con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no eliminar las moscas.
   2. Deshidratar la muestra mediante una serie gradual de etanol, durante 10 minutos en un volumen de 1 mL en un tubo de microcentrífuga. Las concentraciones de etanol son: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Eliminar el etanol con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no eliminar las moscas.
   3. Retener la muestra en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con suficiente etanol 100% para cubrir la muestra antes del secado.

3. secado

1. Realizar secado químico usando t-butil alcohol (TBA)²⁷.
   1. Reemplazar la solución de etanol 100% con una solución de 1:1 de TBA y el 100% de etanol para reemplazar la solución de 1:1 con 100% de TBA durante 20 min repetir dos veces de 20 minutos. Mantener la solución a 37 ° C para que TBA no se congela.
      Nota: 100% TBA tiene un punto de congelación de 25,5 ° C; la solución 1:1 no se congele a temperatura ambiente. TBA es inflamable, causa irritación grave en los ojos, es dañino si se inhala y puede causar irritación respiratoria, somnolencia o mareos. TBA debe manejarse en una campana de vapores químicos con equipos de protección personal como guantes, bata y protección ocular.
   2. Transferir la muestra en TBA, en caso de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, en un plato de pesaje de aluminio desechable. Una vez en el plato pesada de aluminio, quitar TBA y reemplace con suficiente TBA 100% fresca para cubrir la muestra. Congelar la TBA a 4 ° C durante 10 minutos.
   3. Transferir a un desecador de vacío (campana) con paquetes de gel congelado para mantener congelado de TBA. Evacuar y mantener el vacío con una bomba rotatoria de la muestra seca por vacío de la sublimación de la TBA congeladora durante al menos 3 horas o toda la noche.
2. Realizar secado químico utilizando hexamethyldisilazane (HMDS)²⁰.
   1. Reemplazar la solución de etanol 100% con una solución de 1:2 de HMDS y etanol al 100% durante 20 min reemplazar la solución de 1:2 con una solución de 2:1 de HMDS y etanol al 100% durante 20 min reemplazar el 2:1 solución con 100% HMDS durante 20 min repetir una vez.
      Nota: HMDS es inflamable y una toxina aguda (vía dérmica). HMDS debe manejarse en una campana de vapores químicos con equipos de protección personal como guantes, bata y protección ocular.
   2. Transferir la muestra en HMDS, si en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, en un plato de pesaje de aluminio desechable. Una vez en el aluminio pesa el plato, reemplazar el 100% HMDS con suficiente fresco 100% HMDS para cubrir la muestra.
   3. Transferir la muestra en un desecador de vacío no de plástico o vidrio con desecante fresco (5-6 cm de profundidad) y coloque en una campana de humos químicos. Como alternativa, colocar la muestra directamente en una campana de vapores químicos para secar con una tapa suelta, como una caja, para evitar que los residuos caigan en la muestra. Permita que la muestra a secar durante 12 a 24 h.

4. montaje

1. Montaje de cianobacterias y euglenoides.
   1. La parte inferior de cualquiera de los dos un aluminio de 12 o 25 mm montaje trozo para indicar lo que se ha puesto en la parte superior de la etiqueta. Corte el filtro de policarbonato con celdas secas en cuartos con una limpia hoja de afeitar o bisturí si usando un trozo de 12 mm, o colocar el filtro entero si se utiliza un trozo de 25 mm.
   2. Coloque cada filtro adhesivo o una ficha adhesivo de carbono fijado a la parte superior de un trozo.
2. Montaje de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta).
   1. La parte inferior del trozo de montaje de aluminio para indicar lo que se ha puesto en la parte superior de la etiqueta.
      Colocar las moscas secas en la posición deseada en la ficha adhesivo adhesivo o carbono fijado a la parte superior de un trozo con un microscopio de disección con pinzas de precisión.
   2. Aplique plata adhesivo conductivo, es decir, plata pintura, alrededor de los bordes de los talones. Conecte la pintura plata a las moscas con un palillo de dientes para asegurar la conductividad. No permita que toque el área deseada de la imagen de la pintura.
   3. Coloque los talones en una caja de soporte de talón y colocar el trozo abierto titular en un desecador. Deje que la pintura plata secar al menos 3 horas o toda la noche para obtener mejores resultados.

5. Farfullar revestimiento

1. Preparar el aparato de recubrimiento sputter realizando cuatro o cinco brotes de gas argón. Si la humedad es alta (es decir, el aire se siente húmedo, generalmente cerca de 50% de humedad relativa), realizar descargas de seis a siete. Farfulle la capa los talones siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Muestras de la capa basadas en espécimen utilizan:
   1. Para los filtros con cianobacterias, ajuste el temporizador a farfulle la capa para el recta s 180 en.
   2. Para los filtros con las algas eucariotas, es decir, euglenoides, ajustar el temporizador para sputter coat para 120 s s recta en, y luego 20 por tres lados en un ángulo de 45 °.
   3. Para muestras grandes, es decir, cabezas de mosca, ajustar el temporizador para sputter coat para 60 s s recta en, y luego 30 en cada lado en un ángulo de 45 °.
      Nota: Después de la capa es completa, talones deben ser color gris claro en color.

6. proyección de imagen de

1. Muestras de la imagen usando un microscopio electrónico de barrido incluye un detector de electrones secundarios (SE).
   1. Para cianobacterias, aplique los siguientes valores: tensión de acelerador de 3-5 kV (AC), sonda de corriente (PC) de 20-30 y 5 mm la distancia de trabajo (WD). Euglenoides, utilice 3 kV en corriente alterna, 30 PC y 5 mm WD. Para moscas, use 5 kV en corriente alterna, 30 PC y 5 a 10 mm WD.
2. Ajustar magnificación dependiendo del tamaño del detalle o del objeto a visualizar. Ajustar el enfoque, stigmators y aperturas hasta que se produce una imagen clara. Capturar la imagen con alta resolución ajustes según las instrucciones del fabricante de la SEM.

Resultados

Cianobacterias son un grupo de procariota de organismos que son críticos para el carbono, el oxígeno y el nitrógeno ciclos^28,29. De las aproximadamente 6000 especies de cianobacterias³⁰, más tienen una envoltura mucilaginosa que recorren y conectan las células entre sí y a otras estructuras³¹, que junto con la forma, puede ser resuelto microscópico³². T...

Discusión

Aquí hemos descrito un protocolo de uso de SEM para obtener información detallada sobre las características morfológicas externas de los tres tipos de organismos que otros pueden aplicar para examinar características de muchos tipos de organismos o tejidos. Dentro de cada paso del Protocolo, hay posibles puntos de error que pueden surgir y se discuten en detalle más adelante.

Mientras que los volúmenes de fijador y lavado dado aquí son específicos, en general el fijador y lavado debe ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
gold–palladium	Ted Pella, Inc.	91212
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black	Sigma	WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110606
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
F/2 media	Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin	https://utex.org/products/f_2-medium	No Catalog number given - see link
AF6 media	Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota	https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf	No Catalog number given - see link
Soil water medium	Carolina Biological Supply Company	153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4	No Catalog number given - see link
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE	The company doesn't appear to sell this model any longer