原核生物と真核生物の化学形態分析走査電子顕微鏡 (SEM) での乾燥の準備

要約

SEM 解析、種の同定や表現型差別を支援する効果的な方法です。このプロトコルは 3 つの代表的なタイプの菌の形態学的詳細を調べる方法について説明し、多くの個体の特徴を調べることに広く適用されると組織型。

要約

走査電子顕微鏡 (SEM) は、個々 のタンパク質から細胞、組織、器官、でも全体の有機体に至るまでの生物的標本を研究に適用されている広く利用可能な技術です。このプロトコルが SEM. を用いた原核生物と真核生物のイメージングへの応用と t-ブチル アルコール (TBA) ヘキサメチルジシラザン (HMDS) 2 つの化学的乾燥方法に焦点を当ててください。この記事で述べる修正、洗浄、脱水、乾燥、マウント、スパッタ コート、およびイメージの 3 つのタイプの菌する方法: シアノ バクテリア (Toxifilum mysidocida、 Golenkina sp、不明な sp)、2 つの euglenoids 属Monomorphina から(M. aenigmatica と m. pseudopyrum) とフルーツ フライ (ショウジョウバエ)。このプロトコルの目的は、高速、安価で、シンプルな構造、サイズ、および有機体のための大規模な範囲に広く適用できる標本の表面特性について詳細な情報を取得するメソッドを記述する形態評価。このプロトコルを正常に完了は、他の SEM を使用して彼らのシステムにこれらの技術を適用することによってサンプルを視覚化することができます。

概要

走査型電子顕微鏡 (SEM) は、サンプル¹の地形と形態を示す二次電子から画像を生成するのに高エネルギー電子の集束ビームを使用します。SEM は、直接サンプル、提供のより高い解像度と表面構造三次元形状の物理サイズと光学顕微鏡と比較してフィールドの大きい深さを決定する使用できます。電子顕微鏡検査 (EM) の別のフォーム、透過型電子顕微鏡 (TEM) は、内部構造の細部のイメージを生成するサンプルを通過集中電子を使用します。TEM 光または SEM より高い解像度があり単一原子のような小さな構造を解決する使用ことができます、それは 3 つの主要な不利な点: 広範なサンプル準備、小さな視野とフィールド^2,3の浅い深さ。その他可視化プロトコルが SEM を使用して特定の細胞、細胞小器官や組織^4,5,6,7,8,9,を調べる存在する¹⁰ 、このプロトコルは、固有生物形態学的評価のための大規模な範囲に広く適用することができる方法について述べる。

SEM は、地質、産業、科学、材料^14,のナノ粒子^11,12, ポリマー¹³, と多数のアプリケーションを含む無機材料を検査するための広範なアプリケーションを発見した^15,16。生物学で、SEM は長い個々 の蛋白質から全体生物^17,18に至るまで生物学的サンプルを調べるための方法として使用されています。SEM は、科学的発見を知らせるため表面の形態学的詳細を使用できるため、特定の値が。SEM 解析は、構造、サイズ、および幅広い生体試料の表面特性について詳細な情報を取得する高速、安価で、簡単な方法です。

SEM は、一貫した高速電子ビームをサポートする高真空 (10^-6 Torr の最小) の下で通常動作するため液体 (水、油、アルコール) は許可されません試料室の真空が形成するを防ぐ液体として。したがって、SEM を用いてすべてのサンプルは、通常乾燥プロセスによって続く傾斜エタノール シリーズを使用したエタノールを削除、脱水される必要があります。乾燥空気乾燥、凍結乾燥、臨界点乾燥 (CPD) デバイス、または化学 t-ブチル アルコール (未定) またはヘキサメチルジシラザン (HMDS)^19、を使用して乾燥の使用など、SEM で使用するため生体組織のいくつかの方法があります。^20,21,22. 各生物学的サンプルが異なるそれぞれの乾燥方法に反応するのでほとんどの場合、乾燥方法の選択は経験的。任意の指定されたサンプルのすべてのこれらのメソッドがあります適切な長所とそれぞれの短所を比較することは適切な方法を選択する際に便利ですので。

部屋の温度や乾燥炉 (60 ° C) 試料の乾燥空気は、最も簡単な方法は、ほとんどの生物学的サンプル shriveling など乾燥によるダメージを表示する、折りたたむには、供試体の歪みの結果します。凍結乾燥のプロセスも水 (または氷)、サンプルから削除しますが、フラッシュ凍結サンプルを必要として有害なサンプル、昇華のプロセスを介して氷を削除する真空下に置かれます。さらに、ユーザーは、エアカーテンへのアクセスに必要です。SEM のためのサンプルをステータス退避に最も一般的に使用されるメソッドは、臨界点乾燥 (CPD) です。液体の二酸化炭素 (CO₂) と、特定の温度と臨界点 (31.1 ° C、1,073 psi) CO₂気化により表面張力を作成せずとして知られている圧力条件の下で、CPD のサンプルでエタノールが置き換えられますサンプルの形態や構造の特徴を効果的に維持します。CPD は、標準的な方法では一般的に、いくつかの欠点があります。最初に、プロセスでは、臨界点乾燥機は高価なだけでなく、また液体の二酸化炭素の使用が必要になりますへのアクセスが必要です。第二に、乾燥することができますサンプルのサイズは、臨界点乾燥機のチャンバー サイズに制限されます。第三に、CPD の中に液体の交換は、サンプルを傷つけることができる乱流を可能性があります。

化学乾燥 CPD に比べて多くの利点を提供しています、SEM 試料の普及に伴い、適切な代替として機能します。未定、HMD など化学の dehydrants の使用は、サンプルの構造の整合性を維持しながら他の方法を高速、安価で、シンプルな代替を提供しています。我々 は最近、組織または大人のショウジョウバエ網膜組織²³の乾燥方法として CPD または未定を使用する場合に、最終的な画像品質の整合性の違いがなかったことを示した。CPD とは異なり乾燥器や液体 CO₂未定と HMD は必要ありません、乾燥試料のサイズに制限はありません。化学物質を取得、に加えて標準の化学発煙のフードと適切な個人用保護具 (手袋、白衣、安全メガネ) だけは乾燥のプロセスを完了する必要があります。TBA は毒性の少ないより少なく高価な未定と HMD は可燃性ですが、(約 1/3 HMD のコスト) HMD より。

この記事で述べる修正、洗浄、脱水、乾燥、マウント、スパッタ コート、およびイメージの 3 つのタイプの菌する方法: シアノ バクテリア (Toxifilum mysidocida、 Golenkina sp、不明な sp)、2 つの euglenoids 属Monomorphina から(M. aenigmatica と m. pseudopyrum) とフルーツ フライ (ショウジョウバエ)。これらの生物は、サイズ (4 mm 0.5 μ m) と (単細胞多細胞に) 細胞の多様性の広い範囲を表すまだすべては、だけ小さな変化が切片作製に必要な SEM 解析へ簡単に従う義務があります。このプロトコルは 3 つのタイプの菌の形態学的詳細を調べます化学脱水と SEM 分析を使用する方法について説明し、多くの生物を調べることに広く適用されると組織型。

プロトコル

1. 準備と固定

1. シアノ バクテリアを準備します。
   1. 14:10 h に 28 ° C の温度で F/2 メディア^24,25 unialgal 文化を成長ライト暗い周期。後 15 分を解決するを許可すると、細菌のペレットがサイズで約 0.05 mL、1.5 mL 遠心チューブに十分な文化を転送します。メディアを取り出し、1.5 ml (1.25% グルタルアルデヒド、0.1 M のリン酸バッファー pH 7.0) は定着剤の交換、優しく数回を反転、4 ° C で一晩インキュベート
   2. セルのサイズによって、0.8 または 0.2 μ m 孔を持つポリカーボネートの 25 mm フィルターを含むガラス ピペット 10 mL ろ過装置 (図 1) に、固定セルを転送します。側の腕を密封し、ファンネルの文化を含むゴム製ス トッパーと漏斗します。両方のストッパーを削除した後穏やかな真空ろ過フラスコに定着剤を削除します。
      注: ポリカーボネート フィルターの細胞密度が最適でない場合使用されるカルチャを開始する量を調整します。
2. 単細胞藻類 (euglenoids) を準備します。
   1. AF 6 メディア²⁶ 14:10 h に 22 の ° C の温度で、メディアに追加市販土壌水分中の 150 mL L^-1 unialgal 文化を育てる光暗いサイクル。低密度の 2 mL を転送 (外径₆₀₀ < 0.5) ガラス製ピペット 10 mL ろ過装置 (図 1) に 8 μ m の細孔を有するポリカーボネートの 25 mm フィルターを含む文化。側の腕を密封し、ファンネルの文化を含むゴム製ス トッパーと漏斗します。
      注: ポリカーボネート フィルターの細胞密度が最適でない場合使用されるカルチャを開始する量を調整します。
   2. 文化に直接 4% 四酸化オスミウム (OsO₄) の 3 滴を追加し、インキュベート 30 分両方のストッパーを削除した後穏やかな真空ろ過フラスコに定着剤を削除することができます。
      注: OsO₄は急性の毒素 (皮膚、口腔と吸入ルート)、目および呼吸器感作性にダメージを与える、皮膚を腐食。OsO₄は、手袋、白衣、眼の保護など適切な個人用保護具を使用して化学の発煙のフード処理必要があります。
3. ショウジョウバエ(ミバエ)²³を準備します。
   1. 100% の二酸化炭素を使用して成虫を麻酔します。場所は、大人 (10 に 30 ハエ) 小さなプラスチック スクリュー キャップ バイアルまたは 1.5 mL 遠心管中を麻酔しました。
   2. 4 ° C で 1 ml 2 h (または夜通し) 漬けます (1.25% グルタルアルデヒド、0.1 M のリン酸バッファー pH 7.2) の麻酔のハエを浸すハエは定着剤の表面に浮かぶ場合、は、組織の合計浸漬を可能にする固定液の表面張力を弱めるため 2.5% ポリエチレング リコール tert-オクチルフェニル エーテルを数滴を追加します。ガラス ピペットを使用して定着剤を削除します。

2. 洗濯・脱水

1. 洗って、シアノ バクテリアを脱水します。
   1. 0.1 M リン酸バッファー pH 7.0 10 min. の室温で 5 mL で 3 回固定サンプルを洗います。フラスコと漏斗栓洗浄を保持するために維持します。両方のストッパーを削除した後、穏やかな真空ろ過フラスコで各洗浄を削除します。
   2. 目標到達プロセスの 5 mL の量で 10 分間傾斜エタノール シリーズを使用して連続浸漬を維持しながらサンプルを脱水します。傾斜エタノール濃度: 25%、50%、75%、95%、100% のエタノールの 2 つの変更。両方経由でフラスコと漏斗に損失を防止する漏斗にエタノールを含んでいる栓を保つ蒸発とパッシブ フィルターを通過。
   3. 穏やかな真空ろ過フラスコにエタノールを両方のストッパーを削除した後削除します。フィルター/サンプルを乾燥する前にサンプルをカバーするだけの十分な 100% エタノールを含んでいる皿の重量を量る使い捨てアルミに転送します。
2. 洗って、単細胞藻類 (euglenoids) を脱水します。
   1. 10 分の室温で 5 mL の脱イオン水を使用して 3 回固定サンプルを洗ってください。フラスコと漏斗漏斗で洗浄を含む栓をしてください。両方のストッパーを削除した後、穏やかな真空ろ過フラスコで各洗浄を削除します。
   2. 目標到達プロセスの 5 mL の量で 10 分間傾斜エタノール シリーズを使用して連続浸漬を維持しながらサンプルを脱水します。傾斜エタノール濃度: 25%、50%、75%、95%、100% のエタノールの 2 つの変更。両方経由でフラスコと漏斗に損失を防止する漏斗にエタノールを含んでいる栓を保つ蒸発とパッシブ フィルターを通過。
   3. 穏やかな真空ろ過フラスコにエタノールを両方のストッパーを削除した後削除します。フィルター/サンプルを乾燥する前にサンプルをカバーするだけの十分な 100% エタノールを含んでいる皿の重量を量る使い捨てアルミに転送します。
3. 洗いし、脱水ショウジョウバエ(ミバエ)。
   1. 1.5 mL 遠心チューブに 0.1 M リン酸バッファー pH 7.2 10 分室温で 1 mL で 3 回固定サンプルを洗います。ハエを削除しないように注意されているガラス ピペットで各洗浄を削除します。
   2. および microfuge の管に 1 mL の量で 10 分間傾斜エタノール シリーズを使用してサンプルを脱水します。エタノール濃度: 25%、50%、75%、80%、95%、100%。ハエを削除しないように注意されているガラス ピペットでエタノールを削除します。
   3. 乾燥する前にサンプルをカバーするだけの十分な 100% エタノールで 1.5 mL 遠心チューブにサンプルを保持します。

3. 乾燥

1. T-ブチル アルコール (TBA)²⁷を使用して化学乾燥を実行します。
   1. 100% エタノール溶液を 20 分 20 分 100% 未定で 1:1 ソリューションを二度繰り返し置換未定と 100% エタノールの 1:1 のソリューションに置き換えます。未定が凍結しないように、37 ° C でのソリューションを保持します。
      注: 100% 未定は 25.5 ° C の凍結ポイント1:1 の解決策は、室温では停止しません。未定は可燃性、眼に対する重篤な炎症の原因、吸入した場合有害である、めまいや眠気、呼吸器の炎症を引き起こす可能性があります。未定は、手袋、白衣、眼の保護など適切な個人用保護具を使用して化学の発煙のフード処理必要があります。
   2. 使い捨てアルミ皿の重さに 1.5 mL 遠心チューブの場合は未定でサンプルを転送します。一度アルミ計量皿、未定を削除し、サンプルをカバーするだけの十分な新鮮な 100% 未定で置き換えます。10 分の 4 ° C で TBA を凍結します。
   3. 未定凍結を保つために冷凍ジェル パックの真空デシケータ (ベルジャー) に転送します。避難し、少なくとも 3 時間冷凍未定の真空昇華乾燥または一晩にサンプルを許可するロータリー ポンプと真空を維持します。
2. ヘキサメチルジシラザン (HMDS)²⁰を使用して化学乾燥を実行します。
   1. HMD の 1:2 の溶液で 100% エタノール溶液を交換して、100% のエタノール 20 分の HMD の 2:1 の溶液で 1:2 ソリューションを置き換えるし、100% のエタノール 20 分の 2:1 の交換により、100 %20 分 HMD をもう一度繰り返します。
      注: HMDS は可燃性と急性毒素 (皮膚ルートです)。HMD は、手袋、白衣、眼の保護など適切な個人用保護具を使用して化学の発煙のフード処理必要があります。
   2. 1.5 mL 遠心チューブの場合使い捨てアルミ皿の重さに HMD でサンプルを転送します。アルミ 100% を置き換える計量皿、一度 HMD だけで十分な新鮮な 100% のサンプルをカバーする HMD。
   3. 新鮮な乾燥剤 (5-6 cm) をプラスチックやガラス、非真空デシケータにサンプルを転送し、化学の発煙のフードで配置。また、サンプルの上に落ちてから破片を防ぐために、ボックスなどの緩やかなふた付け乾燥させる化学発煙のフードに直接サンプルを配置します。12 ~ 24 時間乾燥するサンプルを許可します。

4. 取付

1. シアノ バクテリアと euglenoids をマウントします。
   1. 何が上に配置されていることを示すようにスタブをマウント 12 または 25 mm のアルミニウムの下部にラベルを付けます。12 mm スタブを使用して場合、きれいなかみそり刃またはメスの四分の一にカット乾燥細胞ポリカーボネート フィルターまたは 25 mm スタブを使用して場合、全体のフィルターを配置します。
   2. 接着剤またはスタブの上部に固定されている炭素接着] タブで各フィルターを配置します。
2. マウントショウジョウバエ(ミバエ)。
   1. 何が上に配置されているを示すアルミニウム実装スタブの下にラベルを付けます。
      乾燥したはえを精密ピンセットで解剖顕微鏡の下でスタブの上部に固定接着剤やカーボンの接着] タブで目的の位置に配置します。
   2. 銀の導電性接着剤、すなわち、銀塗装、スタブの外側のエッジの周りを適用します。導電性を確保するためにつまようじを使用してハエにシルバーのペイントを接続します。塗装目的の撮像領域をタッチをできないようにします。
   3. スタブ ホルダー ボックスにスタブを配置し、デシケータでオープン スタブ ホルダー ボックスを配置します。少なくとも 3 時間を乾燥または最良の結果のために一晩にシルバーのペイントを許可します。

5. スパッタ コーティング

1. アルゴンのガスの 4 ~ 5 フラッシュを実行することによりスパッタ コーティング装置を準備します。湿度が高い場合 (すなわち部屋の空気が湿った、通常について感じている相対湿度 50%)、6 ~ 7 のフラッシュを実行します。スパッタは、製造元の指示に従ってスタブをコートします。
2. 標本に基づいてコート サンプルが使用されます。
   1. シアノ バクテリア フィルター, 上 180 s ストレート コートをスパッタするタイマーを設定します。
   2. 真核生物の藻類、すなわちeuglenoids のためのフィルター 120 s、ストレート、20 s は 45 ° の角度で 3 つの側面のためのコートをスパッタするタイマーを設定します。
   3. すなわち、飛ぶヘッド、大型サンプルの 45 ° の角度で両側に 60 s、ストレート、30 秒のためのコートをスパッタするタイマーを設定します。
      注: コーティングが完了すると、スタブは色でライトグレーをする必要があります。

6. 画像

1. 画像のサンプル走査型電子顕微鏡によるには二次電子 (SE) 検出器が含まれます。
   1. シアノ バクテリア、設定: 3-5 kV 加速電圧 (AC)、20-30 プローブ電流 (PC)、5 ミリメートル作動距離 (WD)。Euglenoids、3 kV AC、30 を使用して PC と 5 mm WD。ハエ、5 kV AC、30 を使用して PC と 5 〜 10 mm WD。
2. 詳細または視覚化されるオブジェクトのサイズに応じて倍率を調整します。明確なイメージが作成されるまで、stigmators、開口部とフォーカスを調整します。SEM の製造元の指示に従って高解像度の設定を使用してイメージをキャプチャします。

結果

シアノ バクテリアは原核生物地球規模の炭素、酸素、および窒素サイクル^28,29に重要な生物群が。シアノ バクテリア³⁰推定 6000 種のほとんどをカバーし、セルを一緒に接続する粘液質の鞘があるし、他の構造に³¹、図形と一緒にすることができます解決顕微鏡³²。セルの?...

ディスカッション

ここで我々 は生物や組織の多くの種類の機能に適用できる他の有機体の 3 種類の外部形態的特性について詳細な情報を取得する SEM を使用してプロトコルを記述しました。プロトコルの各ステップ内では、潜在的なエラーで発生する可能性があり、詳細は以下で説明している点があります。

定着剤と洗浄ここに与えられたボリュームが特定は一般に定着剤と洗浄が試料?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
gold–palladium	Ted Pella, Inc.	91212
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black	Sigma	WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110606
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
F/2 media	Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin	https://utex.org/products/f_2-medium	No Catalog number given - see link
AF6 media	Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota	https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf	No Catalog number given - see link
Soil water medium	Carolina Biological Supply Company	153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4	No Catalog number given - see link
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE	The company doesn't appear to sell this model any longer