大鼠原位肾移植: 一种新的简化的手术方法

摘要

本手稿和程序的目的是详细解释和演示大鼠原位肾移植的手术方法。该方法简化后, 采用静脉和输尿管袖吻合术, 实现供肾的正确灌注, 缩短再灌注时间。

摘要

与任何类型的肾脏替代疗法相比, 肾移植为终末期肾病患者提供了更高的生存率和更高的生活质量。在过去的几十年里, 大鼠肾移植模型被用来研究排斥和耐受的免疫现象。在进行昂贵的临床前大型动物研究之前, 该模型已成为测试新的免疫调节药物和方案的不可或缺的工具。

该方案提供了如何可靠地在大鼠中进行原位肾移植的详细概述。该方案包括三个独特的步骤, 增加成功的概率: 通过冲洗门静脉灌注供肾和使用袖系统来吻合肾静脉和输尿管, 从而减少寒冷和温暖缺血时间。使用这种技术, 我们已经达到了存活率超过6个月与正常血清肌酐的动物与同种或耐受的肾脏移植。根据研究的目的, 这种模型可以通过移植前或移植后的治疗来改变, 以研究急性、慢性、细胞或抗体介导的排斥反应。研究肾移植的不同方面是一种可重复、可靠、经济高效的动物模型。

引言

从历史上看, 第一次移植排斥研究是由布伦特和医疗通过在啮齿类动物¹中进行皮肤移植进行的。很快就可以看出, 皮肤具有明显的免疫学特征, 使其成为一个高度免疫原性器官, 不同于其他血管化固体器官²的排斥反应。大鼠对固体器官移植排斥反应的研究通常仅限于心脏、肝脏和肾脏移植。虽然这些器官中的每一个都适合研究排斥, 但每个器官都有优点和缺点。心脏移植通常移植到腹部, 并与主动脉和静脉吻合, 受者的本地心脏就位 3.这并不能重现人类的临床、解剖和生理状况。此外, 心脏对冷缺血非常敏感, 必须在1小时内优先再灌注, 才能恢复其功能⁴。肝脏移植通常被认为是手术更具挑战性和时间敏感性的执行。去除原生肝脏后, 捐献者的肝脏必须在30分钟内植入和再灌注, 因为没有正常运作的肝脏^,受者就无法持续更长的时间5。肝动脉、门静脉, 尤其是胆管重建需要精细的手术技巧。除了手术的挑战, 肝脏是已知的具有耐受性的属性和啮齿类动物和人类可以成为操作耐受^6,7,8。肾脏, 不像前面提到的器官, 可以移植在一个原位的方式, 已知是一个免疫原器官与一致的, 可重复的排斥发作 (如果不是免疫抑制), 并允许长时间的冷缺血时间小时。这使得大鼠肾移植成为研究同种异体移植排斥反应和耐受性的理想模型。

肾移植 (KT) 是终末期肾病患者的首选治疗方法。在过去几十年中, KT 之后的短期生存结果有了显著改善, 但长期生存结果却停滞不前。常规免疫抑制方案仍然是标准的抗排斥治疗。然而, 长期使用免疫抑制疗法会导致显著的发病率和死亡率, 如肾毒性、^糖尿病和10、11^、12只继发性^{恶性肿瘤.}长期, 慢性抗体和脂肪介导的排斥威胁移植物的生存, 有限的治疗选择可用。

移植的一个主要目标是诱导移植耐受性, 以避免慢性免疫抑制的需要。大鼠 KT 模型是研究免疫排斥过程和评估免疫调节和移植耐受新方法的可靠工具。大鼠也是研究急性和慢性细胞和抗体介导的排斥^{13,14,15,16, 17的}合适模型。这种手术模型已被证明是一个可靠的, 可重复的, 和具有成本效益的工具, 以研究同种异体移植排斥和耐受的各个方面。在进行昂贵而繁琐的大型动物研究之前, 它经常被用来测试新的公差诱导方案。在大鼠身上进行 KT 手术需要广泛的手术培训和专业知识, 才能达到 gt;90% 的存活率。在这份手稿和随附的教学视频中, 我们为大鼠的原位 KT 提供了一个逐步的大纲, 在我们的机构成功地执行了多年。

在开始任何程序之前, 捐献者和受赠者的选择都是至关重要的, 这取决于实验的性质。理想情况下, 捐献者和受赠者的体重应在220-260 克之间, 年龄在8-12周之间。220克以下的动物有小直径的动脉、静脉和输尿管, 这使得接受者的吻合特别具有挑战性。轻微的失血会导致低血容量, 并导致较小的动物死亡。体重超过260克的动物在血管周围显示出更多的脂肪, 血管隔离将需要更多的手术时间, 并增加冷缺血时间。

研究方案

Lewis (RT1 1) 和深色 Agouti (da)(rt1a a) 大鼠是从商业供应商处购买的 (见《材料表》)。这些完全 mhc 不匹配菌株经常被用来研究急性肾移植排斥反应。所有动物都是根据国家卫生研究院 (NIH) 的指导方针, 在约翰·霍普金斯大学的一个特定的无病原体设施中安置和饲养的。所有程序都得到了机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 捐助者程序

1. 准备和高压灭菌所有的手术器械, 用于此程序的消毒手段, 并使用一次性无菌手套, 以防止传染性并发症。
2. 用异氟醚吸入致头大鼠 (诱导 3%-4%, 维护 1%-2%)在剩下的程序。给所有供体和受接受动物皮下的预防性丁丙诺非, 以 0.1 mg kg 体重进行镇痛。
3. 现在, 将老鼠放置在仰角, 用无菌遮罩胶带固定四肢。
4. 使用机械裁剪器将腹部的头发移开。
   1. 使用眼睛润滑剂, 并使用在聚苯二酚碘浸泡的无菌纱布, 然后是浸泡在异丙醇的纱布, 对手术领域进行消毒。
   2. 在第一个切口之前, 通过检查脚趾没有夹紧戒反射, 确保大鼠被充分麻醉。
5. 使用剪刀 , 首先做一个大的纵向中线皮肤和肌肉切口从联合到 , 并进入腹腔。
6. 在腹壁两侧插入两把牵引器, 以暴露腹腔内。
7. 用潮湿的无菌纱布覆盖肠道, 并将其转移到腹部的右侧, 暴露主动脉、静脉和左肾。用1毫升预热的盐水和1毫升注射器, 使肠道和腹部器官保持正常温度下的湿润。
   1. 用第二块湿纱布覆盖和动员胃和脾颅骨到肾脏, 并用一个小的湿纱布覆盖暴露的肾脏 (图 1a)。
8. 使用显微外科解剖钳从结缔组织中分离和动员左肾动脉和静脉。通过对左性腺静脉进行烧蚀来隔离左肾静脉, 并通过对肾上腺动脉进行烧蚀来分离左肾动脉。之后, 通过解剖结缔组织, 将左肾椎弓根的主动脉和静脉上、下, 动员主动脉和静脉上、下 (图 1b)。
9. 使用解剖钳将输尿管从结缔组织中分割和动员, 并使用微剪刀, 在从肾盆测量的长度为2厘米的对角线切口。将聚酰胺袖口 (见材料表) 插入输尿管的一半, 并通过放置一个8-0 的结固定袖口丝缝合线 (图 1c)。
   注: 重要的是不要从输尿管中取出所有脂肪和结缔组织, 因为它们提供保护, 防止由粘连引起的梗阻, 并且它们的去除可能会导致输尿管坏死。注意保持血管向输尿管供氧。
10. 通过解剖钳或微剪刀将左肾从肾周脂肪中分离, 从而动员左肾。保留连接肾脏的脂肪胶囊, 并使用该部位处理肾脏。
    1. 暴露下腔静脉。
11. 在静脉中使用带有 27 G 针的注射器 , 管理 200 个单位的肝素。用棉签给注射部位按压至少 1分钟, 以防止出血。
12. 识别门静脉 (pv) 和下腔静脉 (ivc) (图 1d)。用 16 G 针将50毫升的冷盐水与500单位肝素混合在门静脉中冲洗肾脏 (图 1e)。冲洗前, 在肝下水平处切除下腔静脉和针插入部位的门静脉尾端, 让血液排出循环。开始冲洗肾脏, 逐渐注入盐水溶液。观察肾脏颜色的变化, 从深红色到均匀的灰色和苍白的颜色 (图 1f)。
13. 冲洗后, 将肾动脉和静脉近端连接到主动脉和静脉, 并将冲洗后的肾脏放在冰上的冷盐水中的培养皿中。图 2A表示捐献者程序的示意图概述。
14. 一旦肾脏处于冷盐水中, 固定和固定静脉袖口的手柄 (见材料表), 轻轻地将肾静脉拉过袖口。然后, 用 8-0 丝缝合线 (图 2b) 放置三个结, 将肾静脉固定在袖口上。
    注: 在固定静脉的同时, 要特别注意静脉的方向。旋转静脉会导致血液流动受阻, 导致血栓形成。

2. 收件人程序

1. 重复捐献者过程中的步骤1.1–1.11。
2. 将两个无菌微血管夹放在主动脉和静脉最近的左肾动脉和静脉 (图 3a)。
3. 将受者的肾静脉与肾脏入口近端结扎。用肝素化盐水冲洗肾静脉, 将血管中所有剩余的血液取出。
4. 将结扎的肾静脉滑过先前位于供体肾脏的被铐肾静脉, 并以8-0 固定丝缝合 (图 3b)。在袖口上固定肾静脉时保持相同的位置方向。
5. 将输尿管连接在左肾下极的水平。从肾周脂肪中调动肾脏。
6. 将肾动脉近端与受者肾脏的入口连接。用肝素化盐水冲洗, 以去除血管中多余的血液。使用10-0 尼龙缝合线 (图 3c), 对8至10个中断缝合线进行肾动脉端到端吻合。利用平位层来操纵动脉。
7. 取下血管夹子, 重新启动肾脏的再灌注。首先取下静脉上的夹子, 然后是动脉上的夹子 (图 3d)。使用无菌棉签, 以减轻任何渗出区周围的吻合区域。几分钟就足以实现专利吻合。
8. 简要观察肾脏以评估是否有足够的灌注。再灌注后, 肾脏应立即改变颜色, 并在几分钟后逐渐恢复其自然的暗红色 (图 3e)。输尿管的可见蠕动和现场尿液的产生有时会被观察到。
9. 通过将输尿管袖口的外露尖端插入收件人输尿管并使用8-0 固定收件人输尿管完成丝缝合 (图 2 c 和图 3f)。
10. 为了保持捐献者和接受者输尿管的位置, 将每个输尿管侧的两端绑起来。
11. 或者, 右肾可以通过绑下右肾动脉和静脉4-0 丝缝合和切除肾脏肾。
12. 从腹腔取出所有的纱布, 将所有器官恢复到自然位置, 在肠道上喷1毫升盐水以保持湿润, 并通过在直肠肌肉上使用4-0 可吸收的缝合线和4-0 丝缝合来关闭皮肤在中断的方式。

3. 术后护理

1. 将动物放在干净的笼子里, 可以获得空气中的水和食物, 并允许在37°c 的加热垫上回收。
2. 注射 0.1 mg/kg 丁丙诺非进行镇痛, 并监测动物的恢复情况。根据不适或疼痛的迹象, 未来几天可能需要额外的止痛药管理。抗生素不是例行使用, 因为感染并发症是罕见的。
3. 观察恢复时间为 1-2小时, 然后将动物送回动物设施。检查动物2x–3x 的前 24小时, 然后进行日常检查。注意疼痛和痛苦的迹象, 口服和泌尿系统输出。
4. 手术后7-10天取出缝线。

结果

我们进行了同源 (n = 5) 和同种异体肾移植 (n = 5)。进行同源移植的动物在没有任何免疫抑制治疗的情况下实现了长期生存。在没有免疫抑制的情况下接受同种异体移植的动物拒绝了移植, 并死于肾功能衰竭, 平均生存期为 8天 (图 4a)。在同种组中, 平均血清肌酐略有增加, 而同种组则增加了 14倍 (0.5 mg/dL 对 7.0 mg/dl, p & lt;0.01) (图 4<...

讨论

在本手稿中, 我们详细介绍了大鼠原位 KT 的手术方法, 包括执行此过程所需的所有必要设备 (图 5)。1965年, 费舍尔和李发表了第一份关于老鼠 KT 的报告, 这成为一个令人兴奋的调查领域¹⁸的开始。自那时以来, 已经引入了许多修改, 以提高该模型的重现性。由于部分和全部 MHC 错配组合的几个自亲和外交系的存在, 为研究缺血再灌注损伤和肾移植排斥反应和耐?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm