אורתובנושא חולדה השתלת כליה: מגישת רומן וכירורגית פשוטה

Summary

מטרת כתב היד והפרוטוקול היא להסביר ולהדגים בפרוטרוט את ההליך הכירורגי של השתלת כליות אורתוגרפית בחולדות. שיטה זו היא פשוטה כדי להשיג את הפרזיה הנכונה של כליה התורם ולקצר את הזמן הreperfusion באמצעות שימוש בטכניקת ורידי השרוול וההשקה.

Abstract

השתלת כליות מציעה שיעורי הישרדות מוגברת ואיכות חיים משופרת עבור חולים עם מחלת כליות בשלב הסופי, לעומת כל סוג של טיפול החלפת כליות. במהלך העשורים האחרונים, מודל השתלת כליות חולדה שימש לחקר התופעות האימונולוגיים של דחייה וסובלנות. מודל זה הפך להיות כלי הכרחי כדי לבדוק תרופות אימונומודולטוריים החדש משטרי לפני ההליך עם מחקרים יקרים בעלי חיים מראש גדול פרה.

פרוטוקול זה מספק סקירה מפורטת של כיצד לבצע באופן אמין השתלת כליה אורתוגרפית בחולדות. פרוטוקול זה כולל שלושה צעדים מיוחדים המגבירים את ההסתברות להצלחה: הפרזיה של כליה התורם על ידי שטיפה דרך וריד השער ושימוש במערכת חפתים כדי להפעיל את ורידים הכליות והשופכה, ובכך להקטין קר וחמים פעמים של איסכמיה באמצעות טכניקה זו, השגנו שיעורי הישרדות מעבר ל 6 חודשים עם קריאטינין סרום רגיל בבעלי חיים עם השתלת כליה תחבירית או סובלנית. בהתאם למטרה של המחקר, מודל זה יכול להיות שונה על ידי טיפול טרום או פוסט השתלת ללמוד את אקוטי, כרונית, הסלולר, או נוגדנים בתיווך דחייה. זהו מודל בעלי חיים, אמין וחסכוני לחקר היבטים שונים של השתלת כליה.

Introduction

מבחינה היסטורית, המחקרים הראשונים של דחיית ההשתלה בוצעו על ידי ברנט ו Medawar באמצעות השתלות עור במכרסמים¹. במהרה התברר כי העור יש תכונות אימונולוגיים ברורים, מה שהופך אותו לאיבר חיסוני מאוד כי הוא שונה בדחייה של איברים אחרים מוצק vascularized². לימודי חולדה של דחייה השתלת איברים מוצק מוגבלים לטיפול ללב, לכבד, ולהשתלת כליה. למרות שכל אחד מאברים אלה מתאים ללימוד דחייה, יש יתרונות וחסרונות לכל אחד מהם. השתלות לב מושתלים לעתים קרובות לתוך הבטן ומנומת אל העורקים והבנה קאווה, עם הלב הטבעי של המטופל במקום³. זה אינו משחזר את התנאים הקליניים, האנטומיים האנושיים והפיזיולוגיים. בנוסף, לבבות רגישים מאוד איסכמיה קר צריך להיות מוכן מחדש בתוך 1 h כדי להיות מסוגל לשחזר את תפקידם⁴. השתלות כבד נחשבות בדרך כלל להיות בניתוח מאתגר יותר זמן רגיש לבצע. לאחר הסרת הכבד הטבעי, יש להשתיל את כבד התורם ולהתחמש בתוך 30 דקות משום שהנמענים אינם יכולים להימשך זמן רב יותר ללא הכבד הפועל⁵. עורק הכבד, וריד השער, ובמיוחד השחזור צינור המרה דורש כישורי ניתוח מעודן. מלבד האתגרים כירורגי, הכבד ידוע בעלי מאפיינים tolerogenic ומכרסמים ובני אדם יכולים להיות עמידים מבחינה מבצעית^6,7,8. הכליה, בניגוד האיברים הנ ל, יכול להיות מושתלים בצורה אורתודפית, ידוע להיות איבר חיסוני עם עקביות, הדחייה פרקים מנוגדות (אם לא החיסונית), ומאפשר תקופות של איסכמיה קר ממושכת של מספר שעות. זה הופך את כליה העכברוש להשתלות מודל אידיאלי ללמוד דחייה אלושתל וסובלנות.

השתלת כליה (KT) היא הבחירה המועדפת של טיפול בחולים עם מחלת כליות בשלב הסופי. במהלך העשורים האחרונים, תוצאות ההישרדות לטווח קצר לאחר KT השתפרו באופן דרמטי, אבל התוצאות לטווח ארוך הישרדות הם הקפואה⁹. המדכא הקונבנציונלי משטרי להישאר טיפול סטנדרטי נגד דחייה. עם זאת, השימוש הכרוני בטיפולים אימונומדכאים גורם לתחלואה ותמותה משמעותיים, כגון נפרורעילות, סוכרת, ממאירות משנית^10,11,12. ב-לטווח ארוך, נוגדן כרונית, מתווך הסלולר דחייה מאיימים הישרדות השתל, עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות זמין.

מטרה עיקרית בהשתלה היא אינדוקציה של סובלנות השתלה כדי לסדר את הצורך בדיכוי חיסוני כרונית. מודל KT החולדה הוא כלי חזק כדי לחקור את תהליך הדחייה החיסונית ולהעריך גישות חדשות החיסונית וסובלנות השתלה. עכברוש משמש גם מודל מתאים כדי ללמוד מתווכת תא ונוגדן בתיווך כרונית^,13,¹⁴,^15,16,17. מודל זה כירורגי הוכיחה להיות אמין, הניתנים לשימוש, וחסכוני בכלי כדי ללמוד היבטים שונים של דחייה השתלת וסובלנות. הוא משמש לעתים קרובות כדי לבדוק את הפרוטוקולים הרומן לגרימת סובלנות לפני התחייבות יקר ומסורבל בעלי חיים גדולים מחקרים. ביצוע KT ב חולדות דורש הכשרה כירורגית נרחבת מומחיות כדי להגיע לשיעורי הישרדות של > 90%. בכתב יד זה ובסרטון ההדרכה הנלווה, אנו מספקים מיתאר צעד-אחר-צעד לנושא אורתוקט KT בחולדה, כפי שבוצעה בהצלחה במשך שנים רבות במוסד שלנו.

לפני הפעלת כל הליך, בחירת התורם והנמען היא קריטית ותלויה באופי הניסוי. באופן אידיאלי, תורמים ומטופלים צריכים לשקול בין 220 ל-260 גר' ולהיות בין הגילאים 8 עד 12 שבועות. בעלי חיים מתחת 220 g כוללים עורקים בקוטר קטן, ורידים וורידים, העושים את ההשקה בתוך המטופל באופן מאתגר במיוחד. איבוד דם קטן יכול לגרום להיפובולמיה. ולגרום למוות בחיות קטנות יותר בעלי חיים כבדים יותר 260 g להציג שומן יותר סביב הכלים שלהם, ואת בידוד כלי ידרוש יותר זמן פעיל ולהגדיל את הזמן הקר איסכמיה.

Protocol

לואיס (RT1¹) והעכברושים הכהים (RT1A^a) נרכשו מיצרנים מסחריים (ראו את שולחן החומרים). אלה מלאה MHC הזנים לא תואמים משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד דחייה הכליות הכליה חריפה. כל החיות היו שוכנו ומתוחזקים על פי הנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH) במתקן מסוים האנטי-פתוגן באוניברסיטת ג'ונס הופקינס. כל ההליכים אושרו על ידי הטיפול המוסדי בעלי חיים והוועדה השתמש.

1. הליך תורם

1. להכין ו האוטוקלב כל המכשירים כירורגי לשמש בהליך זה כאמצעי עיקור ולהשתמש כפפות סטרילי חד פעמי כדי למנוע סיבוכים זיהומיות.
2. השאיפה את החולדה התורמת על ידי אינהלציה של השאיפה (אינדוקציה ב -3% – 4% ואחזקה ב-1% – 2%) לשאר ההליכים תן את כל חיות התורמים והנמען בעלי חיים מונעת בופרנורפין תת-עורי ב 0.1 מ"ג/ק"ג משקל הגוף עבור כאבים.
3. ומשתק את הגפיים. בקלטת מיסוך סטרילית
4. השתמש בקוצץ מכני כדי להסיר שיער מאזור הבטן.
   1. להחיל סיכה העין ולהשתמש גזה סטרילית ספוגה povidone-יוד, ואחריו גזה ספוגה באלכוהול איזופרופיל, כדי לחטא את השדה כירורגי.
   2. לפני החתך הראשון, לוודא את העכברוש מורדם כראוי על ידי בדיקת העדר של הבוהן צביטה לסגת רפלקס.
5. באמצעות מספריים, להתחיל על ידי ביצוע גדול האורך באמצע העור וחתך שרירים מתוך העצם הפופיזיס של xiphoid, ולהיכנס חלל הצפק.
6. הכנס שני טרקטורים משני צדי דופן הבטן כדי לחשוף את חלל פנים-הבטן.
7. לכסות את המעי עם גזה סטרילי לח ולהעביר אותו לצד הצדדי הימני של הבטן, חשיפת העורקים, הבנה קאווה, וכליה שמאל. החל 1 מ ל של מלח מחומם מראש עם מזרק 1 cc כדי לשמור על המעיים ואת אברי הבטן לחות ובטמפרטורה נורמלית.
   1. להחיל גזה לחות שנייה כדי לכסות ולהניע את הקיבה ואת הגולגולת הטחול לכליה ו גזה לח קטן כדי לכסות את הכליה החשופה (איור 1א).
8. השתמש מלקחיים מנתחים כירורגית כדי לבודד ולהניע את עורק הכליה השמאלי ואת הווריד מרקמת החיבור אחד את השני. לבודד את הווריד הכליה השמאלית על ידי הוספת וריד הווריד השמאלי ולבודד את עורק הכליה השמאלית על ידי שצרוב את עורק יותרת הכליה. לאחר מכן, להניע את אב העורקים ואת שבנה קאבה מעולה ונחותים של כליות שמאל על ידי מבתר את רקמת החיבור עם מלקחיים מריעון (איור 1B).
9. לחלק ולגייס את השופכה מרקמת החיבור באמצעות מלקחיים מבתר, ולעשות חתך אלכסוני באורך של 2 ס"מ נמדד מאגן הכליה, באמצעות מיקרו מספריים. הכנס חפתים פוליאמיד (ראה טבלת חומרים) בחצי הדרך לתוך השופכה ולאבטח את השרוול על ידי הצבת קשר עם 8-0 תפר משי (איור 1ג).
   הערה: חשוב לא להסיר את כל רקמת השומן והחיבור מן ureter, כפי שהם מספקים הגנה מפני חסימה הנגרמת על ידי הדלקת, וההסרה שלהם עלול לגרום נמק השופכה. שים לב יותר כדי לשמר את כלי הקיבול אספקת חמצן לתוך השופכה.
10. להניע את הכליה השמאלית על ידי הפרדת השומן מהנקבים בעזרת מלקחיים או מיקרומספריים. השאירו את כמוסת האדיפוז של הכליה המצורפת והשתמשו באתר לטיפול בכליה.
    1. . לחשוף את האובורד הנחות
11. לנהל 200 יחידות של הפארין בעזרת מזרק עם מחט של 27 גר' דרך הווריד של הפין. לחץ על האתר של הזרקה עם משטח כותנה לפחות 1 דקות כדי למנוע דימום.
12. זיהוי וריד השער (pv) והוריד הורד הנחות (איור 1ד). ריקון הכליה על ידי הזרקת 50 mL של מלוחים קרים מעורבב עם 500 יחידות של הפארין לתוך וריד הפורטל באמצעות מחט G 16 (איור 1E). לפני השטיפה, לחתוך את הווריד הנחות ברמה ברמת הכבד ואת וריד הפורטל caudal באתר הכנסת המחט כדי לאפשר לדם לצאת מהמחזור. התחל לרוקן את הכליה בהדרגה. באמצעות החדרת התמיסה לתמיסת מלח שים לב לשינוי הצבע של הכליה מאדום כהה לצבע אפור אחיד ובהיר (איור 1F).
13. לאחר השטיפה, להציב את עורק הכליה ואת הווריד האבובית לעורק העורקים ולבנה קאווה ולהניח את הכליה הסמוק בצלחת פטרי בתמיסת מלח קר על הקרח. איור 2 A מייצגת את הסקירה הסכימטית של הליך התורם.
14. לאחר הכליה היא בתמיסת מלח קר, לתקן ולשתק את ידית השרוול של הווריד (לראות את שולחן החומרים) ולמשוך בעדינות את וריד הכליה דרך השרוול. ואז, לתקן את הווריד הכליות על השרוול על ידי הצבת שלושה קשרים באמצעות שמונה אפס התפר משי (איור 2B).
    הערה: יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לכיוון הווריד תוך כדי הידוק הנעילה במקומה. ורידים מסובבים גורמים לחסימה של זרימת הדם ולהוביל לפקקת.

2. הליך הנמען

1. חזור על שלבים 1.1 – 1.11 מהליך התורם.
2. מניחים שני מלחציים מיקרו-כלי המגמטיים על עורק הכליה השמאלי והווריד הראשי של אב העורקים והבנה קאווה (איור 3א).
3. לישער את וריד כליות המטופל האבויה של הכליה. לשטוף את וריד הכליות עם המלח heparinized כדי להסיר את כל הדם שנותר מתוך כלי.
4. החלק את הווריד כליות ליגולי על הווריד כליות אזוקות בעבר ממוקם בכליה התורם ולאבטח אותו עם 8-0 תפר משי (איור 3ב'). לשמור על כיוון זהה כאשר לאבטח את הווריד הכליות על השרוול.
5. הורד את השופכה במפלס הקוטב התחתון של הכליה השמאלית. להניע את הכליה. משומן הנקבים
6. לישער את עורק הכליה האבובי אל הכניסה של כליה הנמען. . כדי להסיר דם עודף בכלי בצע השקה מקצה לקצה של עורק הכליה עם 8 עד 10 תפרים מקוטע באמצעות תפר 10-0 ניילון (איור 3ג). תמרון העורק באמצעות השכבה האדואדאני.
7. מסירים את התפסים כדי להפעיל מחדש את הreperfusion של הכליה. התחל על ידי הסרת התפס על הווריד ואחריו את המלחציים על העורק (איור 3ד). השתמש בספוגית כותנה סטרילית כדי ללחוץ בקלות על כל האזורים הנזילה סביב אזור ההשקה. כמה דקות צריך להספיק כדי להשיג השקה פטנט.
8. צפו בקצרה בכליה כדי להעריך את הפרזיה הנאותה. מיד לאחר reperfusion, הכליה צריך לשנות את הצבע ובהדרגה להחזיר את הצבע הטבעי כהה שלה אדום לאחר כמה דקות (איור 3E). הפריסטלזיס הגלויות של השופכה וייצור השתן באתר נצפו לעיתים.
9. סיום על-ידי הוספת הקצה החשוף של השרוול ureteral לתוך המטופל שופכן ולאבטח את שופכן הנמען עם 8-0 תפר משי (איור 2C ואיור 3F).
10. על מנת להשאיר את התורמים והמקבל בעמדה, לקשור את קצות כל אחד מהצדדים.
11. באופן אופציונלי, הכליה הנכונה יכולה להיות לנפרוזציה על ידי קשירת עורק הכליה הימני והווריד עם תפר משי 4-0 והסרת הכליה.
12. להסיר את כל הגוזים מן חלל הבטן, להחזיר את כל האיברים למצב הטבעי שלהם, להתיז 1 מ ל של מלוחים על המעיים כדי לשמור אותם לח, ולסגור את הבטן באמצעות תפר הנספג 4-0 על השריר rectus ותפר משי 4-0 לסגור את העור לשכב . בצורה מופרעת

3. טיפול פוסט-פעיל

1. מניחים את החיה בכלוב נקי עם גישה למים libitum ומזון ולאפשר שחזור על משטח חימום 37 ° c.
2. הכנס 0.1 מ"ג/ק"ג בופרינורטין תת-עורי לחוסר כאבים ונטר את בעל החיים להתאוששות. ייתכן שיהיה צורך בניהול משככי כאבים נוספים בימים הקרובים, בהתאם לסימנים של אי נוחות או כאב. אנטיביוטיקה לא מנוהלים באופן שגרתי, כמו סיבוכים זיהומיות הם נדירים.
3. שימו לב להתאוששות של 1 – 2 לפני שתחזיר את החיה למתקן החי. בדוק את בעל החיים 2x – 3x ביום עבור 24 h הראשון, ואחריו בדיקה יומית. שים לב סימנים של כאב ומצוקה, צריכת אוראלי, ופלט השתן.
4. הסר את התפרים 7 – 10 ימים לאחר הפעולה.

תוצאות

ביצעת סינגנמית (n = 5) והשתלות כליות אלוגנאית (n = 5). בעלי חיים עם השתלת סינגנאית השיגו הישרדות ארוכת טווח ללא כל טיפול חיסוני מדכא. בעלי חיים שקיבלו השתלת אלוגנמית ללא דיכוי חיסוני דחו את ההשתלה שלהם ונכנעו לכישלון כליות עם הישרדות חציון של 8 ימים (איור 4א). מר...

Discussion

בכתב יד זה, אנו מתארים את השיטה כירורגית עבור מט KT בחולדות בפירוט, כולל את כל הציוד הדרוש כדי לבצע את ההליך הזה (איור 5). ב 1965, פישר ולי פרסמה את הדו ח הראשון על KT בחולדות, אשר הפך לתחילתו של שדה חקירה מרגש¹⁸. מאז, שינויים רבים הוכנסו כדי לשפר את השגות של המודל הזה. הוא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm