Ortootopik Rat böbrek nakli: bir roman ve Basitleştirilmiş cerrahi yaklaşım

Özet

Bu yazının ve protokolün amacı, farelerde ortootopik böbrek transplantasyonunun cerrahi prosedürünü ayrıntılı olarak açıklamak ve göstermek. Bu yöntem, donör böbreğin doğru perfüzyon elde etmek ve venöz ve üreteral manşet anastomoz tekniği kullanarak reperfüzyon süresini kısaltmak için basitleştirilmiştir.

Özet

Böbrek nakli, her türlü böbrek replasman tedavisine kıyasla son evre böbrek hastalığı olan hastalar için artan hayatta kalma oranları ve gelişmiş yaşam kalitesi sunar. Son birkaç yıl içinde, sıçan böbrek transplantasyonu modeli, ret ve tolerans immünolojik fenomenlerin incelenmesi için kullanılmıştır. Bu model, pahalı preklinik büyük Hayvansal çalışmalarda devam etmeden önce yeni immünomodülatör ilaç ve rejimleri test etmek için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir.

Bu protokol, farelerde ortootopik böbrek nakli konusunda ayrıntılı bir genel bakış sağlar. Bu protokol, başarı olasılığını artıran üç ayırt edici adım içerir: portal ven yoluyla yıkılarak Donör böbrek perfüzyon ve Böbrek damarları ve üreterleri anastomoze bir manşet sistemi kullanımı, böylece soğuk ve sıcak azalan iskemi kez. Bu tekniği kullanarak, syngeneik veya toleranslı böbrek nakli olan hayvanların normal serum kreatine sahip 6 ay ötesinde hayatta kalma oranları elde ettik. Çalışmanın amacınıza bağlı olarak, bu model akut, kronik, hücresel veya antikor aracılı reddetme çalışmaları için ön veya postnakil tedavileri ile değiştirilebilir. Böbrek transplantasyonunun farklı yönlerini incelemek için reproducible, güvenilir ve uygun maliyetli bir hayvan modelidir.

Giriş

Tarihsel olarak, ilk nakil reddi çalışmaları Brent ve Medawar tarafından kemirgenler¹cilt nakli kullanılarak yapılmıştır. Kısa süre sonra, cildin farklı immünolojik özelliklere sahip olduğunu, diğer vaskülarize katı organlardan reddedilme konusunda farklı olan son derece immünojenik bir organ haline gelmiştir². Katı organ nakli reddi Rat çalışmaları alışkanlıkla kalp, karaciğer ve böbrek nakli ile sınırlıdır. Bu organların her biri reddetme çalışması için uygun olmasına rağmen, her biri için avantajlar ve dezavantajları vardır. Kalp nakli genellikle karın içine nakledilir ve aort ve Vena Cava anastomozları yapıldı, yerine alıcının doğal kalbi ile³. Bu, insan klinik, anatomik ve fizyolojik koşulları yeniden oluşturmaz. Ayrıca, kalpler soğuk iskemi çok duyarlıdır ve 1 h içinde tercihen reperfkullanılmış olması için kendi işlevini kurtarmak edebilmek için⁴. Karaciğer nakli genellikle cerrahi olarak daha zorlu ve zaman duyarlı gerçekleştirmek için kabul edilir. Yerli karaciğer çıkardıktan sonra, donör karaciğer implante ve 30 dakika içinde reperfkullanılmış olarak alıcılar daha uzun süre işlevsel bir karaciğer olmadan dayanamaz⁵. Hepatik arter, portal ven, ve özellikle safra kanalı yeniden yapılanma rafine cerrahi becerileri gerektirir. Cerrahi zorluklar yanı sıra, karaciğer tolerogenic özellikleri ve kemirgenler sahip olduğu bilinmektedir ve insanlar operasyonel toleranslı olabilir^6,7,8. Böbrek, yukarıda bahsedilen organların aksine, bir Ortotopik moda nakledilebilir, tutarlı, tekrarlanabilir ret bölümleri ile bir immünojenik organ olduğu bilinmektedir (Eğer immünopresatik değilse), ve birkaç uzun süreli soğuk iskemi süreleri sağlar Saat. Bu fare böbrek nakli allogreft ret ve tolerans eğitim için ideal bir model yapar.

Böbrek nakli (KT) son evre böbrek hastalığı olan hastalar için tercih edilen tedavi seçimdir. Son birkaç yıl içinde, KT sonra kısa vadeli hayatta kalma sonuçları dramatik, ancak uzun vadeli hayatta kalma sonuçları durgun⁹vardır. Konvansiyonel bağışıklık bastırıcı rejimleri standart anti-ret terapisi kalır. Ancak, bağışıklık baskılayıcı tedaviler kronik kullanımı önemli morbidite ve mortalite neden olur, nefrotoksisite gibi, diyabet, ve ikincil maligniteler^10,11,12. Uzun vadeli, kronik antikor ve hücresel aracılı ret, sınırlı terapötik seçenekleri ile greft hayatta kalma tehdit.

Transplantasyonun önemli bir amacı, kronik immünezit ihtiyacını ortadan önlemek için nakil toleransı indüksiyonudur. Sıçan KT modeli, immünolojik ret sürecini araştırmak ve immünomodüle ve nakli toleransına yeni yaklaşımlar değerlendirmek için sağlam bir araçtır. Sıçan Ayrıca akut ve kronik hücre ve antikor aracılı ret^{13,14,15,16,17}incelemek için uygun bir model olarak hizmet vermektedir. Bu cerrahi model, allogreft ret ve tolerans çeşitli yönlerini incelemek için güvenilir, reproducible ve uygun maliyetli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Genellikle pahalı ve hantal büyük hayvan çalışmaları taahhüt önce yeni tolerans inducing protokolleri sınamak için kullanılır. Sıçanlarda KT gerçekleştirme >% 90 hayatta kalma oranlarına ulaşmak için kapsamlı cerrahi eğitim ve uzmanlık gerektirir. Bu yazıda ve eşlik eden öğretim videosu, bizim kurumda yıllar boyunca başarılı bir şekilde gerçekleştirdiği gibi, sıçan içinde Ortotopik KT için adım adım bir anahat sunuyoruz.

Herhangi bir prosedür başlamadan önce, donör ve alıcı seçimi önemlidir ve denemenin doğasına bağlıdır. İdeal olarak, bağış ve alıcılar arasında ağırlığında olmalıdır 220 – 260 g ve arasında olmak 8 – 12 hafta yaş. 220 altında hayvanlar g küçük çaplı arterlere sahip, damarları, ve üreterler, alıcıda anastomoz özellikle zorlu hale. Küçük kan kaybı hipovolemi neden ve küçük hayvanların ölüme yol açabilir. 260 g 'den daha ağır hayvanlar damarlarında daha fazla yağ görüntüler ve damar yalıtımı daha fazla ameliyat süresi gerektirir ve soğuk iskemi süresini arttırır.

Protokol

Lewis (RT1¹) ve Dark AGOUTI (da) (RT1A^a) fareler ticari satıcılardan satın alındı ( malzeme tablosunabakın). Bu tam MHC-uyumsuz suşları genellikle akut böbrek allogreft reddetme çalışması için kullanılır. Tüm hayvanlar Johns Hopkins Üniversitesi 'nde belirli bir patojen içermeyen tesiste Ulusal Sağlık Enstitüleri 'nin (NıH) yönergelerine göre barındırıldı ve korunur. Tüm prosedürler kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. bağış prosedürü

1. Sterilizasyon aracı olarak bu prosedürde kullanılmak üzere tüm cerrahi aletleri hazırlayın ve otoklav yapın ve enfeksiyöz komplikasyonları önlemek için tek kullanımlık steril eldivenler kullanın.
2. Bağışçı sıçan ısofluran inhalasyon tarafından anestezize (İndüksiyon% 3-% 4 ve bakım% 1-2%) prosedür geri kalanı için. Tüm donör ve alıcı hayvanları preemptive buprenorfik subkütan olarak 0,1 mg/kg vücut ağırlığı analjezi için verin.
3. Şimdi, sıçan bir fitil konumuna yerleştirin ve steril maskeleme bandı ile ekstremite hareketsiz.
4. Karın bölgesinden saç çıkarmak için mekanik bir kesme makinesi kullanın.
   1. Bir göz yağlayıcısı uygulayın ve povidone-iyot içinde ıslatılmış steril gazlı bez kullanın, ardından cerrahi alanı sterilize etmek için izopropresl alkole batırılmış gazlı bez takip edin.
   2. İlk kesi önce, sıçan yeterli ayak tutam çekilme refleks yokluğunda kontrol ederek anestezize olduğundan emin olun.
5. Makas kullanarak, xiphoid için simfizis pubis büyük bir uzunlamasına orta çizgi cilt ve kas kesi yaparak başlamak, ve periton boşluğa girin.
6. Abdominal boşluğun ortaya çıkarabilmesi için karın duvarının her iki tarafına da Iki retraktörler takın.
7. Nemli steril bir gazlı bez ile bağırsak kapağı ve karın sağ lateral tarafına kaydırmak, aort açığa, Vena Cava, ve sol böbrek. Bağırsak ve abdominal organları nemli ve normal bir sıcaklıkta tutmak için 1 cc şırıngaya sahip 1 mL önceden ısıtılmış tuz uygulayın.
   1. Böbrek ve maruz böbrek (Şekil 1a) kapsayacak şekilde küçük bir nemli gazlı bez mide ve dalak kranial kapsayacak ve seferber için ikinci bir nemli gazlı bez uygulayın.
8. İzole ve bağ dokusu ve birbirleriyle sol böbrek arter ve ven seferber mikrocerrahi diseksiyon forseps kullanın. Sol gonadal ven Koterizasyon ve adrenal arter Koterizasyon sol renal arter izole ederek sol böbrek ven izole. Bundan sonra, aort ve Vena Cava üstün ve sol böbrek pedikül inferior diseksiyon forseps ile bağ dokusu diseksiyon tarafından seferber (Şekil 1B).
9. Kesme forseps kullanarak bağ dokusundan üreter bölmek ve seferber, ve mikromakas kullanarak, renal pelvis ölçülen 2 cm uzunluğunda bir diyagonal kesi yapmak. Bir Polyamid manşet yerleştirin (bkz . malzeme tablosu) üreter yarısı ve 8-0 ile bir düğüm koyarak manşet güvenli ipek sütür (Şekil 1C).
   Not: tüm yağ ve bağ dokusunu üreterden çıkarmayın, bu da yapışmaların neden olduğu tıkanmalara karşı koruma sağlarsa ve onların kaldırılması üreter nekrozuna neden olabilir. Üreter için oksijen sağlayan geminin korunması için ekstra dikkat edin.
10. Diseksiyon forseps veya mikromakas kullanarak perinefrik yağ ayırarak sol böbrek seferber. Bağlı böbreğin adipoz kapsül bırakın ve böbrek işleme için bu siteyi kullanın.
    1. Vena Cava inferior 'a maruz kalmayınız.
11. Penil ven üzerinden 27 G iğne ile bir şırınga kullanarak heparin 200 birimleri yönetin. Kanama önlemek için en az 1 dakika için bir pamuk çubuk ile enjeksiyon site basıncı.
12. Portal ven (PV) ve inferior vena cava (İVC) (Şekil 1D) belirleyin. 16 G iğne (Şekil 1E) kullanarak portal ven içine 500 heparin birimleri ile karışık 50 ml soğuk tuz enjekte ederek böbreği temizler. Kızarmadan önce infrahepatik düzeyde inferior vena cava kesip, kan dolaşımı çıkmak için izin vermek için iğne ekleme sitesinde portal ven kaudal. Böbrekte, tuz çözeltisi ile yavaşça infaşarak başlayın. Koyu kırmızıdan, homojen bir gri ve soluk renge (Şekil 1F) kadar böbrek rengi değişikine uyun.
13. Yıktıktan sonra, aort ve Vena Cava böbrek arter ve ven proksimal ve buzun üzerinde soğuk serum bir petri tabak içinde temizlenen böbrek yerleştirin. Şekil 2 A donör prosedürün şematik özetini temsil eder.
14. Böbrek soğuk salin içinde olduğunda, ven manşet kolunu düzelt ve hareketsiz et ( malzeme tablosunabakın) ve hassas bir şekilde manşet aracılığıyla renal ven çekin. Sonra, sekiz sıfır ipek sütür kullanarak üç knot koyarak manşet üzerinde böbrek ven düzeltin (Şekil 2B).
    Not: yerine sabitlerken damar oryantasyonuna özel dikkat edın. Döndürülmüş damarlar kan akışının tıkanmasına neden olur ve tromboz yol açar.

2. alıcı prosedürü

1. Bağış prosedürinden 1,1 – 1.11 arasındaki adımları tekrarlayın.
2. Sol renal arter üzerinde iki atravmatik mikro-damar kelepçesi yerleştirin ve aort ve Vena Cava için proksimal ven (Şekil 3A).
3. Böbrek girişinde alıcı renal ven proksimal ligate. Damar dışında kalan tüm kanı kaldırmak için heparinize tuzlu böbrek ven Flush.
4. Daha önce Donör böbrek konumlandırılmış ve bir 8-0 ile güvenli kelepçeli böbrek ven üzerinde birleştirilmiş böbrek ven kaydırın ipek sütür (Şekil 3B). Manşet üzerinde böbrek damarını sabitlediğinizde aynı pozisyon yönünü koruyun.
5. Sol böbreğin alt kutup seviyesinde üreter ligate. Perinefrik yağ böbrek harekete geçirin.
6. Böbrek arter alıcı böbrek girişine proksimal ligate. Gemide herhangi bir aşırı kan kaldırmak için heparinize tuzlu ile temizleyin. Bir 10-0 naylon sütür kullanarak 8 ila 10 kesilmiş sütürler ile renal arter uçtan uca anastomozu gerçekleştirin (Şekil 3C). Adventisyal tabaka kullanarak arter manevrası.
7. Böbrek reperfüzyon yeniden başlatmak için gemi kelepçeleri çıkarın. Damar üzerindeki kelepçeyi takiben atardamarın üzerindeki kelepçeyi kaldırarak başlayın (Şekil 3D). Anastomoz bölgesi çevresindeki herhangi bir alanı hafifçe bastırarak steril bir pamuklu çubuk kullanın. Birkaç dakika bir patent anastomoz elde etmek için yeterli olmalıdır.
8. Yeterli perfüzyon değerlendirmek için böbrek kısaca gözlemlemek. Reperfüzyon hemen sonra, böbrek, renk değiştirmek ve kademeli olarak birkaç dakika sonra doğal koyu kırmızı rengini kazanmak gerekir (Şekil 3E). Üreter ve yerinde idrar üretiminin görülebilir peristalsis bazen görülür.
9. Üreteral manşet maruz kalan ucu alıcı üreter içine yerleştirerek ve alıcı üreter bir 8-0 ile güvenli bitirmek ipek sütür (Şekil 2C ve Şekil 3F).
10. Donör ve alıcı üreterleri pozisyonda tutmak için, her üreter tarafındaki uçları birbirine bağlayın.
11. İsteğe bağlı olarak, sağ böbrek, sağ böbrek arter ve ven bir 4-0 ipek sütür ve böbrek çıkarılması ile bağlama tarafından nephrectomized olabilir.
12. Tüm organlarını Karın boşluğundan çıkarın, tüm organları doğal pozisyonlarına geri dönün, bağırsak üzerinde 1 mL tuzlu tuz onları nemli tutmak için, ve bir 4-0 kullanarak karın kapatın rekte kas ve bir 4-0 ipek sütür üzerinde absorblenebilir dikişler cilt yatıyordu kapatmak için kesilmiş bir moda.

3. ameliyat sonrası bakım

1. Hayvan, reklam Isteğe bağlı su ve gıda erişimi ile temiz bir kafes yerleştirin ve 37 °c Isıtma Pad kurtarma için izin verir.
2. Enjekte 0,1 mg/kg buprenorfik analjezi için subkutan ve kurtarma için hayvan izlemek. Ek analjezikler yönetim rahatsızlık veya ağrı belirtileri bağlı olarak, önümüzdeki birkaç gün içinde gerekli olabilir. Enfeksiyöz komplikasyonlar nadir olduğu için antibiyotik rutin olarak uygulanmaz.
3. Hayvan geri hayvan tesisi dönmeden önce 1-2 h için kurtarma gözlemlemek. Hayvan kontrol 2x-3x bir gün ilk 24 saat, sonra günlük muayene. Ağrı ve sıkıntı, Oral alımı ve idrar çıkışı belirtileri dikkat edin.
4. Operasyondan 7 – 10 gün sonra dikişleri çıkarın.

Sonuçlar

Syngeneic (n = 5) ve allogeneik böbrek nakli (n = 5) yapıldı. Syngeneic nakil ile hayvanlar herhangi bir immünopresif tedavi olmadan uzun süreli hayatta kalma elde. İmmünopresasyon olmaksızın allojeneik nakil yapan hayvanlar, sekiz gün boyunca (Şekil 4a) medyan sağkalım ile böbrek yetmezliği için greftlerini reddetti ve yenik düştü. Ortalama serum kreatinin syngeneic grubunda mütevazı bir şekilde arttığı sırada allogeneik grupta 14...

Tartışmalar

Bu yazıda, bu prosedürü gerçekleştirmek için gerekli tüm ekipmanlar da dahil olmak üzere, farelerde Ortotopik KT için cerrahi yöntemi tarif ediyoruz (Şekil 5). 1965 yılında, Fisher ve Lee sıçan, heyecan verici bir soruşturma alanı¹⁸BAŞLANGıCı oldu kt ilk raporu yayınladı. O zamandan bu yana, bu modelin yeniden üretilebilirliği geliştirmek için birçok değişiklik sunuldu. Bu iskemi-reperfüzyon hasarı ve böbrek nakli ret ve tolerans okumak...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm