Трансплантация почки ортотопическая: Роман и упрощенный хирургический подход

Резюме

Цель этой рукописи и протокола состоит в том, чтобы объяснить и детально продемонстрировать хирургическую процедуру ортоотопическая трансплантации почек у крыс. Этот метод упрощается для достижения правильной перфузии донорской почки и сокращения времени репертуара с помощью метода венозной и уретерной манжеты анастомоз.

Аннотация

Трансплантация почек обеспечивает повышенную выживаемость и улучшение качества жизни пациентов с терминальной стадией почечной болезнью по сравнению с любым типом заместительной почечной терапии. За последние несколько десятилетий, модель трансплантации почек крысы была использована для изучения иммунологических явлений отторжения и терпимости. Эта модель стала незаменимым инструментом для тестирования новых иммуномодулирующих фармацевтических препаратов и схем до продолжения дорогостоящих доклинических крупных исследований на животных.

Этот протокол предоставляет подробный обзор того, как надежно выполнять ортотопическая трансплантация почки у крыс. Этот протокол включает в себя три отличительных шага, которые увеличивают вероятность успеха: перфузию донорской почки путем промывки через портальную Вену и использование системы манжеты для анастомозы почечных вен и мочеточников, тем самым уменьшая холодный и теплый раз. Используя эту технику, мы достигли показателей выживаемости после 6 месяцев с нормальным креатинина сыворотки у животных с синогенной или терпимыми трансплантации почек. В зависимости от цели исследования, эта модель может быть изменена до или после трансплантации лечения для изучения острого, хронического, клеточного, или антитело-опосредованного отторжения. Это воспроизводимые, надежные и экономически эффективные модели животных для изучения различных аспектов трансплантации почек.

Введение

Исторически сложилось так, что первые исследования отторжения трансплантата были выполнены Брентом и Медаватом с помощью пересадки кожи у грызунов¹. Вскоре стало ясно, что кожа имеет различные иммунологические особенности, что делает его высоко иммуногенный орган, который отличается в отказе от других кровеносных сосудов твердых органов². Крысы исследования отказа трансплантации твердых органов обычно ограничивается сердца, печени, почек и трансплантации. Хотя каждый из этих органов подходит для изучения отторжения, у каждого из них есть свои преимущества и недостатки. Пересадка сердца часто пересаживают в брюшную полость и анастоме к аорте и полой Вене, с родным сердцем получателя на месте³. Это не воссоздать человека клинических, анатомических и физиологических условиях. Кроме того, сердечки очень чувствительны к холоду и должны быть повторно использованы преимущественно в течение 1 ч, чтобы иметь возможность восстановить свои функции⁴. Трансплантация печени, как правило, считаются хирургически более сложной и чувствительной к времени для выполнения. После удаления родной печени, донорской печени должен быть имплантирован и повторного использования в течение 30 минут, как получатели не могут длиться дольше без функционирования печени⁵. Печеночная артерия, портальная Вена, и особенно реконструкция желчных протоков требует изысканных хирургических навыков. Помимо хирургических проблем, печень, как известно, обладают толероженик свойствами и грызуны и люди могут стать оперативно терпимыми^6,7,8. Почки, в отличие от вышеупомянутых органов, могут быть пересажены в ортогопическая Мода, как известно, иммуногенный орган с последовательным, воспроизводимые отклонения эпизодов (если не иммуноподавляется), и позволяет длительное холодное время, Часов. Это делает пересадку почек крысы идеальной моделью для изучения отторжения аллотрансплантата и терпимости.

Трансплантация почки (КТ) является предпочтительным выбором лечения для пациентов с терминальной стадией почечной болезни. За последние несколько десятилетий, краткосрочные результаты выживания после КТ значительно улучшились, но долгосрочные результаты выживания застойной⁹. Обычные иммунодепрессивные режимы остаются стандартной терапией против отторжения. Однако хроническое применение иммунодепрессивных методов лечения приводит к значительным заболеваемости и смертности, таких как нефротоксичность, диабет и вторичные злокачественные новообразования^10,11,12. В долгосрочной перспективе хроническое антитело-и клеточное опосредованное отторжение угрожает выживанию трансплантата, имея ограниченные терапевтические возможности.

Основной целью трансплантации является индукция переносимости трансплантата для того, чтобы избежать необходимости хронического подавления иммунитета. Крыса КТ модель является надежным инструментом для исследования иммунологического процесса отторжения и для оценки новых подходов к иммуномодулирующие и трансплантации толерантности. Крыса также служит подходящей моделью для изучения острой и хронической клеточной и антитело-опосредованной отверженности^{13,14,15,16,17}. Эта хирургическая модель оказалась надежным, воспроизводимым, и экономически эффективным инструментом для изучения различных аспектов аллотрансплантата отторжения и терпимости. Он часто используется для проверки романа вызывающие терпимость протоколов до проведения дорогостоящих и громоздких исследований большого животного. Выполнение КТ в крысах требует обширных хирургических подготовки и экспертизы для достижения выживаемости > 90%. В этой рукописи и сопроводительном видео, мы предоставляем пошаговый набросок для ортогопической КТ в крысе, так как успешно выполняется в течение многих лет в нашем учреждении.

Перед началом любой процедуры выбор донора и получателя имеет решающее значение и зависит от характера эксперимента. В идеале, доноры и получатели должны весить от 220 до 260 г и быть между 8-12 недельного возраста. Животные под 220 g имеют малый диаметр артерий, вен и мочеточников, делая анастомоз в реципиенте особенно сложным. Незначительная потеря крови может вызвать гиповолемию и привести к смерти у мелких животных. Животные тяжелее, чем 260 g дисплей больше жира вокруг их сосудов, и изоляция судна потребует более оперативное время и увеличить время холодной.

протокол

Льюис (RT1¹) и темные Agouti (Da) (RT1A^a) крысы были приобретены у коммерческих поставщиков (см. таблицу материалов). Эти полностью MHC-несоответствие штаммов часто используются для изучения острой почечной аллотрансплантата отторжения. Все животные были размещены и поддерживаются в соответствии с руководящими принципами национального института здравоохранения (НИЗ) в конкретном учреждении, свободном от патогенов, в университете Джонса Хопкинса. Все процедуры были одобрены институциональным Комитетом по уходу за животными и его использованием.

1. Процедура донора

1. Подготовка и автоклав всех хирургических инструментов, которые будут использоваться в этой процедуре в качестве средства стерилизации и использовать одноразовые стерильные перчатки для предотвращения инфекционных осложнений.
2. Обезболивить донорскую крысу при вдыхании изофлуран (индукция при 3%-4% и обслуживании на 1%-2%) для остальной части процедуры. Дайте всем донорам и реципиентам животных преимущественное подкожно бупренорфина на 0,1 мг/кг массы тела для обезболивания.
3. Теперь поместите крысу в лежачем положении и обездвижить конечности стерильной липкой лентой.
4. Используйте механические клиппера для удаления волос из области живота.
   1. Примените смазку для глаз и используйте стерильную марлю, пропитанную Povidone-йодом, затем марлю, пропитанную изопропиловый спирт, для стерилизации хирургического поля.
   2. До первого разреза, убедитесь, что крыса адекватно обезболиваются, проверяя отсутствие пальца щепотку снятия рефлекс.
5. Использование ножниц, начать, сделав большой продольной средней кожи и разреза мышц от лобка симфиза к ксифоид, и введите брюшной полости.
6. Вставьте два ретрактора по обе стороны брюшной стенки, чтобы выявить внутрибрюшную полость.
7. Накройте кишечник влажной стерильной марлей и смести его в правую боковую сторону живота, обнажая аорту, полую вену и левую почку. Нанесите 1 мл предварительно разогретого физраствора на шприц 1 CC, чтобы сохранить кишечник и брюшные органы влажными и при нормальной температуре.
   1. Нанесите вторую влажную марлю, чтобы покрыть и мобилизовать желудка и селезенки черепных к почке и небольшой влажной Марли для покрытия подвергается почки (рис. 1).
8. Используйте микрохирургический Рассекающий щипцы, чтобы изолировать и мобилизовать левую почечную артерию и Вену из соединительной ткани и друг друга. Изолируйте левую почечную Вену, прижимая левую гонадальный Вену и изолируйте левую почечную артерию, прижимая артерию надпочечников. После этого, мобилизовать аорты и полой вены начальника и уступает левой почечной ножку путем рассечения соединительной ткани с анатомический щипцы (Рисунок 1B).
9. Разделите и мобилизует мочеточитель из соединительной ткани с помощью анатомический щипцы, и сделать диагональный разрез в длину 2 см измеряется от почечной таза, с использованием микроножницы. Вставьте полиамида манжеты (см. таблицу материалов) на полпути в мочеточитель и закрепите манжеты, поставив узел с 8-0 Шелковый шов (рис. 1с).
   Примечание: важно не удалять все жировые и соединительные ткани уретера, так как они обеспечивают защиту от обструкции, вызванной спайки, и их удаление может вызвать уретерного некроза. Обратите дополнительное внимание на сохранение сосуд, поставляющие кислород к мочеточника.
10. Мобилизовать левую почку, отделив ее от перифофринного жира с помощью анатомических щипцов или микроножницы. Оставьте жировой капсулы почки прилагается и использовать этот сайт для обработки почки.
    1. Подвергайте нижней полой вены.
11. Администрирование 200 единиц гепарина с помощью шприца с 27 G иглы через полового члена Вены. Давление на месте инъекции ватным тампоном, по крайней мере 1 мин для предотвращения кровотечения.
12. Определить портал Вены (PV) и нижней полой вены (IVC) (Рисунок 1D). Промывать почки путем введения 50 мл холодного физиологического раствора, смешанного с 500 единиц гепарина в портальную Вену с помощью 16 G иглы (рис. 1E). До промывки, вырезать нижней полой вены на подуровне печеночной и портал Вены хвостовой на месте вставки иглы, чтобы кровь, чтобы выйти из обращения. Начало промывки почек постепенно вливая физиологический раствор. Наблюдайте изменение цвета почки от темно-красного до равномерного серого и бледно-цветного (рис.1F).
13. После промывки, лигате почечной артерии и Вены проксимальных аорты и полой вены и поместить промыть почки в чашке Петри в холодном физиологическим раствором на льду. Рисунок 2 A представляет Схематический обзор процедуры донора.
14. Как только почка находится в холодном физиологический раствор, зафиксировать и обездвижить ручку Вены манжеты (см. таблицу материалов) и осторожно потяните почечную Вену через манжеты. Затем зафиксировать почечную Вену над манжеты путем размещения трех узлов с использованием восьми-нулевой Шелковый шов (рис. 2B).
    Примечание: Обратите особое внимание на ориентацию Вены, обеспечивая ее на месте. Повернутые Вены вызывают непроходимость кровотока и приводят к тромбозу.

2. Процедура получателя

1. Повторите шаги 1.1-1.11 от процедуры донора.
2. Поместите два атравматический зажимы микро-судна на левой почечной артерии и Вены проксимальных аорты и полой вены (рис. 3а).
3. Ligate получателя почечной Вены проксимально к входе почки. Промыть почечную Вену с гепаринизированным физиологическим раствором, чтобы удалить всю оставшуюся кровь из сосуда.
4. Слайд лигирован почечной Вены над наручниками почечной Вены ранее позиционируется в донорской почки и закрепите его с 8-0 Шелковый шов (Рисунок 3B). Поддержание той же позиционной ориентации при обеспечении почечной Вены на манжеты.
5. Лигейт мочеточитель на уровне нижнего полюса левой почки. Мобилизуем почку из перинефрического жира.
6. Ligate Почечная артерия проксимально к входе получателя почки. Промойте его с гепаринизированным физиологическим раствором, чтобы удалить излишки крови в сосуде. Выполните конца в конец анастомоз почечной артерии с 8 до 10 прерванных швов с использованием 10-0 нейлон шов (рис. 3C). Маневр артерии с помощью адвентитиал слоя.
7. Удалите зажимы сосуда для повторного начала репертуара почки. Начните с удаления зажима на Вену с последующим зажимом на артерии (Рисунок 3D). Используйте стерильный ватным тампоном слегка давления любых сочится области вокруг анастомоз области. Несколько минут должно быть достаточно для достижения патента анастомоз.
8. Кратко соблюдайте почки для оценки адекватного перфузии. Сразу после окончания репертуара почка должна менять цвет и постепенно восстанавливать свой естественный темно-красный цвет через несколько минут (рис.3E). Иногда наблюдаются видимые перистальты мочеточнои на месте производства мочи.
9. Отделка, вставив подвергается кончик уретерной манжеты в реципиента мочеточником и обеспечить получателя мочеточником с 8-0 Шелковый шов (Рисунок 2с и Рисунок 3F).
10. Для того, чтобы держать доноров и получателей уретров в положение, связать концы каждого уретера стороны друг к другу.
11. По желанию, Правая почка может быть нефретомизация путем связывания с правой почечной артерии и Вены с 4-0 Шелковый шов и удаление почки.
12. Удалите все газами из брюшной полости, вернуть все органы, чтобы их естественное положение, шприц 1 мл физиологического раствора кишечника, чтобы держать их влажными, и закройте живот с помощью 4-0 рассасывающийся шов на прямой мышцы и 4-0 Шелковый шов, чтобы закрыть кожу лежал ER в прерванный моды.

3. послеоперационный уход

1. Поместите животное в чистой клетке с доступом к объявлению вволю воды и продуктов питания и позволяют для восстановления на 37 ° c грелку.
2. Впрыснуть 0,1 мг/кг бупренорфина подкожно для обезболивания и контролировать животное для восстановления. Дополнительные анальгетики администрации может потребоваться в ближайшие несколько дней, в зависимости от признаков дискомфорта или боли. Антибиотики обычно не вводят, так как инфекционные осложнения редки.
3. Соблюдайте восстановление для 1-2 ч до возвращения животного обратно в животное объекта. Осмотрите животное 2x-3x день для первых 24 h, последуйте за ежедневным осмотром. Обратите внимание на признаки боли и бедствия, перорального приема, и мочи.
4. Снимите швы через 7 – 10 дней после операции.

Результаты

Мы провели синхронный (n = 5) и аллогенной трансплантации почки (n = 5). Животные с синогенной трансплантацией достигли долгосрочного выживания без иммунодепрессивных препаратов. Животные, которые получили аллогенной трансплантации без иммуноподавления отклонил их транспланта?...

Обсуждение

В этой рукописи мы подробно описываем хирургический метод ортогопичного КТ в крысах, включая все необходимое оборудование, необходимое для выполнения этой процедуры (Рисунок 5). В 1965, Фишер и ли опубликовал первый доклад о KT в крыс, который стал началом захватывающей обл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm