Transplante de rim de rato ortotópico: uma abordagem cirúrgica nova e simplificada

Resumo

O objetivo deste manuscrito e protocolo é explicar e demonstrar detalhadamente o procedimento cirúrgico do transplante renal ortotópico em ratos. Este método é simplificado para alcançar a perfusão correta do rim doador e encurtar o tempo de reperfusão usando a técnica de anastomose do manguito venoso e ureteral.

Resumo

O transplante renal oferece aumento das taxas de sobrevida e melhora da qualidade de vida para pacientes com doença renal terminal, em comparação com qualquer tipo de terapia de reposição renal. Ao longo das últimas décadas, o modelo de transplante de rim de rato tem sido utilizado para estudar os fenômenos imunológicos de rejeição e tolerância. Este modelo transformou-se uma ferramenta indispensável para testar fármacos e regimes imunomoduladores novos antes de prosseguir com os grandes estudos animais pré-clínicos caros.

Este protocolo fornece uma vista geral detalhada de como executar confiantemente a transplantação ortotópico do rim nos ratos. Este protocolo inclui três etapas distintas que aumentam a probabilidade de sucesso: perfusão do rim doador por rubor através da veia porta e o uso de um sistema de manguito para anastomose as veias renais e ureteres, diminuindo assim frio e quente tempos de isquemia. Usando esta técnica, nós alcançamos taxas de sobrevivência além de 6 meses com a creatinina sérica normal nos animais com transplantes syngeneic ou tolerantes do rim. Dependendo do objetivo do estudo, este modelo pode ser modificado por tratamentos pré ou pós-transplante para estudar a rejeição aguda, crônica, celular ou mediada por anticorpos. É um modelo animal reprodutível, confiável e econômico para estudar diferentes aspectos do transplante renal.

Introdução

Historicamente, os primeiros estudos de rejeição ao transplante foram realizados por Brent e Medawar usando transplantes de pele em roedores¹. Tornou-se logo desobstruído que a pele tem características imunológicas distintas, fazendo lhe um órgão altamente imunogênica que seja diferente na rejeição de outros órgãos contínuos vascularizado². Estudos de ratos de rejeição de transplante de órgão sólido são habitualmente limitados a transplantes de coração, fígado e rim. Embora cada um desses órgãos seja adequado para estudar rejeição, há vantagens e desvantagens para cada um deles. Os transplantes cardíacos são freqüentemente transplantados para o abdome e anastomose para a aorta e veia cava, com o coração nativo do receptor no lugar³. Isso não recria as condições clínicas, anatômicas e fisiológicas humanas. Adicionalmente, os corações são muito sensíveis à isquemia fria e têm que ser reperfundidos preferencialmente dentro de 1 h a fim poder recuperar sua função⁴. Transplantes hepáticos são geralmente considerados para ser cirurgicamente mais desafiador e sensível ao tempo para executar. Após a remoção do fígado nativo, o fígado doador tem de ser implantado e reperfundidos dentro de 30 min como os receptores não podem durar mais tempo sem um fígado funcional⁵. A artéria hepática, veia porta, e especialmente a reconstrução do ducto biliar requer habilidades cirúrgicas refinadas. Além dos desafios cirúrgicos, o fígado é conhecido por possuir Propriedades tolerogênicas e roedores e os seres humanos podem se tornar operacionalmente tolerantes^6,7,8. O rim, ao contrário dos referidos órgãos, pode ser transplantado de forma ortotópica, é conhecido por ser um órgão imunogênico com episódios de rejeição consistentes e reprodutíveis (se não imunossuprimidos), e permite tempos de isquemia fria prolongados de vários Horas. Isto faz a transplantação do rim do rato um modelo ideal para estudar a rejeição e a tolerância do allograft.

A transplantação do rim (KT) é a escolha preferida do tratamento para pacientes com doença renal da fase final. Ao longo das últimas décadas, os resultados de sobrevivência a curto prazo após a KT melhoraram dramaticamente, mas os resultados de sobrevivência a longo prazo são estagnados⁹. Os regimes imunossupressores convencionais permanecem a terapia antirejeição padrão. Entretanto, o uso crônico de terapias imunossupressoras provoca morbidade e mortalidade significativas, como nefrotoxicidade, diabetes e malignidades secundárias^10,11,12. No longo prazo, o anticorpo crônico e a rejeição celular-negociada ameaçam a sobrevivência da corrupção, com as opções terapêuticas limitadas disponíveis.

Um grande objetivo no transplante é a indução da tolerância ao transplante, a fim de obviar à necessidade de imunossupressão crônica. O modelo KT de ratos é uma ferramenta robusta para investigar o processo de rejeição imunológica e avaliar novas abordagens para a imunomodulação e tolerância ao transplante. O rato também serve como um modelo adequado para o estudo de rejeição aguda e crônica mediada por célulase anticorpos^{,13,14,15,16,17}. Este modelo cirúrgico provou ser uma ferramenta de confiança, reprodutível, e rentável para estudar vários aspectos da rejeição e da tolerância do allograft. Ele é freqüentemente usado para testar novos protocolos de indução de tolerância antes de empreender estudos caros e pesados de animais de grande porte. A realização de KT em ratos requer treinamento cirúrgico extensivo e expertise para atingir taxas de sobrevida de > 90%. Neste manuscrito e no vídeo instrucional que acompanha, nós fornecemos um esboço passo a passo para KT ortotópico no rato, como realizado com sucesso por muitos anos em nossa instituição.

Antes de iniciar qualquer procedimento, a seleção de doadores e receptores é crítica e depende da natureza do experimento. Idealmente, os doadores e os receptores devem pesar entre 220 – 260 g e ter entre 8 – 12 semanas de idade. Animais 220 g têm artérias de pequeno diâmetro, veias e ureteres, tornando a anastomose no receptor particularmente desafiador. A perda sanguínea menor pode causar o hipovolemia e conduzir à morte em animais menores. Animais mais pesados do que 260 g exibem mais gordura em torno de seus vasos, e isolamento do navio exigirá mais tempo operatório e aumentar o tempo de isquemia fria.

Protocolo

Os ratos Lewis (RT1¹) e Dark Agouti (da) (rt1a interruptor^a) foram comprados de vendedores comerciais (veja a tabela de materiais). Estas tensões inteiramente MHC-incompatíveis são usadas frequentemente para estudar a rejeição renal aguda do allograft. Todos os animais foram alojados e mantidos de acordo com as diretrizes dos institutos nacionais de saúde (NIH) em uma instalação específica sem patógenos na Universidade Johns Hopkins. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de cuidado e uso de animais institucionais.

1. procedimento de doação

1. Prepare e autoclave todos os instrumentos cirúrgicos a serem utilizados neste procedimento como um meio de esterilização e usar luvas estéreis descartáveis para prevenir complicações infecciosas.
2. Anestesizar o rato doador por inalação de isoflurano (indução a 3% – 4% e manutenção a 1% – 2%) para o resto do procedimento. Dê a todos os animais doadores e receptores a buprenorfina preemptiva por via subcutânea em 0,1 mg/kg de peso corporal para analgesia.
3. Agora, coloque o rato em uma posição supina e imobilize os membros com fita adesiva estéril.
4. Use uma tosquiadeira mecânica para remover o cabelo da área abdominal.
   1. Aplique um lubrificante ocular e use gaze estéril embebido em povidona-iodo, seguido de gaze embebido em álcool isopropílico, para esterilizar o campo cirúrgico.
   2. Antes da primeira incisão, certifique-se de que o rato está adequadamente anestesiado, verificando a ausência do reflexo de retirada da pinça do dedo do pé.
5. Usando tesouras, comece fazendo uma grande pele longitudinal do linha média e incisão do músculo do púbis da sínfise ao xiphoid, e incorpore a cavidade peritoneal.
6. Inserir dois retratores em ambos os lados da parede abdominal, a fim de expor a cavidade intra-abdominal.
7. Cubra o intestino com uma gaze estéril úmida e mude-o para o lado direito lateral do abdômen, expondo a aorta, veia cava, e rim esquerdo. Aplique 1 mL de soro fisiológico pré-aquecido com uma seringa de 1 cc para manter os intestinos e os órgãos abdominais húmidos e a uma temperatura normal.
   1. Aplique uma segunda gaze úmida para cobrir e mobilizar o estômago e baço craniano para o rim e uma pequena gaze úmida para cobrir o rim exposto (Figura 1a).
8. Use o fórceps de dissecação microsurgical para isolar e mobilizar a artéria e a veia renais esquerdas do tecido conexivo e de se. Isole a veia renal esquerda Cauterizando a veia gonadal esquerda e isole a artéria renal esquerda Cauterizando a artéria ad-renal. Em seguida, mobilizar a aorta e a veia cava superior e inferior do pedículo renal esquerdo dissecando o tecido conjuntivo com fórceps de dissecação (Figura 1B).
9. Divida e mobilize o ureter do tecido conjuntivo usando fórceps dissecante, e faça uma incisão diagonal a um comprimento de 2 cm medido a partir da pélvis renal, usando Microtesoura. Inserir um manguito de poliamida (ver tabela de materiais) a meio caminho para o ureter e fixar o manguito, colocando um nó com 8-0 sutura de seda (Figura 1C).
   Nota: é importante não remover toda a gordura e o tecido conexivo do uréter, porque fornecem a proteção de encontro à obstrução causada por adesões, e sua remoção pode causar a necrose ureteral. Preste atenção extra para preservar a embarcação de fornecimento de oxigênio para o ureter.
10. Mobilize o rim esquerdo separando-o da gordura perinephric usando o fórceps ou as Microtesouras de dissecação. Deixe a cápsula adiposa do rim anexado e use esse local para segurar o rim.
    1. Expor a veia cava inferior.
11. Administrar 200 unidades de heparina usando uma seringa com uma agulha de 27 G através da veia peniana. Pressione o local da injeção com um cotonete de algodão por pelo menos 1 minuto para evitar sangramento.
12. Identificar a veia porta (PV) e a veia cava inferior (IVC) (Figura 1D). Lave o rim injetando 50 mL de soro fisiológico frio misturado com 500 unidades de heparina na veia porta usando uma agulha de 16 G (Figura 1E). Antes de rubor, cortar a veia cava inferior no nível infra-hepática e a veia porta caudal no local de inserção da agulha para permitir que o sangue para sair da circulação. Comece a lavar o rim gradualmente inutilizando a solução salina. Observar uma mudança de cor do rim do vermelho escuro para uma cor cinzenta uniforme e pálida (Figura 1F).
13. Após a lavagem, ligadura a artéria renal e veia proximal à aorta e veia cava e coloque o rim liberado em uma placa de Petri em soro fisiológico frio no gelo. Figura 2 A representa a síntese esquemática do procedimento doador.
14. Uma vez que o rim está em soro fisiológico frio, fixar e imobilizar o punho do manguito da veia (ver a tabela de materiais) e puxe suavemente a veia renal através do manguito. Em seguida, fixar a veia renal sobre o manguito, colocando três nós usando oito-zero sutura de seda (Figura 2b).
    Nota: Preste especial atenção à orientação da veia enquanto a segura no lugar. As veias giradas causam uma obstrução do fluxo sanguíneo e levam à trombose.

2. procedimento de beneficiário

1. Repita as etapas 1.1 – 1.11 do procedimento do doador.
2. Coloque dois grampos atraumatic da microembarcação na artéria renal esquerda e veia proximal à aorta e à veia cava (Figura 3A).
3. Ligate a veia renal receptora proximal à entrada do rim. Lave a veia renal com soro fisiológico heparinizado para remover todo o sangue restante do vaso.
4. Deslize a veia renal ligado sobre a veia renal algemada previamente posicionada no rim doador e prenda-a com um 8-0 sutura de seda (Figura 3B). Manter a mesma orientação posicional ao fixar a veia renal sobre o manguito.
5. Ligate o uréter ao nível do pólo inferior do rim esquerdo. Mobilize o rim da gordura perinephric.
6. Ligate a artéria renal proximal à entrada do rim receptor. Lave-o com soro fisiológico heparinizado para remover qualquer excesso de sangue no vaso. Realizar uma anastomose de ponta a ponta da artéria renal com 8 a 10 suturas interrompidas usando uma sutura de nylon 10-0 (Figura 3C). Manobrar a artéria usando a camada adventícia.
7. Retire os grampos da embarcação para reiniciar a reperfusão do rim. Começar removendo o grampo na veia seguida do grampo na artéria (Figura 3D). Use uma compressa de algodão estéril para pressionar levemente todas as áreas de oozing em torno da região da anastomose. Alguns minutos devem ser suficientes para conseguir uma anastomose de patente.
8. Observar brevemente o rim para avaliar a perfusão adequada. Imediatamente após a reperfusão, o rim deve mudar de cor e gradualmente recuperar a sua cor vermelha escura natural após alguns minutos (Figura 3E). O peristaltismo visível do ureter e a produção de urina no local são observados às vezes.
9. Termine introduzindo a ponta exposta do punho ureteral no ureter do receptor e prenda o uréter do receptor com um 8-0 sutura de seda (Figura 2C e Figura 3F).
10. A fim de manter os ureteres doador e receptor em posição, amarrar as extremidades de cada lado do ureter uns aos outros.
11. Opcionalmente, o rim direito pode ser nefrectomized amarrando fora da artéria e da veia renais direitas com uma sutura de seda 4-0 e removendo o rim.
12. Retire todos os gazes da cavidade abdominal, devolver todos os órgãos à sua posição natural, esguicho 1 mL de soro fisiológico sobre os intestinos para mantê-los húmidos, e fechar o abdômen usando uma sutura absorvível 4-0 no músculo reto e uma sutura de seda 4-0 para fechar a pele leigos de forma interrompida.

3. cuidados pós-operatórios

1. Coloc o animal em uma gaiola limpa com acesso à água e aos alimentos do libitum do anúncio e permita a recuperação em uma almofada de aquecimento do ° c 37.
2. Injete 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea para analgesia e monitore o animal para recuperação. A administração adicional de analgésicos pode ser necessária nos próximos dias, dependendo de sinais de desconforto ou dor. Os antibióticos não são administrados rotineiramente, porque as complicações infecciosas são raras.
3. Observe a recuperação para 1 – 2 h antes de devolver o animal de volta para a instalação animal. Inspecione o animal 2x – 3x por dia durante os primeiros 24 h, seguido de uma inspecção diária. Preste atenção aos sinais de dor e angústia, ingestão oral e débito urinário.
4. Retire os pontos 7 – 10 dias após a operação.

Resultados

Foram realizados Transplantes renais singeneicos (n = 5) e alogénicos (n = 5). Os animais com uma transplantação syngeneic alcançaram a sobrevivência a longo prazo sem nenhum tratamento imunossupressores. Os animais que receberam um transplante alogênico sem imunossupressão rejeitaram seu enxerto e sucumbiu à insuficiência renal com sobrevida mediana de 8 dias (Figura 4a). A creatinina sérica média aumentou modestamente no grupo singeneico, enqua...

Discussão

Neste manuscrito, descrevemos o método cirúrgico para KT ortotópico em ratos em detalhes, incluindo todos os equipamentos necessários para a realização desse procedimento (Figura 5). Em 1965, Fisher e Lee publicaram o primeiro relato de KT em ratos, que se tornou o início de um excitante campo investigativo¹⁸. Desde então, muitas modificações foram introduzidas para melhorar a reprodutibilidade deste modelo. Serviu como um modelo animal eficaz para estudar f...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm