Trasplante de riñón de rata ortotópica: un enfoque quirúrgico novedoso y simplificado

Resumen

El propósito de este manuscrito y el protocolo es explicar y demostrar en detalle el procedimiento quirúrgico de trasplante ortotópico de riñón en ratas. Este método se simplifica para lograr la correcta perfusión del riñón del donante y acortar el tiempo de reperfusión mediante el uso de la técnica de anastomosis del manguito venoso y ureteral.

Resumen

El trasplante de riñón ofrece mayores tasas de supervivencia y una mejor calidad de vida para los pacientes con enfermedad renal terminal, en comparación con cualquier tipo de terapia de reemplazo renal. En las últimas décadas, el modelo de trasplante de riñón de rata se ha utilizado para estudiar los fenómenos inmunológicos de rechazo y tolerancia. Este modelo se ha convertido en una herramienta indispensable para probar nuevos fármacos inmunomoduladores y regímenes antes de proceder con costosos estudios preclínicos de animales grandes.

Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo realizar de forma fiable el trasplante de riñón ortotópico en ratas. Este protocolo incluye tres pasos distintivos que aumentan la probabilidad de éxito: la perfusión del riñón del donante mediante el lavado a través de la vena porta y el uso de un sistema de manguito para anastomozar las venas renales y los uréteres, disminuyendo así el frío y el calor tiempos de isquemia. Usando esta técnica, hemos logrado tasas de supervivencia más allá de 6 meses con creatinina sérica normal en animales con trasplantes de riñón singénicos o tolerantes. Según el objetivo del estudio, este modelo puede modificarse mediante tratamientos previos o posteriores al trasplante para estudiar el rechazo agudo, crónico, celular o mediado por anticuerpos. Es un modelo animal reproducible, fiable y rentable para estudiar diferentes aspectos del trasplante de riñón.

Introducción

Históricamente, los primeros estudios de rechazo de trasplantes fueron realizados por Brent y Medawar usando trasplantes de piel en roedores¹. Pronto se hizo evidente que la piel tiene rasgos inmunológicos distintos, por lo que es un órgano altamente inmunogénico que es diferente en el rechazo de otros órganos sólidos vascularizados². Los estudios de rata sobre el rechazo del trasplante de órganos sólidos se limitan habitualmente a los trasplantes de corazón, hígado y riñón. Aunque cada uno de estos órganos es adecuado para estudiar el rechazo, hay ventajas y desventajas para cada uno de ellos. Los trasplantes de corazón a menudo se trasplantan en el abdomen y se anastomizadas a la aorta y la vena cava, con el corazón nativo del receptor en el lugar³. Esto no recrea las condiciones clínicas, anatómicas y fisiológicas humanas. Además, los corazones son muy sensibles a la isquemia fría y tienen que ser reperfusionados preferentemente dentro de 1 h con el fin de poder recuperar su función⁴. Los trasplantes de hígado se consideran generalmente para ser quirúrgicamente más desafiantes y sensibles al tiempo para realizar. Después de extirpar el hígado nativo, el hígado del donante tiene que ser implantado y reperfusionado dentro de 30 minutos, ya que los receptores no pueden durar más tiempo sin un funcionamiento del hígado⁵. La arteria hepática, la vena porta, y especialmente la reconstrucción del conducto biliar requiere habilidades quirúrgicas refinadas. Además de los desafíos quirúrgicos, el hígado es conocido por poseer propiedades tolerogénicas y los roedores y los seres humanos pueden llegar a ser operativamente tolerantes^6,7,8. El riñón, a diferencia de los órganos antes mencionados, puede ser trasplantado de forma ortotópica, se sabe que es un órgano inmunogénico con episodios de rechazo consistentes y reproducibles (si no inmunosuprimidos), y permite la isquemia prolongada en frío de varios Horas. Esto hace que el trasplante de riñón de rata sea un modelo ideal para estudiar el rechazo de aloinjertos y la tolerancia.

El trasplante de riñón (KT) es la elección preferida de tratamiento para pacientes con enfermedad renal terminal. En las últimas décadas, los resultados de supervivencia a corto plazo después de KT han mejorado drásticamente, pero los resultados de supervivencia a largo plazo están estancado⁹. Los regímenes inmunosupresores convencionales siguen siendo la terapia antirechazo estándar. Sin embargo, el uso crónico de terapias inmunosupresoras provoca una morbilidad y mortalidad significativas, como nefrotoxicidad, diabetes y tumores malignos secundarios^10,11,12. A largo plazo, el rechazo crónico de anticuerpos y mediado por celulares amenaza la supervivencia del injerto, con opciones terapéuticas limitadas disponibles.

Un objetivo importante en el trasplante es la inducción de la tolerancia al trasplante con el fin de obviar la necesidad de inmunosupresión crónica. El modelo KT de rata es una herramienta robusta para investigar el proceso de rechazo inmunológico y evaluar nuevos enfoques para la inmunomodulación y la tolerancia al trasplante. La rata también sirve como un modelo adecuado para estudiar el rechazo agudo y crónico mediado por células y anticuerpos^{13,14,15,16,17}. Este modelo quirúrgico ha demostrado ser una herramienta fiable, reproducible y rentable para estudiar diversos aspectos del rechazo y la tolerancia a los aloinjertos. A menudo se utiliza para probar nuevos protocolos inductores de tolerancia antes de emprender estudios costosos y engorrosos de animales grandes. La realización de KT en ratas requiere una amplia formación quirúrgica y experiencia para alcanzar tasas de supervivencia de > 90%. En este manuscrito y en el video instructivo que acompaña, proporcionamos un esquema paso a paso para el ortotópico KT en la rata, como se realizó con éxito durante muchos años en nuestra institución.

Antes de iniciar cualquier procedimiento, la selección de donantes y receptores es fundamental y depende de la naturaleza del experimento. Idealmente, los donantes y los beneficiarios deben pesar entre 220 – 260 g y tener entre 8 – 12 semanas de edad. Los animales de menos de 220 g tienen arterias, venas y uréteres de diámetro pequeño, lo que hace que la anastomosis en el recipiente sea particularmente desafiante. La pérdida de sangre leve puede causar hipovolemia y provocar la muerte en animales más pequeños. Los animales más pesados que 260 g muestran más grasa alrededor de sus vasos, y el aislamiento del recipiente requerirá más tiempo operativo y aumentar el tiempo de isquemia fría.

Protocolo

Lewis (RT1¹) y Dark Agouti (da) (RT1A^a) las ratas fueron compradas a vendedores comerciales (ver la tabla de materiales). Estas cepas totalmente no coincidentes de MHC se utilizan a menudo para estudiar el rechazo agudo de aloinjerto renal. Todos los animales fueron alojados y mantenidos de acuerdo con las pautas de los institutos nacionales de salud (NIH) en una instalación específica libre de patógenos en la Universidad Johns Hopkins. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales.

1. procedimiento de donante

1. Prepare y esterilice todos los instrumentos quirúrgicos que se utilizarán en este procedimiento como medio de esterilización y utilice guantes estériles desechables para prevenir complicaciones infecciosas.
2. Anestesiar la rata donante por inhalación de isoflurano (inducción al 3% – 4% y mantenimiento al 1% – 2%) para el resto del procedimiento. Dar a todos los animales donantes y receptores la buprenorfina preventiva por vía subcutánea a 0,1 mg/kg de peso corporal para la analgesia.
3. Ahora, coloque la rata en posición supina e inmovilizar las extremidades con cinta adhesiva estéril.
4. Utilice una cortadora mecánica para eliminar el vello de la zona abdominal.
   1. Aplicar un lubricante para los ojos y utilizar gasa estéril empapado en povidona-yodo, seguido de gasa empapada en alcohol isopropílico, para esterilizar el campo quirúrgico.
   2. Antes de la primera incisión, asegúrese de que la rata esté adecuadamente anestesiada comprobando la ausencia del reflejo de retirada de pellizco del dedo del pie.
5. Usando las tijeras, comience haciendo una gran piel longitudinal de la línea media y la incisión muscular de la sínfisis pubis al xiphoid, y entrar en la cavidad peritoneal.
6. Inserte dos retractores a cada lado de la pared abdominal para exponer la cavidad intra abdominal.
7. Cubra el intestino con una gasa húmeda estéril y cambie a la parte lateral derecha del abdomen, exponiendo la aorta, la vena cava y el riñón izquierdo. Aplicar 1 mL de solución salina precalentada con una jeringa de 1 CC para mantener los intestinos y los órganos abdominales húmedos y a una temperatura normal.
   1. Aplicar una segunda gasa húmeda para cubrir y movilizar el estómago y el bazo craneal al riñón y una pequeña gasa húmeda para cubrir el riñón expuesto (figura 1a).
8. Utilice fórceps de disección microquirúrgica para aislar y movilizar la arteria renal izquierda y la vena del tejido conjuntivo y entre sí. Aísla la vena renal izquierda cauterizando la vena gonadal izquierda y aísla la arteria renal izquierda cauterizando la arteria suprarrenal. Después de eso, movilizar la aorta y la vena cava superior e inferior del pedículo renal izquierdo Diseccionando el tejido conjuntivo con fórceps diseccionante (figura 1B).
9. Divida y movilice el uréter del tejido conectivo usando fórceps Diseccionando, y haga una incisión diagonal a una longitud de 2 cm medida desde la pelvis renal, utilizando microtijeras. Inserte un manguito de poliamida (ver tabla de materiales) a mitad de camino en el uréter y asegure el manguito colocando un nudo con 8-0 sutura de seda (figura 1C).
   Nota: es importante no eliminar toda la grasa y el tejido conjuntivo del uréter, ya que proporcionan protección contra la obstrucción causada por adherencias, y su extirpación puede causar necrosis ureteral. Preste especial atención a preservar el recipiente que suministra oxígeno al uréter.
10. Moviliza el riñón izquierdo separándolo de la grasa perinédrica usando fórceps Diseccionando o microtijeras. Deje la cápsula adiposa del riñón unida y use ese sitio para manipular el riñón.
    1. Exponer la vena cava inferior.
11. Administrar 200 unidades de heparina usando una jeringa con una aguja de 27 G a través de la vena del pene. Presionar el sitio de inyección con un hisopo de algodón durante al menos 1 minuto para prevenir el sangrado.
12. Identificar la vena porta (PV) y la vena cava inferior (IVC) (figura 1D). Enjuague el riñón inyectando 50 mL de solución salina fría mezclada con 500 unidades de heparina en la vena porta utilizando una aguja de 16 G (figura 1E). Antes de enjuagar, corte la vena cava inferior a nivel infrahepático y la vena porta caudal en el sitio de inserción de la aguja para permitir que la sangre salga de la circulación. Empiece a enjuagar el riñón gradualmente infunde la solución salina. Observar un cambio de color del riñón de rojo oscuro a un gris uniforme y color pálido (figura 1F).
13. Después del lavado, ligar la arteria renal y la vena proximal a la aorta y la vena cava y coloca el riñón enrojecido en una placa de Petri en solución salina fría sobre hielo. Figura 2 A representa la visión esquemática del procedimiento de donante.
14. Una vez que el riñón está en solución salina fría, fije e inmovilizar el mango del manguito de la vena (ver la tabla de materiales) y tire suavemente de la vena renal a través del manguito. A continuación, fije la vena renal sobre el manguito colocando tres nudos usando sutura de seda de ocho ceros (figura 2B).
    Nota: Preste especial atención a la orientación de la vena mientras la protege en su lugar. Las venas rotadas causan una obstrucción del flujo sanguíneo y conducen a la trombosis.

2. procedimiento del receptor

1. Repita los pasos 1.1 – 1.11 del procedimiento del donante.
2. Colocar dos abrazaderas de microrecipiente atraumática en la arteria renal izquierda y la vena proximal a la aorta y la vena cava (figura 3A).
3. Ligar la vena renal del receptor proximal a la entrada del riñón. Enjuague la vena renal con solución salina heparinizada para extraer toda la sangre restante del recipiente.
4. Deslice la vena renal ligada sobre la vena renal con manguito colocada previamente en el riñón del donante y fíjla con un 8-0 sutura de seda (figura 3B). Mantenga la misma orientación posicional al fijar la vena renal sobre el manguito.
5. Ligate el uréter a nivel del polo inferior del riñón izquierdo. Movilizar el riñón de la grasa perinédrica.
6. Ligate la arteria renal proximal a la entrada del riñón receptor. Lávelos con solución salina heparinizada para eliminar el exceso de sangre en el recipiente. Realizar una anastomosis de extremo a extremo de la arteria renal con 8 a 10 suturas interrumpidas utilizando una sutura de nylon 10-0 (figura 3C). Maniobra la arteria usando la capa adventicial.
7. Retire las abrazaderas del recipiente para reiniciar la reperfusión del riñón. Empiece quitando la abrazadera en la vena seguida de la abrazadera en la arteria (figura 3D). Utilice un bastoncillo de algodón estéril para presionar ligeramente las áreas de supreación alrededor de la región de anastomosis. Unos minutos deberían ser suficientes para lograr una anastomosis de patente.
8. Observe brevemente el riñón para evaluar la perfusión adecuada. Inmediatamente después de la reperfusión, el riñón debe cambiar de color y recuperar gradualmente su color rojo oscuro natural después de unos minutos (figura 3E). A veces se observan peristalsis visible del uréter y de la producción de orina in situ.
9. Termine insertando la punta expuesta del manguito ureteral en el uréter receptor y asegure el uréter receptor con un 8-0 sutura de seda (figura 2C y figura 3F).
10. Con el fin de mantener los uréteres donantes y receptores en posición, atar los extremos de cada lado del uréter entre sí.
11. Opcionalmente, el riñón derecho puede ser nefrectomizado atando la arteria y la vena renal derecha con una sutura de seda 4-0 y quitando el riñón.
12. Remover todas las gasas de la cavidad abdominal, devolver todos los órganos a su posición natural, chorro 1 ml de solución salina sobre los intestinos para mantenerlos húmedos, y cerrar el abdomen mediante el uso de una sutura absorbible 4-0 en el músculo del recto y una sutura de seda 4-0 para cerrar la piel yacía ER de manera interrumpida.

3. la atención postoperatoria

1. Coloque el animal en una jaula limpia con acceso a agua y alimentos ad libitum y permita la recuperación en una almohadilla térmica de 37 ° c.
2. Inyectar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea para la analgesia y vigilar al animal para su recuperación. La administración de analgésicos adicionales puede ser necesaria en los próximos días, dependiendo de los signos de malestar o dolor. Los antibióticos no se administran rutinariamente, ya que las complicaciones infecciosas son raras.
3. Observar la recuperación durante 1 – 2 h antes de devolver el animal a la instalación animal. Inspeccione el animal 2x – 3x al día durante las primeras 24 h, seguido de una inspección diaria. Preste atención a los signos de dolor y angustia, la ingesta oral y la producción urinaria.
4. Retire los puntos 7 – 10 días después de la operación.

Resultados

Realizamos trasplantes de riñón singénicos (n = 5) y alogénicos (n = 5). Los animales con un trasplante singénico lograron una supervivencia a largo plazo sin ningún tratamiento inmunosupresor. Los animales que recibieron un trasplante alogénico sin inmunosupresión rechazaron su injerto y sucumbió a la insuficiencia renal con una mediana de supervivencia de 8 días (figura 4a). La creatinina sérica media aumentó modestamente en el grupo singénic...

Discusión

En este manuscrito, describimos el método quirúrgico para el ortotópico KT en ratas en detalle, incluyendo todo el equipo necesario para llevar a cabo este procedimiento (figura 5). En 1965, Fisher y Lee publicaron el primer informe sobre KT en ratas, que se convirtió en el inicio de un emocionante campo de investigación¹⁸. Desde entonces, se han introducido muchas modificaciones para mejorar la reproducibilidad de este modelo. Ha servido como un modelo animal ef...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm